靈武長(zhǎng)棗干腐病病原菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

馬喬女 賈慧 顧欣 趙巖 王新譜

摘 要 為明確靈武長(zhǎng)棗干腐病病原菌的種類(lèi)及其生物學(xué)特性，通過(guò)對(duì)靈武長(zhǎng)棗干腐病發(fā)病枝條采樣，采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離，柯赫氏法則驗(yàn)證和形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明：分離獲得3株疑似病原菌，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證確定GF1菌株為靈武長(zhǎng)棗干腐病病原菌。依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定GF1菌株為木賊鐮孢菌（Fusarium equiseti）。GF1菌株菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25～30? ℃，最適pH為6；孢子萌發(fā)的最適溫度為28? ℃，最適pH為7；光照條件有利于孢子萌發(fā)；孢子致死條件為55? ℃/20 min和60? ℃/ ?10 min及以上處理。

關(guān)鍵詞 靈武長(zhǎng)棗；干腐病；病原菌；木賊鐮孢菌

靈武長(zhǎng)棗（Ziziphus jujuba Mill. cv. Lingwuchangzao）是寧夏特色經(jīng)濟(jì)林優(yōu)良品種，原產(chǎn)地為寧夏靈武市。靈武長(zhǎng)棗果實(shí)大、汁液多、質(zhì)地酥脆，可食率達(dá)94%［1］，具有顯著的生態(tài)、社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。該產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富的主要途徑之一。

近年來(lái)，靈武長(zhǎng)棗的設(shè)施栽培技術(shù)快速發(fā)展，但管理不當(dāng)常引起果樹(shù)病害。其中，靈武長(zhǎng)棗干腐病已在靈武市多處設(shè)施溫棚中出現(xiàn)。寧夏大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與植物保護(hù)團(tuán)隊(duì)觀察發(fā)現(xiàn)，該病害多發(fā)于樹(shù)勢(shì)較弱的果樹(shù)，在枝干基部、接近嫁接口的部位最先發(fā)病。發(fā)病初期，枝條皮孔明顯增大并向外突起，表皮變得粗糙，枝干上呈現(xiàn)淡紫色病斑，并逐漸沿枝干縱向擴(kuò)展，直至整枝干枯。病斑處稍凹陷，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)龜裂。病部與健部之間存在明顯的界線(xiàn)。發(fā)病后期，病斑變?yōu)楹诤稚?，且表面密生黑色小點(diǎn)。干腐病病情較嚴(yán)重的樹(shù)木，其木質(zhì)部發(fā)生離層，皮層內(nèi)側(cè)呈褐色。因?yàn)椴〔堪l(fā)生腐爛干縮，疏導(dǎo)組織阻斷，使地上部分呈現(xiàn)病態(tài)，如樹(shù)勢(shì)衰弱，樹(shù)木無(wú)法正常萌發(fā)，不能正常開(kāi)花坐果，葉片黃化、果實(shí)萎蔫且提早脫落。當(dāng)病害嚴(yán)重時(shí)，會(huì)形成環(huán)繞樹(shù)干莖部的病斑，疏導(dǎo)組織完全破壞，導(dǎo)致全樹(shù)枯死。該病害已嚴(yán)重影響靈武長(zhǎng)棗果樹(shù)的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。

目前，棗樹(shù)干腐病研究?jī)H見(jiàn)山西棗樹(shù)干腐病的相關(guān)報(bào)道［2-3］。山西省棗樹(shù)干腐病的病原菌為殼梭孢屬的七葉樹(shù)殼梭孢菌（Fusicoccum aesculi）［2］，其在發(fā)病后期，病斑為淺灰色，表皮皮孔無(wú)異常。在靈武長(zhǎng)棗干腐病的發(fā)病后期，病斑呈灰黑色，表面密生黑色小點(diǎn)，皮孔突起。研究表明，病害的發(fā)生與作物品種特性、地域氣候和栽培管理方式等有關(guān)，不同品種的棗樹(shù)對(duì)同種病原菌的易感性具有差異，不同病原菌也可能導(dǎo)致植株表現(xiàn)出相似的病狀［4-6］。因此，有必要明確靈武長(zhǎng)棗干腐病的致病菌。目前，對(duì)該病害采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，主要有世高、凱潤(rùn)和多菌靈等藥［7］。馮慧靜等［8］通過(guò)ISSR（inter- simple sequence repeat）技術(shù)對(duì)棗干腐病病原菌的群體組成進(jìn)行研究，結(jié)果表明該群體具有豐富的遺傳多樣性，群體內(nèi)多樣性大于群體間多樣性。這不僅有利于棗樹(shù)抗性育種工作的順利開(kāi)展，同時(shí)也可以為更深入地了解病害發(fā)生規(guī)律和制定高效的病害防治策略奠定基礎(chǔ)。

