長期繼代培養過程中楸樹愈傷組織的分化能力

董靜 段秋笛 徐艷紅 周美琪 梁宏偉

摘 要 以長期繼代培養的楸樹愈傷組織和新誘導的楸樹愈傷組織為試驗材料，利用石蠟切片比較分析它們的組織形態特征，并測定過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和淀粉酶的活性，以及可溶性蛋白與可溶性糖的含量，以探究楸樹愈傷組織長期繼代培養后分化再生困難的形成原因。組織形態學觀察分析發現，繼代培養7 a的白色顆粒狀愈傷組織細胞中淀粉粒含量豐富，分布均勻，仍為胚性愈傷組織；新誘導的淺綠色愈傷組織存在明顯的細胞分化中心，有均勻分布的淀粉粒，為早期胚性愈傷組織；新誘導的黃白色致密愈傷組織為非胚性向胚性轉化的愈傷組織，新誘導黃白色疏松愈傷組織為非胚性愈傷組織。生理生化指標測定分析發現，繼代培養7 a的楸樹胚性愈傷組織中可溶性糖和可溶性蛋白的含量均顯著高于新誘導出的3種愈傷組織，但其同工酶活性卻較低，表明在長期繼代培養的過程中，楸樹愈傷組織的生理生化代謝活性降低。由此推測生理生化代謝活性的下降可能是造成楸樹胚性愈傷組織長期繼代培養后分化再生困難的重要因素。

關鍵詞 楸樹；愈傷組織；長期繼代；組織形態學；生理生化指標

楸樹（Catalpa bungei C. A. Mey）是紫葳科（Bignoniaceae）梓樹屬（Catalpa）落葉喬木，中國特有珍貴樹種，為優質的用材樹種和名貴的園林觀賞樹種，自古素有“百木之王”的美稱［1］。由于楸樹天然分布分散，數量較少，且存在自花不孕，結實量少，種子發芽率低等原因，因此規模化發展人工林資源，已經成為楸樹開發利用的重點，而開發適宜的優良種質規模化繁殖技術是人工林資源發展的首要問題［2］。楸樹繁殖的方式主要有埋根、嫁接、扦插、組織培養等，由于埋根、嫁接與扦插的繁殖系數比較低，特別是楸樹優良無性系的繁殖材料少，難以形成規模化生產，限制了其生產應用［3］。植物組織培養是在人為控制、無菌的環境下培養離體的植物細胞、組織或器官，經脫分化、再分化等過程，獲得再生的完整植株或其他產品，可以快速實現植株的大量繁殖，是目前廣泛應用的植物無性繁殖方式［4］，且通過體胚發生途徑獲得再生植株為植物育種提供新的途徑，還可以為遺傳轉化提供理想材料，為研究植物發育提供理想模型等［5］。然而在離體培養中發現，長期繼代培養的楸樹胚性愈傷組織離體再生能力大大下降，難以分化再生。

王長蘭等［6］對楸樹體胚發生過程中的4 種同工酶進行電泳分析，結果表明酯酶（EST）、過氧化物酶（POD）在體細胞胚胎發育過程中代謝活躍，提供分化過程中大量物質能量及維持活性氧平衡。孫政等［7］對楸樹胚狀體形成過程中不同類型的胚性愈傷組織以及非胚性愈傷組織之間的生理生化分析表明，可溶性蛋白和游離脯氨酸在胚性愈傷組織中的含量都遠遠高于其非胚性愈傷組織，代謝越旺盛，胚狀體發生的潛能越大。本研究通過比較分析新誘導的愈傷組織和經多次繼代培養的胚性愈傷組織的生理生化指標和組織形態學特征，以探究長期繼代培養的楸樹愈傷組織再分化困難的生理機制。該研究對于建立穩定的楸樹組織培養再生體系具有重要意義；此外，長期穩定的體胚發生體系建立對于楸樹種質資源的保存以及可持續開發利用同樣具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

