禽白血病抗病育種研究進展

鄭文靜，田亞東，李轉見，李東華

（河南農業大學動物科技學院，河南鄭州 450046）

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukemia virus，ALV)引起的禽類多種細胞腫瘤性免疫抑制性傳染病[1]。該病在世界范圍內均有發生和流行[2,3]，是影響養禽業發展的重要傳染病之一，屬于我國二類動物傳染病，被列入《國家動物疫病監測與流行病學調查計劃（2021—2025）》 防治計劃[4]。由于尚無有效的治療和防治方法，目前主要是通過凈化種群來進行預防[5]。在我國的地方品種中均分離出ALV 的亞群，現有的預防手段不能控制AL 的發生和流行。國外已經從研究宿主的遺傳抗性方面尋求防控策略。因此，我們可以試圖借鑒這種策略來提高AL 的凈化效率，降低AL 的傳播和流行，培育出更多抵抗AL 的品種。

1 病原學特征

禽白血病病毒屬于反轉錄病毒科，禽C 型反轉錄病毒屬[6]。ALV 屬于單股正鏈RNA 病毒，病毒的基因組順序從左往右依次為5'-U3-R-U5-gagpol-env-U3-R-U5-3'（其中ALV 的前病毒基因組結構簡圖見圖1[7]），病毒基因組中gag、pol 和env3 個結構基因的作用分別是編碼衣殼蛋白、包膜蛋白、囊膜糖蛋白，由于env 基因可以編碼出不同的囊膜糖蛋白[8]，根據囊膜糖蛋白的差異性、宿主的范圍、基因組結構等，將該病毒分為A-J、K 等11 種亞型[9]。其中A、B、C、D、E 和J 亞群主要存在于自然感染的雞群中[10]，A、B、J 亞群為外源性病毒，E、F、G、H、I 亞群為內源性病毒，E 亞群是存在于雞體內的內源性病毒。杜巖等[11]于1999 年在國內肉雞中首次檢出J 亞型，此后，在蛋雞和地方品系中也發現J 亞群的流行，對我國養禽業造成嚴重影響。此外，在我國地方品種雞群中分離和鑒定出了一個新的致病力較弱的ALV-K 亞型[12,13]。

圖1 ALV 前病毒基因組結構簡圖

2 流行病學特點

禽白血病病毒可感染各種年齡的雞，但其主要感染雞群是雛雞。在雛雞中，其感染高峰一般發生在出殼后7d，高峰期在4～5 周，而在成雞中，感染高峰一般發生在12～24 周。ALV 主要通過血液和消化道傳播，通常呈垂直傳播。經口途徑的傳播可能是通過糞便污染的飼料、飲水或接觸被污染的雞群而實現的。ALV 在不同動物中具有不同的生物學特性，對雞的危害較大。根據感染的部位不同，可將ALV 分為血源性和組織源性兩類。血源性ALV 主要見于雛雞和成年雞，可通過血液、臍帶或糞便傳播，其感染雞群數量多且常呈地方性流行。除血源性ALV 外，在雛雞中也發現組織源性ALV 病毒，其對雛雞的危害遠大于血源性ALV，以產蛋母雞感染最為常見。對于ALV 已有大量文獻進行了詳細論述，但目前針對該病的研究大多集中于病原特性、臨床癥狀等方面，而對于其流行特點研究較少。

3 禽白血病病毒檢測方法

禽白血病表現出的腫瘤癥狀與馬立克氏病等臨床癥狀存在很大的相似性，很難用肉眼來準確鑒定，常常借助實驗室的方法來進行確診，ALV檢測的方法主要有血清學檢測、p27 抗原ELISA檢測、細胞培養分離鑒定病毒和核酸檢測。

3.1 血清學檢驗

血清學檢驗通常用雙抗夾心ELISA 方法，該方法常常用于篩選外源病毒感染，具有簡單、操作方便、可用于大批量雞群檢測的特點，常常用于判定SPF 雞群有無感染，該方法的缺點是對內源性病毒無法進行篩選。

3.2 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是檢測外源性ALV 最有效的手段。該方法特異性高，可分離和保存流行病株并鑒定其亞群，對致病性進行進一步試驗。但是該方法存在技術要求高、需要特定實驗室、成本高、周期長等缺點。

3.3 核酸檢測方法

核酸檢測可用PCR/ 熒光定量PCR/ 核酸斑點分子雜交的方法。該種方法可直接檢測各種樣品中的病毒感染，具有方法簡單易學、出結果快、成本低的優點。但也存在較高比例的假陽性和較高比例的假陰性，可重復性較差。