本研究擬對(duì)靈武長(zhǎng)棗干腐病的病原菌進(jìn)行分離與純化，經(jīng)柯赫氏法則確定致病菌，繼而采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，并探明其基本生物學(xué)特性，為靈武長(zhǎng)棗干腐病的科學(xué)防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 靈武長(zhǎng)棗干腐病發(fā)病枝條和健康枝條均采集于靈武市棗園設(shè)施溫棚（東經(jīng) 106°34′14″，北緯 38°127′34″，海拔高度1 113 m）。2021年3月，從具有干腐病病征（發(fā)病后期）的棗樹(shù)上采集發(fā)病枝條樣本20份，同時(shí)于未發(fā)病溫棚采集健康枝條20份。用無(wú)菌密封袋密封，盡快帶回試驗(yàn)室開(kāi)展病原菌的分離。

1.1.2 主要儀器和供試培養(yǎng)基 LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），RQX-250智能人工氣候箱（浙江托普儀器有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州潤(rùn)華電器有限公司），HeMa9600基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA），用于菌株的分離、純化、活化、保存及生物學(xué)特性研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 疑似病原菌的分離純化 將發(fā)病枝條先用無(wú)菌水沖洗3～4次，再用體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭1～2次，使用無(wú)菌刀片將發(fā)病組織切成小塊（0.5 cm×0.5 cm），在體積分?jǐn)?shù)3%次氯酸鈉溶液中浸泡3～5 min進(jìn)行消毒，取出后再用無(wú)菌水沖洗3～5次。將處理好的病枝組織置于PDA平板中央，28? ℃，相對(duì)濕度（relative humidity，RH）85%，黑暗條件下培養(yǎng)5 d。用無(wú)菌接種針挑取菌落邊緣的菌絲，轉(zhuǎn)接至新PDA平板，如此進(jìn)行 ?3～5次純化培養(yǎng)，獲得分離菌株的純培養(yǎng)物。菌株活化條件為PDA培養(yǎng)基，28? ℃，RH 85%，光照培養(yǎng)。將活化培養(yǎng)5 d的菌株置于4? ℃保存。

1.2.2 孢子懸液的制備 按“1.2.1”方法活化疑似病原菌，于28? ℃，RH 85%，光照條件下培養(yǎng) ?7 d，待菌落產(chǎn)生大量孢子。先用無(wú)菌接種針刮掉平板中的菌絲，再用少量無(wú)菌水沖洗平板3 次，收集沖洗液并補(bǔ)加無(wú)菌水至總體積為100 mL。室溫條件下充分振蕩（190 r·min-1，80 min）使孢子團(tuán)分散，經(jīng)8層無(wú)菌紗布過(guò)濾，用血球計(jì)數(shù)板確定孢子濃度，制備1×106 CFU·mL-1的孢子懸液。

1.2.3 致病性測(cè)定 依據(jù)柯赫法則，將疑似病原菌回接至健康枝條培養(yǎng)觀察并與田間發(fā)病癥狀比較，再?gòu)木哂械湫桶l(fā)病癥狀的枝條病變部位分離菌株，分離菌株的方法同“1.2.1”，以確定致病菌株。分別采用實(shí)驗(yàn)室離體接種和田間活體接種兩種方法對(duì)疑似病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。