使用繼代培養7 a的楸樹胚性愈傷組織和新誘導的3類愈傷組織為供試材料。

1.2 培養基礎和培養條件

以楸樹未成熟合子胚為最佳外植體，采用 ?1/2? MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.1? ?mg·L-1為誘導培養基誘導愈傷組織，增殖培養基為1/2 MS+6-BA 1.0? ?mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1，體胚發生誘導最合適的培養基采用 ?1/2 MS+30 g·L-1 蔗糖+0.2 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA；繼代培養基采用1/2 MS+30 g·L-1 蔗糖+0.5 g·L-1活性炭。所有培養基均在121 ℃、15? min滅菌；所有材料均在培養溫度25 ℃±2 ℃，光照度2 500 lx，光照時間 ?12 h·d-1的條件下培養。

1.3 細胞學觀察

選擇上述試驗材料，采用常規石蠟切片法［8］。加入FAA溶液抽氣后固定24 h以上；再將材料進行脫水、包埋、切片以及高碘酸鉀-錫夫試劑-萘酚黃染色劑染色封片，最后使用Nikon80i顯微鏡觀察。

1.4 生理指標測定

測定方法：可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法［9］，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭G-250法測定［9］。過氧化物酶活性測定采用愈創木酚法［10］，超氧化物歧化酶活性測定采用氮藍四唑法［10］。淀粉酶活性通過利用淀粉酶對麥芽糖的分解作用來進行間接測定［11］。

數據分析：每個樣品重復測定3次，使用Excel 2021、IBM SPSS Statistics 24進行數據處理及LSD多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 楸樹愈傷組織的細胞學形態特征

組織形態學觀察分析發現，繼代培養 ?7 a的楸樹白色顆粒狀愈傷組織的細胞較小，排列緊密，細胞內淀粉粒較小，含量豐富，分布均勻，能明顯觀察到處于分裂狀態的胚性細胞中心，可見心形胚、魚雷胚、子葉胚（圖1-a～1-e），表明繼代培養

7 a的白色顆粒狀愈傷組織仍為胚性愈傷組織；新誘導的淺綠色致密愈傷組織細胞排列緊密，淀粉粒含量豐富，可見明顯的正處于活躍分裂狀態的細胞分化中心（圖1-f～1-g），表明新誘導的淺綠色致密愈傷組織已形成早期胚性愈傷組織；新誘導的黃白色致密愈傷組織細胞分布狀況不一，大部分組織中的細胞排列疏松，細胞體積較大，淀粉粒分布較少，但是部分細胞排列緊密，細胞體積較小，可見處于分裂狀態的細胞分化中心（圖1-h），表明新誘導的黃白色致密愈傷組織細胞是處于非胚性向胚性轉化的細胞；新誘導黃白色疏松愈傷組織細胞間隙大，排列疏松，未見明顯的淀粉粒分布（圖1-i）。

2.2 楸樹愈傷組織的生理生化特征

2.2.1 可溶性糖含量 各類愈傷組織中可溶性糖含量由高到依次為繼代培養7 a的白色顆粒狀胚性愈傷組織（C1）、新誘導淺綠色致密胚性愈傷組織（C2）、新誘導黃白色致密愈傷組織（C3）和新誘導黃白色疏松非胚性愈傷組織（C4）。胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織中可溶性糖含量均存在顯著性差異（圖2）。

2.2.2 可溶性蛋白含量 各類愈傷組織中可溶性蛋白含量由高到低依次為C1、C2、C4、C3，可溶性蛋白含量在C1胚性愈傷組織與其他3種愈傷組織中存在顯著性差異，而剩余的3 種愈傷組織中不存在顯著性差異;C1胚性愈傷組織中可溶性蛋白含量遠高于其他3 種愈傷組織（圖2）。