4 禽白血病病毒凈化

禽白血病病毒是一種垂直傳播性病毒，病毒從曾祖代傳播到父母代到商品代逐代放大。雖然各國研究人員都在致力于開發禽白血病的疫苗和具有針對性的藥物，但都沒有好的進展和效果[14]。目前，預防和控制AL 的主要措施仍是對原種雞場雞群進行凈化，將感染的雞群篩除，建立無ALV感染的核心種雞群是首選的最有效的防治方法[15-17]。目前，在國內，通常采用崔治中[18]教授提出的禽白血病核心雞群的四大凈化原則。在生產中，對核心區母雞通常在4 個關鍵節點開展篩查[4]：一是檢測1d 雛雞胎糞中的p27 抗原，并對篩查出的陽性雞進行淘汰。二是采集雞（6～10 周）的血漿對病毒進行分離鑒定從而淘汰陽性雞。三是采集開產初期母雞（23～25 周）初產蛋的蛋清p27 蛋白抗原進行檢測淘汰陽性雞。四是檢測留種前種蛋蛋清p27 蛋白抗原淘汰陽性雞。此外，對于核心種公雞可采取雞的精液開展病毒分離鑒定[19]。種雞場在生產中可以根據自身的實際情況挑選上述任意一個時期開展凈化工作[20]。種禽場在開展凈化的同時，需要加強飼養管理，做好生物安全防控，避免發生因凈化不到位而引起ALV抗原和抗體突然升高的現象。

5 禽白血病受體遺傳的多樣性

隨著ALV 病毒的不斷變異，出現了越來越多的ALV 亞型，嚴重影響養禽業的發展。各種不同的亞型病毒因為env 蛋白出現差異從而出現不同的宿主蛋白。tva 是A 和K 亞型的蛋白受體，tvb 是B、D、E 亞型的蛋白受體，tvc 是C亞型的蛋白受體，chNHE1 是J 亞型的蛋白受體。不同亞群的ALV 由不同的細胞受體進入宿主細胞，從而發生感染[21]。由于受體基因的遺傳變異從而導致受體蛋白的表達缺失或者表達為不適合病毒受體的缺陷型蛋白，進而使宿主細胞產生對某種ALV 亞型的抗性或者導致對ALV 不敏感[22]。tva 決定A 亞群病毒的易感性，tva 決定B、D、E亞群病毒的易感性，tvc 決定C 亞型病毒的易感性，chNHE1(tvj)決定著J 亞群的易感性。

5.1 tva 基因的遺傳多樣性

tva 是編碼ALV-A 亞群和ALV-K 亞群的病毒感染的tva 受體蛋白基因，決定對ALV-A 的易感性和抗感染性[23]，包含6 個抗性基因（tvar1、tvar2、tvar3、tvar4、tvar5和tvar6）和一個易感基因（tvas），抗性基因是tva 的復等位基因[24]。由于tva受體基因發生遺傳突變從而導致受體蛋白缺失或者表達一個不適合ALA-A 受體的缺陷型受體蛋白。tvar1是tva 基因的第619 位堿基（C＞G），引起對應編碼的半胱基酸（Cys）突變成色氨酸（Trp），從而降低了A 亞型囊膜糖蛋白與受體的親和力，產生對A 亞型的遺傳抗性。tvar2是由于外顯子基因C305-306位點插入4（CTCG）個堿基，導致tva 蛋白缺失，產生對A 亞型的抗性[25]。tvar3是tva 基因（C507-516）序列缺失10 個堿基（ACCCCGCCCC）；tvar4是tva 基因（C507-511）的序列缺失5 個堿基（ACCCC），tvar3和tvar4堿基的缺失干擾了mRNA 的剪接，導致內含子或終止密碼子TGA 過早出現，降低了tva 受體蛋白與病毒囊膜蛋白的親和力，從而使ALV-A 的易感性降低[26]。抗性基因的出現，為ALV-A 的防治及培育新的品種提供了指導和方向。