離體接種試驗(yàn)：選取新鮮健康、3 a～5 a生、生長(zhǎng)狀況相似的枝條，用無(wú)菌剪刀剪取12～ ?15 cm表皮光滑無(wú)傷的枝條，先用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇擦拭2～3次，無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙將表面水分吸干。將直徑5 mm圓形濾紙片進(jìn)行高溫滅菌。每張濾紙片上滴加孢子懸液0.05 mL制成帶菌濾紙片。枝條打孔接種處理。用無(wú)菌打孔器（直徑5 mm）在枝條上打孔，打孔的深度到木質(zhì)部。將帶菌濾紙片接種孢子的一面粘貼在枝條接種區(qū)上。在500 mL錐形瓶底部鋪一層濾紙，下置脫脂棉經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理。將無(wú)菌水注入脫脂棉，達(dá)到飽和狀態(tài)；濾紙全部濕潤(rùn)，用于保持環(huán)境濕度。將接種后的枝條縱向置于錐形瓶?jī)?nèi)，提前用石蠟對(duì)枝條兩頭密封，可避免枝條與水直接接觸而造成局部濕度過(guò)大，用透氣封口膜扎緊燒杯口。以等量無(wú)菌水代替孢子懸液作對(duì)照。每處理10個(gè)重復(fù)。將試驗(yàn)裝置置于28? ℃，RH 85%的恒溫光照培養(yǎng)箱，12 L/12 D（12 h? light/ ?12 h? darkness）培養(yǎng)14 d，觀察枝條的發(fā)病情況。

田間活體接種試驗(yàn)：6-7月份，在田間選用健康的3 a～5 a生、生長(zhǎng)狀況相似的枝條，在枝條上選取20 cm的一段，先后用酒精擦洗2～3次，用無(wú)菌水沖洗2～3次。接種區(qū)打孔及接種方式同離體接種試驗(yàn)。接種后用保鮮膜包好接種區(qū)，防止雜菌的影響。以等量無(wú)菌水代替孢子懸液作對(duì)照。每個(gè)處理10個(gè)枝條，接種后第14 天觀察、統(tǒng)計(jì)接種棗樹(shù)枝條的發(fā)病情況。

依據(jù)離體接種試驗(yàn)和田間接種試驗(yàn)的結(jié)果，以枝條發(fā)病情況與棗干腐病病狀相同的菌株為高度疑似病原菌，繼而采用“1.2.1”的方法對(duì)回接發(fā)病的病枝進(jìn)行病原菌的分離、純化，通過(guò)與原接種的菌株比較，確定病原菌菌株。

1.2.4 病原菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：活化純培養(yǎng)菌株，條件同“1.2.1”。用平板培養(yǎng)法測(cè)定病原菌菌落的生長(zhǎng)速度，以及菌落形態(tài)特征的觀察。采用普通光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、分生孢子、分生孢子堆等形態(tài)特征并對(duì)其進(jìn)行測(cè)量。依據(jù)《菌物字典》［9］和《中國(guó)真菌志》［10］對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

分子鑒定：將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在28? ℃，RH 85%，光照條件下培養(yǎng)5 d收集菌絲體。將菌絲體溶解于50 mmol·L-1 NaOH溶液中，沸水浴15 min，恢復(fù)至室溫，提取病原菌DNA。采用通用引物ITS引物，擴(kuò)增體系有2 ×TsingKE Master Mix 25 μL，F(xiàn)orward primer（10? μmol·L-1）1.0 μL，Reverse Primer（10?? ?μmol·L-1）1.0 μL和dH2O 22 μL，反應(yīng)程序?yàn)?4? ℃ 10 min；94? ℃ 30 s，55? ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取2? μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%）電泳。經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物純化，收集DNA，送至廣州賽哲生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序［11-13］。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)和同源性分析，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)的影響 利用無(wú)菌打孔器（直徑5 mm）在培養(yǎng) ?7 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種至PDA平板中央，將平板分別置于15、20、25、30、35、40? ℃的恒溫箱中保濕（RH 85%）光照培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。記錄菌落生長(zhǎng)情況，以菌絲生長(zhǎng)最快的培養(yǎng)溫度為基準(zhǔn)，選取臨近溫度再次培養(yǎng)病原菌，根據(jù)菌絲的生長(zhǎng)速度變化，最終確定菌絲的最適生長(zhǎng)溫度范圍。采用凹玻片培養(yǎng)法，在無(wú)菌凹玻片中注入0.01 mL病原菌孢子懸液，采用15、20、25、30、35、40? ℃的條件培養(yǎng)24、48 h后依次進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)。每個(gè)凹玻片統(tǒng)計(jì)200個(gè)孢子中萌發(fā)的孢子數(shù)量。每處理3重復(fù)。孢子萌發(fā)率計(jì)算公式如下：