2.2.3 SOD酶活性 各類愈傷組織中SOD酶活性由高到低依次為C2、C1、C3、C4。胚性愈傷組織中SOD酶活性均高于非胚性愈傷組織，在新誘導胚性愈傷組織形成過程中，SOD酶活性是不斷增加的。C2中SOD酶活性與其他3種愈傷組織存在顯著性差異，而SOD酶活性在其他3種組織中均不存在顯著性差異（圖3）。

2.2.4 POD酶活性 各類愈傷組織中POD酶活性由高到低依次為C4、C3、C1、C2。非胚性愈傷組織中POD酶活性高于胚性愈傷組織，在新誘導胚性愈傷組織形成的過程中，POD酶活性不斷下降。C4中POD酶活性與其他3種愈傷組織存在顯著性差異，而POD酶活性在其他3種組織中均不存在顯著性差異（圖3）。

2.2.5 淀粉酶活性 各類愈傷組織中總淀粉酶活性由高到低依次為C4、C2、C1、C3。C1中α-淀粉酶活性最高，C4中β-淀粉酶活性最高。C4中總淀粉酶活性與C1、C3存在顯著性差異；4種愈傷組織中α-淀粉酶活性均無顯著性差異；β-淀粉酶活性在C4與C3中存在顯著性差異（圖4）。

3 討 論

細胞形態學觀察是判定細胞類型及生長狀態的重要手段。胚性愈傷組織形成后，表面或內部產生分裂旺盛、排列相對緊密的小細胞組成的胚性細胞團［12］，而非胚性愈傷組織的細胞大小不一致，細胞質稀，液泡較大，細胞分化能力差［13］。新誘導的3種愈傷組織中，C4中細胞體積大，間隙大，為非胚性愈傷組織；C3中存在分裂分化狀態的細胞，可能處于非胚性向胚性愈傷轉化的階段；C2中存在明顯的細胞分化中心，有均勻分布的淀粉粒，但未見形成任何發育階段的體胚，可能處于體胚形成的初始分化階段。這與香樟［14］、柑橘［15］和三葉木通［16］等木本植物相似。楸樹的各類胚性愈傷組織中，體胚的形成以細胞內起源和外起源兩種方式發生，與江榮翠［17］對滇楸的研究結果相似。進一步觀察發現，C1中體細胞胚在發育過程中未見到明顯的胚柄結構，只通過胚性細胞附著，子葉胚形成后，子葉形態較小，無明顯的胚維管組織。與花楸樹［18］和香榧［19］的體細胞發育有明顯的差異。由于某些營養物質和生長調節劑只在胚柄中產生，缺乏足夠的胚柄可能會剝奪體細胞胚胎正常莖頂端分生組織發育所需的生長因子［20］。體細胞胚胎分生區發育不良可能是導致植株再生效率低下的一個因素。

細胞內營養物質含量可作為判斷細胞生長狀況的依據，可溶性糖作為細胞的直接供能物質，促進胚性愈傷組織分化成體胚，為進一步發育提供了物質和能量基礎［17］。楸樹愈傷組織在發育過程中，可溶性糖含量是逐漸增加的，且與體胚的形成密切相關。新誘導的胚性愈傷組織脫分化形成不定芽較為普遍，但C1中細胞生長狀態良好卻幾乎不存在根和芽的分化，可溶性糖含量顯著高于C2，說明較高的可溶性糖含量抑制愈傷組織的脫分化作用；郭維明等［21］對花燭的研究也驗證了這一點。

可溶性蛋白是細胞內重要滲透調節物質，其含量的高低可作為間接判斷細胞內代謝活動強弱的指標之一，以及植物抗逆性強弱的參考指標［22］。新誘導愈傷組織形成體胚的過程中，可溶性蛋白含量先減少后增加，前期細胞中的蛋白質轉化為細胞的結構物質，后隨胚性細胞的形成，可溶性蛋白合成功能增強，含量逐漸積累。張慧君等［23］在橡膠樹體胚形成的研究中也發現可溶性蛋白含量在體胚形成過程中先下降，后上升。C1中可溶性蛋白的含量顯著高于新誘導各類的愈傷組織，說明長期繼代的愈傷組織生長狀況良好，抗逆性較強；同時其可溶性蛋白的含量變化較大，表明在植物愈傷組織長期繼代培養中細胞變異性 ?較大。