5.2 tvb 基因的遺傳多樣性

tvb 基因是編碼ALV-B、ALV-D 和ALV-E亞群病毒感染的tvb 蛋白受體，是引起腫瘤壞死因子受體家族[27]。tvb 的遺傳抗性基因位點有5 個（tvbs1、tvbs3、tvbr1、tvbr2和tvbT）。因為tvbs1的堿基沒有發生突變，所以對ALV-B、ALV-D、ALV-E 亞群易感；tvbs3是由于單堿基發生突變（T ＞A），產生抗E 亞群的特性，tvbr1堿基發生突變，導致氨基酸終止密碼子提前出現，受體蛋白的機構發生改變，最終產生ALV-B、D、E 抗性[28]。tvbr2是由于單堿基突變從而使半胱氨酸（Cys）突變為絲氨酸（Cas），tvb 的蛋白區域結構發生改變，產生抗E 亞群，降低對B、D 亞群的易感性[29]；tvbT存在于火雞中，對ALV-B、ALV-D 亞群具有抗性，但是對ALV-E 亞群具有易感性[30]。由于tvb 蛋白受體家族龐大，引起的AL 亞型復雜，給核心群篩選凈化帶來諸多不變。

5.3 tvc 基因的遺傳多樣性

tvc 基因是編碼ALV-C 亞型的tvc 蛋白受體，由于該蛋白基因存在于雞28 號染色體上，所以兩者存在連鎖現象。tvc 有兩種基因（tvcs、tvcr），tvcs是引起ALV-C 亞型感染的基因，由于C 亞型在臨床上感染率低，生產中很難進行測定，只有通過定位克隆進行鑒定[31]。tvcr是單堿基（C＞A）突變，從而提前終止密碼，產生抗性等位基因，最終對生ALV-C 亞型產生抗性。雖然C 亞型在群體中不常見，但我們也不能忽略對該亞型種群的篩查。

5.4 tvj 基因的遺傳多樣性

chNHE1 是編碼ALV-J 感染的受體蛋白，chNHE1 在低PH 值條件下，可以介導ALV-J 與靶細胞膜融合[32]。tvj 存在兩種等位基因，分別是tvjs和tvjr。tvjs是tvj 的易感基因體，可誘發ALV-J 亞型的易感，tvjr是外顯子W38 缺失或突變而產生的復等位基因，對ALV-J 具有抗性。J亞型在世界白羽肉雞中廣泛流行，在2005 年已實現凈化。但是，國內ALV-J 在白羽肉雞流行后，迅速傳播到蛋雞和其他地方品種中，給我國養禽業帶來嚴重危害。

6 禽白血病抗病育種的途徑

6.1 利用受體基因的遺傳抗性

由ALV 亞型的遺傳多樣性可知，在生產中可以設法選出或者利用生物標記技術標出AlV-A亞型的抗性等位基因tvar1和tvar2；AlV-B 亞型的抗性等位基因tvbs1、tvbr1和tvbr2；AlV-C 亞型的抗性等位基因tvcr；AlV-J 亞型的抗性等位基因tvjr。將標記出來的抗性等位基因個體進行純化，利用雜交的方式培育出抗性基因多的品種和品系，從而達到ALV 亞型綜合防治，提高家禽生產性能的目的。

6.2 利用半性遺傳（K）基因育種

由于慢羽雞比快羽雞對AL 敏感且更難凈化。起初因為K 基因與ALV 的一個e21基因存在緊密連鎖關系[33]，人們開始研究e21是否能引起慢羽雞的生活力下降。Bacon 等[34]經檢測發現，慢羽雞體內均攜帶ev21基因，而快羽雞體內沒有ev21基因。Smith 和Fadly[35]的研究表明，ev21可以引起雞對ALV 產生免疫耐受性，提高外源AL 的易感性。白春艷等[36]研究發現，慢羽雞比快羽雞易感AL，譚艷等[37]研究表明，快慢羽雞抗ALV-J 的天然免疫反應差異顯著性明顯，并且慢羽雞抗ALV-J 的天然免疫反應比快羽雞遲鈍且強度較弱。上述研究為我們培育抗病性能好的快慢羽雞提供了數據支撐和理論依據，有利于培育抗AL性能的品系。

7 小結

禽白血病作為垂直傳播的傳染病之一，由于亞型較多、傳播速度快，缺乏疫苗和針對性的藥物進行防治，給全球養殖業帶來了巨大的經濟損失。現實生產中可通過分子生物學手段標記出ALV 抗性基因，培育具有抗性基因的品種來防治ALV 的感染。伴性遺傳中慢羽雞與快羽雞在抗ALV-J 中的天然免疫具有明顯差異，但是慢羽雞攜帶的e21可能還在天然免疫中還扮演著其他角色，所以，對于通過羽速來培養抗ALV 感染的品種（品系）雞群，還有待進一步研究。