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/200×100%

1.2.6 培養(yǎng)基pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)的影響 制備pH分別為4、5、6、7、8的PDA平板，按“1.2.4”方法接種病原菌菌餅并培養(yǎng)7 d，記錄菌落生長(zhǎng)情況。分別用1 mol·L-1的NaCl和NaOH試劑調(diào)節(jié)孢子懸液pH為4、5、6、7、8，按“1.2.4”方法進(jìn)行凹玻片培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。每處理3次重復(fù)。

1.2.7 光照時(shí)間對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)的影響 設(shè)置3種光照條件，分別為24 L（24 h? light）、12 L/12 D（12 h? light/12 h darkness）、 ?24 D （24 h darkness），其他方法同“1.2.4”，培養(yǎng) ?7 d，記錄PDA平板上菌落的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)病原菌的孢子萌發(fā)率。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.8 病原菌分生孢子致死溫度和時(shí)間的測(cè)定 在無(wú)菌試管內(nèi)加入1 mL病原菌孢子懸液，分別置于40、45、50、55、60? ℃的恒溫水浴鍋中，分別處理5、10、15、20、25、30 min后迅速水浴冷卻至室溫。取0.01 mL處理后的孢子懸液滴于凹玻片上，28? ℃，光照條件下，保濕培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析與差異顯著性檢驗(yàn)（Duncans新復(fù)極差法），Microsoft excel 2010進(jìn)行繪圖與制表，MEGA 7.0建立菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與致病性測(cè)定

分離獲得疑似病原真菌3株，分別編號(hào)為GF1、GF2、GF3。在離體接種試驗(yàn)中，接種10～14 d，接種GF1菌株的枝條全部發(fā)病，癥狀與田間自然發(fā)病癥狀（圖1-A、1-B）相似，即枝條表皮呈黑色，表面出現(xiàn)黑色小點(diǎn)，為病原菌的分生孢子堆（如圖2-C）；組織干枯，木質(zhì)部產(chǎn)生離層，木質(zhì)部和韌皮部分離，皮層內(nèi)側(cè)變褐（1-C、1-D）。GF2接種10～14 d后，接種部位出現(xiàn)磚紅色病斑，病斑邊緣有黑色的暈圈，木質(zhì)部上出現(xiàn)淺褐色水漬狀病斑，與田間自然發(fā)病癥狀不同，如圖1-E。GF3菌株接種10～14 d后，接種部位無(wú)發(fā)病現(xiàn)象，接種部位的邊緣僅出現(xiàn)黑圈，木質(zhì)部沒(méi)有發(fā)生病變，如圖1-F。對(duì)照未發(fā)病。

在田間活體接種試驗(yàn)中，接種GF1的棗樹(shù)有發(fā)病現(xiàn)象，發(fā)病率為60.00%，接種枝條的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似，至14 d 可觀察到典型病癥（1-G）。GF2、GF3在田間無(wú)明顯發(fā)病癥狀（1-H、1-I）。對(duì)接種GF1發(fā)病的枝條進(jìn)行再次進(jìn)行微生物的分離和鑒定，獲得與GF1形態(tài)特征一致的菌株。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

GF1菌株在PDA培養(yǎng)基上，28? ℃，RH 85%，光照條件下的生長(zhǎng)速度為12.86? ?mm·d-1。氣生菌絲呈棉絮狀。培養(yǎng)初期，菌落正反面均為白色；培養(yǎng)4～5 d，菌落表現(xiàn)呈黃褐色（圖2-A），背面為深棕色（圖2-B）。菌絲為光滑、透明的有隔菌絲，出現(xiàn)大孢子堆（圖2-C）。培養(yǎng)期間，未觀察到病原菌的小型分生孢子（圖2-D）。大型分生孢子呈鐮刀狀，略微向內(nèi)彎曲，兩端呈錐形，基孢有足，有3～6個(gè)隔膜，孢子大小（6.52～ ?16.50） μm×（2.42～5.39） μm。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步判斷GF1菌株為鐮孢菌屬（Fusarium sp.）真菌。