細胞生長發育的不同階段，同工酶的活性均會存在一定差異，可作為細胞生長狀態、發育階段的判斷依據［24］。楸樹誘導的愈傷組織在形成體胚的過程中，SOD酶活性在細胞快速生長過程中不斷增強，迅速清除細胞中產生、積累的氧自由基，同時細胞中POD酶活性下降，產生的氧自由基不斷減少，保護愈傷組織免受培養基中過多的氧自由基的損害。C1中SOD酶活性顯著低于C2，POD酶活性也低于C2，表明長期繼代的愈傷組織代謝較低下，細胞分化不活躍，產生的活性氧較少，與李新鳳等［25］在牡丹的組織培養過程中POD活性與褐化率存在著顯著的負相關性相一致；同時，長期繼代培養，細胞的快速生長受到抑制，對環境的抗逆性不斷增強，提高了活性氧的耐受性，保持細胞處于胚性狀態。宋彥超［26］使用不同Cu2+濃度對水稻愈傷組織處理時發現，在分化較活躍的處理組以及生長階段中，SOD酶的活性均較高。金玉佩等［27］的分析表明，楸樹胚性愈傷組織在形成體胚的過程中POD酶活性是下降的。李雙成等［28］的研究表明，當水稻的愈傷組織處于高滲的逆境下時，細胞生長受到抑制，胚性愈傷細胞更傾向于保持胚性而不是進一步分化。

淀粉酶催化淀粉水解為麥芽糖，進一步水解為葡萄糖，為細胞的生長代謝提供能量來源，與細胞正常發揮生理功能有著緊密的聯系［29］。楸樹愈傷組織形成胚性細胞的過程中，α-淀粉酶、β-淀粉酶、總淀粉酶活性均表現為先下降后上升，表明胚性細胞在形成前期，細胞中淀粉酶催化淀粉分解以提供足夠的能量，支持細胞活躍的代謝活動，形成胚性細胞后淀粉酶活性重新恢復。C1中的淀粉酶活性稍低于C2，表明長期繼代的胚性愈傷組織對淀粉的分解利用低于新誘導的胚性愈傷組織，可能與其細胞傾向于保持胚性而不是進一步分化有關；這與龔子端［30］甘薯愈傷組織的淀粉酶活性結論一致。徐春明等［31］通過對新疆雪蓮芽分化過程中的淀粉酶分析也驗證了β-淀粉酶與細胞的分化過程密切相關。

基于以上研究結果，筆者推測楸樹愈傷組織在長期繼代培養的過程中，胚性細胞長期保持使其更傾向于胚性的變異，在連續繼代中逐步積累，且不斷提高對環境的耐受性，從而使細胞中的代謝活動較新誘導的、再分化活躍的愈傷組織總體上更穩定。后期研究可從選擇誘導率較高的部位進行組織誘導培養、改善培養條件、改善培養基營養結構和激素水平等角度來提高長期繼代培養的楸樹愈傷組織再分化誘導率，從而建立更穩定的楸樹組織培養體系，為楸樹的種質資源保護、工業化大量生產利用提供理論基礎。

參考文獻 Reference：

［1］ 南 垚，鄭蓮香，周立東.楸樹的研究現狀與開發前景［J］.西北藥學雜志，2007，22（2）：90-93.

NAN Y，ZHENG? L X，ZHOU L D. Research status and development prospect of Catalpa bungei［J］.Northwest Pharmaceutical Journal，2007，22（2）：90-93.

［2］ 姜 何，董玉峰，馬玉珍，等.楸樹組織培養研究進展［J］. ?山東林業科技，2019，49（2）：106-109.