2.3 病原菌的分子鑒定

將GF1菌株的測(cè)序結(jié)果錄入NCBI，獲得Genbank編號(hào)MT348611。根據(jù)BLAST結(jié)果，構(gòu)建GFI菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3。分析可知，GF1菌株的測(cè)序結(jié)果與Fusarium equiseti（Genbank編號(hào)：MK621018、MN243680、MK370633等）序列相似性達(dá)100%，通過(guò)CABI databases（http：//www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，初步確定該菌分類(lèi)地位為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycete）、肉座菌目（Hypocreales）、叢赤殼菌科（Nectriaceae）、鐮孢菌屬（Fusarium）、木賊鐮孢菌（Fusarium equiseti）。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

由表1可知，GF1菌絲在10 ℃～35? ℃環(huán)境中均可生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃～30? ℃。培養(yǎng)3 d和5 d，25? ℃和30? ℃處理的菌落直徑顯著大于其他處理（P＜0.05）。培養(yǎng)至第7 天， ?25? ℃和30? ℃處理的菌落直徑無(wú)顯著差異 ?（P＞0.05）。低于25? ℃，菌落直徑顯著降低 ?（P＜0.05），說(shuō)明溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有顯著影響 ?（P＜0.05）。溫度對(duì)GF1的分生孢子萌發(fā)率影響較大，適宜萌發(fā)的溫度為25 ℃～30? ℃。

2.5 培養(yǎng)基pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

如表2， GF1菌株在pH為4～8的PDA培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)。在pH為6和7處理中，培養(yǎng) ?7 d的菌落直徑達(dá)90.00 mm，顯著高于其他處理（P＜0.05），說(shuō)明pH為6～7最適合菌絲生長(zhǎng)。在pH為7的PDA中培養(yǎng)48 h，GF1的孢子萌發(fā)率達(dá)96.00 %，顯著高于其他處理（P＜0.05），說(shuō)明孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基最適pH為7。

2.6 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

光照有利于GF1的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)（表3）。培養(yǎng)至第3天和第5天，24 L的菌落直徑顯著高于其他處理（P＜0.05），說(shuō)明其最有利于菌絲生長(zhǎng)。至第7天，各處理的菌落直徑無(wú)顯著差異（p＞0.05）。光照條件對(duì)GF1的孢子萌發(fā)影響較大。培養(yǎng)24 h，24 L和12 L/12 D的孢子萌發(fā)率顯著高于24 D（P＜0.05）。培養(yǎng)48 h，24 L處理的孢子萌發(fā)率為87.00 %，顯著高于其他處理（P＜0.05）。說(shuō)明，24 L的光照條件最有利于分生孢子的萌發(fā)。

2.7 病原菌分生孢子的致死溫度和時(shí)間

由表4可知，隨著溫度和高溫處理時(shí)間的增加，孢子萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)。處理15～25 min時(shí)，60? ℃處理的孢子萌發(fā)率為零，50? ℃和55? ℃處理的孢子萌發(fā)率顯著低于45? ℃和40? ℃（P＜0.05）；處理30 min時(shí)，60? ℃、55? ℃的孢子萌發(fā)率為0，50? ℃處理的孢子萌發(fā)率顯著低于45? ℃和40? ℃（P＜0.05）。因此，GF1菌株分生孢子致死溫度和時(shí)間為55? ℃/20 min和60? ℃/10 min。