JIANG H，DONG Y F，MA Y ZH，et al. Advances in research on tissue culture of? eucalyptus［J］.Journal of Shandong Forestry Science and Technology，2019，49（2）：106-109.

［3］ 梁有旺，杜旭華，王順財，等.楸樹嫩枝扦插生根的主要影響因子分析［J］.植物資源與環境學報，2008，17（4）：46-50.

LIANG Y W，DU X H，WANG SH C，et al. Analysis of main influence factors on rooting of twig cutting of Catalpa bungei［J］.Journal of Plant Resources and Environment，2008，17（4）：46-50.

［4］ OLGV V Z，ALEXANDER A G，DMITRY S M，et al. Titanium trisulfide nanoribbons affect the downy birch and poplar×aspen hybrid in plant tissue culture via the emission of hydrogen sulfide［J］.Forests，2021，12（6）：713.

［5］ LELU-WALTER M A，TEYSSIER C，GUERIN V，et al. Vegetative propagation of larch species：somatic embryogenesis improvement towards its integration in breeding programs［M］∥PARK Y S，BONGA J M，MOON H K. Vegetative Propagation of Forest Trees. Seoul，Korea：National Institute of Forest Science，2016：551-571.

［6］ 王長蘭，張 青，魏文桃，等.楸樹體細胞胚胎發生過程中4種同工酶分析［J］.基因組學與應用生物學，2016，35（11）：3122-3127.

WANG CH L，ZHANG Q，WEI W T，et al. Analysis on four kinds of isoenzymes during somatic embryogenesis in Catalpa bungei C.A.Mey.［J］.Genomics and Applied Biology，2016，35（11）：3122-3127.

［7］ 孫 政，陳發菊，高 晗，等.楸樹胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的生理生化差異［J］.分子植物育種，2017，15（11）：4642-4646.

SUN ZH，CHEN F J，GAO H，et al. Physiological and biochemical differences between embryogenic callus and non embryonic callus of Catalpa bungei［J］.Molecular Plant Breeding，2017，15（11）：4642-4646.

［8］ 梁忠泉，袁昌隆，張寶賀.微小組織石蠟切片制作體會［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2018，27（4）：368-373.

LIANG ZH Q，YUAN CH L，ZHANG B H. Experience in making microtissue paraffin section［J］.Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2018，27（4）：368-373.

［9］ 李合生.植物生理生化實驗原理和技術［M］.北京：高等教育出版社，2000.

LI H SH. Principles and Techniques of Plant Physiological and Biochemical Experiments［M］. Beijing：Higher Education Press，2000.

［10］ 孫 群，胡景江.植物生理學研究技術［M］.陜西楊凌： ?西北農林科技大學出版社，2006.

SUN Q，HU J J. Research Technology of Plant Physiology［M］. Yangling Shaanxi：Northwest Agriculture and Forestry University Press，2006.

［11］ 李 雯，邵遠志，陳維信.淀粉酶活性測定方法的改進［J］.植物生理學通訊，2005，41（5）：655-656.

LI W，SHAO Y ZH，CHEN W X. Improved method for determining amylase activity［J］.Plant Physiology Communications，2005，41（5）：655-656.

［12］ RAGHAVAN V. Role of 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） in somatic embryogenesis on cultured zygotic embryos of Arabidopsis：cell expansion，cell cycling，and morphogenesis during continuous exposure of embryos to 2，4-D［J］.American Journal of Botany，2004，91（11）：1743-1756.

［13］ 陳敏敏，楊柳燕，楊 貞，等.‘鳳丹白成熟胚愈傷誘導、增殖及組織學觀察［J］.經濟林研究，2021，39（1）：9-16.

CHEN M M，YANG L Y，YANG ZH，et al. Callus induction，proliferation and histological observation of? Paeonia ostii cv. ‘Phoenix White mature embryo［J］.Non-wood Forest Research，2021，39（1）：9-16.