3 討? 論

據(jù)報(bào)道，多種鐮孢菌可導(dǎo)致棗樹(shù)病害，如茄腐鐮孢菌（F. solani）引起棗樹(shù)枯死病、尖鐮孢菌（F. oxysporum）引起新疆棗根腐病等，以上病害的癥狀均與靈武長(zhǎng)棗干腐病有較大差異［14-16］。木賊鐮孢菌是一種常見(jiàn)的植物致病菌，可導(dǎo)致橡膠樹(shù)基腐病［17］、柑橘樹(shù)根腐病［18］、蘋(píng)果樹(shù)根系病害等［19］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，木賊鐮孢菌侵染靈武長(zhǎng)棗導(dǎo)致其形成干腐癥狀。不同的是，山西省的棗樹(shù)干腐病主要為害5 a～6 a生的駿棗、灰棗、酸棗、雞心棗和梨棗的枝條，病原菌為七葉樹(shù)殼梭孢菌［20］。靈武長(zhǎng)棗干腐病主要發(fā)病于設(shè)施溫棚栽培的、 ?3 a～5 a生的靈武長(zhǎng)棗枝條，病原菌為木賊鐮孢菌。因此，二者在致病菌和發(fā)病植物種類(lèi)、栽培環(huán)境等各方面均具有差異。有關(guān)靈武長(zhǎng)棗干腐病的發(fā)病機(jī)理及患病棗樹(shù)生理特征變化規(guī)律有待進(jìn)一步探索。

研究表明，木賊鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25? ℃，最適pH為6；24 h光照條件下菌絲生長(zhǎng)速度最快，孢子萌發(fā)率最高［20］。本研究表明，GF1菌株的菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的最適溫度范圍均為25～30? ℃；菌絲生長(zhǎng)最適pH為6～7，孢子萌發(fā)最適pH為7，均接近或呈中性；24 h光照有利于GF1的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。木賊鐮孢菌的致死溫度為60? ℃/10 min［21］。本試驗(yàn)測(cè)得孢子的致死溫度為55? ℃/20 min或60? ℃/10 min，與前人研究結(jié)果相同或相近。

在回接試驗(yàn)中，與溫室自然發(fā)病癥狀比較，離體接種的枝條發(fā)病癥狀與其吻合，而田間接種的發(fā)病癥狀與其具有差異。田間活體接種的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相比，病斑較小，顏色更深，生長(zhǎng)速度較慢，表皮皮孔并未突起，黑色小點(diǎn)數(shù)量較少。分析原因，一是溫室發(fā)病時(shí)間為3月中旬，光照周期短，光線(xiàn)經(jīng)塑料薄膜反射和折射，溫室內(nèi)的光照強(qiáng)度較弱。田間回接在6-7月，光照周期較長(zhǎng)，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，對(duì)病原菌的侵染具有不同影響；二是溫室通風(fēng)較差，屬高溫高濕環(huán)境。在試驗(yàn)室模擬溫室的溫濕條件，枝條表皮變得粗糙，皮孔變大、突起，可為孢子和菌絲提供良好的依附場(chǎng)所和侵染條件，獲得與田間典型病征相似的結(jié)果。而田間回接試驗(yàn)為6-7月，夜晚溫度較低，降雨量較少，通風(fēng)良好，溫濕度均遠(yuǎn)低于溫室。溫度和濕度的變化不僅影響真菌病原體的侵染狀況，高溫高濕還會(huì)促使果樹(shù)皮孔的增大和突起。因此，菌株的生物學(xué)特性、寄主種類(lèi)、自然環(huán)境與氣候等都會(huì)影響木賊鐮孢菌的環(huán)境適應(yīng)性及其對(duì)植物的侵染［22］。未來(lái)，綜合運(yùn)用環(huán)境調(diào)節(jié)措施和其他病害防治技術(shù)在溫室中防控靈武長(zhǎng)棗干腐病，并闡明其調(diào)控機(jī)理，將成為下一步的研究方向。

4 結(jié)? 論

本研究從靈武長(zhǎng)棗干腐病發(fā)病枝條上分離獲得病原菌，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定GF1菌株為木賊鐮孢菌。不同溫度、pH和光照條件對(duì)GF1菌株的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有不同影響。GF1的菌絲在10～ ?35? ℃均可生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適溫度均為25～30? ℃；菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適pH分別為6～7和7；24 h光照有利于菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)；分生孢子的致死溫度和時(shí)間為55? ℃/20 min和60? ℃/10 min及以上。本研究結(jié)論為溫室中靈武長(zhǎng)棗干腐病的防治研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 賈 昊，高 露，火旭堂，等. 不同樹(shù)齡靈武長(zhǎng)棗果實(shí)主要品質(zhì)指標(biāo)比較與分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，29（1）：56-65.