［14］ 荊茹月，霍 坤，李志輝.香樟胚性與非胚性愈傷組織間的差異研究［J］.中南林業科技大學學報，2020，40（10）：70-78.

JING? R Y，HUO K，LI ZH H. Difference between embryogenic and non-embryogenic callus of Cinnamomum camphora? L.［J］.Journal of Central South University of Forestry & Technology，2020，40（10）：70-78.

［15］ 劉華英.柑橘體細胞胚發生的細胞學及生理生化特性研究［D］.長沙：湖南農業大學，2003.

LIU H Y. Cytological，physiological and biochemical characteristics of somatic embryogenesis in Citrus［D］. Changsha：Hunan Agricultural University，2003.

［16］ 姜治國，馬 鑫，胡 勝，等.三葉木通體細胞胚胎發生及植株再生研究［J］.西南林業大學學報（自然科學），2022，42（3）：34-41.

JINAG ZH G，MA X，HU SH，et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Akebia trifoliata［J］.Journal of Southwest Forestry University（Natural Science），2022，42（3）：34-41.

［17］ 江榮翠.滇楸體細胞胚胎發生及其機理研究［D］.南京：南京林業大學，2010.

JIANG R C. Somatic embryogenesis and its mechanism in Sorbus yunnanensis［D］. Nanjing：Nanjing Forestry University，2010.

［18］ 楊 玲，沈海龍.花楸樹體細胞胚與合子胚的發生發育［J］.林業科學，2011，47（10）：63-69.

YANG L，SHEN H L. Cytological and histological investigations on somatic and zygotic embryogenesis of Sorbus pohuashanensis［J］.Scientia Silvae Sinicae，2011，47（10）：63-69.

［19］ 項偉波，趙金凱，吳家勝，等.香榧體細胞胚發生、發育的形態與細胞學觀察［J］.園藝學報，2015，42（8）：1477-1486.

XIANG W B，ZHAO J K，WU J SH，et al. Morphological and cytological observation of somatic embryogenesis and development in Torreya grandis ‘Merrilli［J］.Acta Horticulturae Sinica，2015，42（8）：1477-1486.

［20］ JAYASANKAR S，BONDADA B R，LI Z，et al. Comparative anatomy and morphology of Vitis vinifera （Vitaceae） somatic embryos from solid and liquid-culture-derived proembryo genic masses［J］.American Journal of Botany，2003，90（7）：973-979.

［21］ 郭維明，趙云鵬，文方德.花燭愈傷組織不同繼代培養的再分化差異［J］.園藝學報，2004，31（1）：69-72.

GUO W M，ZHAO Y P，WEN F D. Relative physiological and biochemical features of redifferentiation difference in three types of calli subculture in Anthurium andraeanum［J］.Acta Horticulturae Sinica，2004，31（1）：69-72.

［22］ ZHANG H，HUA Y，HUANG T，et al. Physiologic and biochemical characteristics in the development of embryogenesis of rubber tree［J］.Chinese Journal of Tropical Agriculture，2014，4（10）：12-18.

［23］ 張慧君，華玉偉，黃天帶，等.橡膠樹體胚發生過程中的生理生化特性［J］.熱帶農業科學，2014，34（10）：12-14，18.

ZHANG H J，HUA Y W，HUANG T D，et al. Physiologic and biochemical characteristics in the development of embryogenesis of rubber tree［J］.Chinese Journal of Tropical Agriculture，2014，34（10）：12-14，18.

［24］ 閻麗娜.不同類型水稻成熟胚再生體系的建立及其生理生化特性的研究［D］.南京：南京農業大學，2009.

YAN L N. Establishment of regeneration system from mature embryos of different types of rice and its physiological and biochemical characteristics［D］.Nanjing：Nanjing Forestry University，2009.