JIA H，GAO L，HUO X T，et al. Comparison between fruit and different tree ages in Ziziphus jujuba Mill. cv. ‘Lingwuchangzao[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2020，29（1）：56-65.

[2] 趙曉軍，周建波，趙子俊，等. 棗樹(shù)干腐病病原菌的鑒定[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2009，28（3）：332-335.

ZHAO X J，ZHOU J B，ZHAO Z J，et al. The pathogen causing stem dry rot of Ziziphus jujube [J]. Mycosystema，2009，28（3）：332-335.

[3] 趙曉軍，周建波，任 璐. 棗樹(shù)干腐病菌生物學(xué)特性研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，31（5）：434-439.

ZHAO X J，ZHOU J B，REN L. Study on biological characteristics of Fusicoccum aesculi ?[J]. Journal of Shanxi Agricultural University（Natural Science Edition），2011， ?31（5）：434-439.

[4] 冉俊祥. 印度發(fā)現(xiàn)一種新的大麗花病原菌——木賊鐮刀菌[J]. 植物檢疫，1990（1）：77.

RAN J X. Fusarium equisetum，a new pathogen of dahlia（Dahli variabilis） [J]. Plant Quarantine，1990（1）：77.

[5] LORI G A. Population of Fusarium spp. in soils from the arid regions and effect of water potential on their growth [J]. Revista Argentina de Microbiologia，1991，23（3）：130-137.

[6] GUPTA V，RAZDAN V K，JOHN D，et al. First report of leaf blight of Cyperus iria caused by Fusarium equiseti in India [J]. Plant Disease，2013，97（6）：838.

[7] 趙曉軍，周建波，王 英，等. 棗樹(shù)新病害（干腐病） 病原菌對(duì)不同類(lèi)型殺菌劑的室內(nèi)活性測(cè)定[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（1）：88-89.

ZHAO X J，ZHOU J B，WANG Y，et al. Toxicities of nine fungicides against the pathogen of dry decay disease-a new jujube disease [J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences ，2008，36（1）：88-89.

[8] 馮慧靜，文才藝，尹新明，等. 中國(guó)棗樹(shù)干腐病菌（Botryosphaeria dothidea）群體遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2017，34（8）：977-987.

FENG H J，WEN C Y，YIN X M，et al. Population genetic diversity analysis of Chinese jujube branch canker pathogens（Botryosphaeria dothidea） in China using ISSR markers [J]. Journal of Fruit Science ，2017，34（8）：977-987.

[9] KIRK P M，CANNON P F，MINTER D W，et al. Ainsworth & Bisbys Dictionary of the Fungi. 10th ed [M].Walling ford：CABI? Publishing，UK，2008.

[10] 臧 穆. 中國(guó)真菌志[M]. 北京：科學(xué)出版社，2013.

ZANG M. Chinese? Fungi [M]. Beijing：Science Press，2013.

[11] 王喜剛，楊 波，郭成瑾，等. 寧夏回族自治區(qū)馬鈴薯鐮刀菌根腐病病原菌的分離鑒定與致病性測(cè)定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020，47（3）：609-619.

WANG X G，YANG B，GUO CH J，et al. Identification and pathogenicity test of pathogens causing potato Fusarium ?root rot in Ningxia Hui Autonomous Region [J]. Acta Phytophylacica Sinica，2020，47（3）：609-619.

[12] KIM J，CHHETRI G，KIM I，et al. Methylobacterium terrae sp. nov.，a radiation-resistant bacterium isolated from gamma ray-irradiated soil [J]. Journal of Microbiology，2019，57（11）：959-966.

[13] 張曉云，任 可，李維蛟.通過(guò)ITS序列分析鑒定云南重樓內(nèi)生真菌[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，32（3）：42-47.