［25］ 李新鳳，鞏振輝，孫冬青，等.不同品種牡丹幾個生理參數的比較及其與組培中褐化的關系［J］.西北農業學報，2008，17（1）：142-145.

LI X F，GONG ZH H，SUN D Q，et al. The comparison of physiological indexes and the relation with browning in tissue culture about different peony species［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2008，17（1）：142-145.

［26］ 宋彥超.寒地粳稻遺傳體系優化以及分化過程中生理生化特性研究［D］.哈爾濱：東北農業大學，2012.

SONG Y CH. Study on fenetic system optimization and physiological and biochemical characteristics of Japonica rice in cold region［D］. Harbin：Northeast Agricultural? ?University，2012.

［27］ 金玉佩，劉 佳，紀若璇，等.楸樹體胚發生過程中5種酶的活性變化研究［J］.熱帶作物學報，2017，38（2）：252-257.

JIN Y P，LIU J，JI R X，et al. Analysis on activity change of enzyme during somatic embryogenesis in Catalpa bungei C.A.Mey.［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2017，38（2）：252-257.

［28］ 李雙成，王世全，尹福強，等.秈稻成熟胚愈傷組織培養影響因素研究［J］.四川農業大學學報，2004，22（4）：296-300，331.

LI SH CH，WANG SH Q，YIN?? F Q，et al. Some factors affecting mature embryos callus culture in? indica rice［J］.Journal of Sichuan Agricultural University，2004， ?22（4）：296-300，331.

［29］ XUE W，LIU N，ZHANG T，et al. Substance metabolism，IAA and CTK signaling pathways regulating the origin of embryogenic callus during dedifferentiation and redifferentiation of cucumber cotyledon nodes［J］.Scientia Horticulturae，2022，293（1）：110680.

［30］ 龔子端.PEG對甘薯愈傷組織淀粉酶的調節作用［D］. ?成都：四川大學，2004.

GONG Z D. Regulation of PEG on amylase in sweet? potato callus［D］. Chengdu：Sichuan University，2004.

［31］ 徐春明，趙 兵.新疆雪蓮芽分化過程蛋白質·可溶性糖含量及淀粉酶活性變化［J］.安徽農業科學，2009，37（3）：969-970.

XU CH M，ZHAO B. Study on the change of protein and soluble sugar contents and amylase activity of Xinjiang Saussurea involucrata during bud differentiation［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2009，37（3）：969-970.

Differentiation Ability of Catalpa bungei? Callus in Long Term Subculture

Abstract In this study，the calli of Catalpa bungei subcultured for a long time and the newly induced calli of Catalpa bungei were used as experimental materials，the differences in their histological characteristics were compared and analyzed by paraffin sections，and the differences in the activities of peroxidase （POD），superoxide dismutase （SOD） and amylase，the changes in the content of soluble protein and soluble sugar were determined，so as to explore the reasons for the formation of difficulty in differentiation of regeneration of Catalpa bungei callus after long-term subculture. The observation and analysis of histomorphology showed that the white granular callus cells subcultured for 7 years were still embryogenic callus with abundant starch grains and uniform distribution; the newly induced light green calli had obvious cell differentiation centers and uniformly distributed starch grains. They were early embryogenic calli. The newly induced yellow white compact calli were non embryogenic to embryogenic calli. The newly induced yellow white loose calli were non embryogenic calli. The determination and analysis of physiological and biochemical indexes showed that the contents of soluble sugar and soluble protein in the embryonic callus of Catalpa bungei subcultured for 7 years were significantly higher than those in the three kinds of newly induced callus，but their isozyme activities were low，indicating that the physiological and biochemical metabolic activities of Catalpa bungei callus decreased in the long-term subculture process. It is speculated that the decline of physiological and biochemical metabolic activity may be an important factor that causes the difficulty in differentiation and regeneration of embryonic callus of Catalpa bungei after long-term subculture.

Key words Catalpa bungei; Callus; Long term subculture; Histomorphology; Physiological and biochemical indexes