ZHANG X Y，REN K，LI W J. Identification ofendophytic fungi by ITS sequence analysis in Paris Polyphylla ?var. yunnanensis [J]. Acta Agriculturae Jiangxi，2020， ?32（3）：42-47.

[14] MIRZAEE M R，JAHANI M，MAHMOUDI H，et al. First report of jujube dieback caused by Fusarium solani [J]. Journal of Plant Pathology，2011，93（4）：4-75.

[15] WANG X，XIAO C，JI C，et al. Isolation and characterization of endophytic bacteria for controlling root rot disease of Chinese jujube [J]. Journal of Applied Microbiology，2021，130（3）：926-936.

[16] 楊環(huán)羽. 靈武長(zhǎng)棗炭疽病的病原菌鑒定及其綜合防治研究[D]. 銀川：寧夏大學(xué)，2019.

YANG H Y. Research on the identification of pathogen and integrated control of anthracnose on Zizphus? jujube Mill. cv. Lingwuchangzao [D]. Yinchuan：Ningxia University，2019.

[17] 秦云霞，盧基來(lái)，周慧珍，等. 橡膠樹(shù)基腐病致病菌——木賊鐮刀菌的分離及鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，7（9）：621-629.

QIN Y X，LU J L，ZHOU H ZH，et al. Isolation and identification of Fusarium equiseti causing rubber tree stem rot [J]. Journal of Agricultural Sciences，2017，7（9）：621-629.

[18] EZRARI S，LAHLALI R，RADOUANE N，et al. Characterization of Fusarium species causing dry root rot disease of citrus trees in Morocco [J]. Journal of Plant Diseases and Protection，2021，128（2）：431-447.

[19] PREZ-CORRAL D A，GARCA-GONZLEZ N Y，GALLEGOS-MORALES G，et al. Isolation of actinomycetes associated to apple trees rhizosphere antagonistic to Fusarium equiseti [J]. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas，2015，6（7）：1629-1638.

[20] 趙子俊，林忠敏，趙曉軍. 山西省棗樹(shù)主要病害及防治[J]. 中國(guó)果樹(shù)，2000（1）：48.

ZHAO Z J，LIN ZH M，ZHAO X J. The main diseases of jujube trees in Shanxi and their control [J]. China Fruit，2000（1）：48.

[21] 金社林，郭 成，魏宏玉，等. 玉米穗腐病樣品中木賊鐮孢菌的分離鑒定及生物學(xué)特性[J]. 草地學(xué)報(bào)，2014，22（1）：182-187.

JIN SH L，GUO CH，WEI H Y et al. Isolation，identification and biological characteristics of Fusarium? equiseti from maize ear rot samples [J]. Acta Agrestia Sinica，2014，22（1）：182-187.

[22] 李雪萍. 青藏高原青稞根腐類(lèi)病害及其對(duì)根際土壤微生態(tài)的影響[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

LI X P.Naked barley root rot diseases and influence on its rhizosphere microecology in Qinghai-tibet plateau，China [D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University，2017.

Isolation，Identification and Biological Characteristics of? Pathogens of Dry Rot of Lingwuchangzao Jujube

Abstract In order to determine the species and understand the biological characteristics of the pathogenic bacteria causing dry rot in Lingwuchangzao jujube，tissue isolation was used to isolate the pathogenic bacteria，and their pathogenicity was confirmed following Kochs? postulate. The causal agents were identified based on the morphological characteristics and molecular biology. The results showed that three different morphological characteristics（GF1，GF2 and GF3） were isolated and purified and strain GF1 was confirmed to be pathogenic to the dry rot of Lingwuchangzao jujube according to Kochs? postulate. GF1 was identified as Fusarium equiseti by morphological characteristics and molecular biology. Optimal conditions for hyphae growth of strain GF1 were observed at temperatures between 25 ℃ and 30 ℃，with a pH of six. Spore germination is most favorable at 28 ℃，with a pH of seve.Light conditions are conducive to spore germination; however，exposure to temperatures of 55 ℃ for 20 min? and 60 ℃ for 10 min? and beyond inhibite spore germination.

Key words Lingwuchangzao? jujube; Dry rot; Pathogen; Fusarium equise