非編碼RNA 對牛前體脂肪細胞分化的研究進展

何瑞瑩，吳章情，昝林森，張濤平，馬偉東，楊武才*

（1.西北農林科技大學動物科技學院國家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100；2.陜西秦寶牧業股份有限公司，陜西楊凌 712100；3.陜西省良種農牧場，陜西寶雞 722200）

隨著經濟社會的發展，人民生活水平逐漸提升，高端牛肉市場迅速擴大，產品供不應求。目前，我國高端牛肉主要依賴于進口，國產高檔牛肉生產比例不足5%，高端牛肉生產是我國牛肉產業的突出弱點。脂肪作為儲存能量的重要器官，與牛肉品質密切相關，特別是肌內脂肪含量是評價牛肉等級的重要指標，而脂肪沉積在一定程度由前體脂肪細胞的增殖分化決定[1]。

前體脂肪細胞來源于骨髓中的間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）[2]，是脂肪組織的基本生物學單位，MSCs 在細胞因子、信號通路、激素、誘導因素（胰島素等）及分化因子的刺激和調控下，定向分化為前體脂肪細胞[3]。近年來，研究發現脂質沉積是通過調節前體脂肪細胞分化過程中的甘油三酯相關合成酶來實現的，越來越多的功能基因和代謝途徑被鑒定參與了前體脂肪細胞分化，如脂肪細胞中的特異性調控因子PPARγ、C/EBPα、FABP4 和SREBP-1 以及PPAR 信號通路、mTOR 通路、MAPK 通路和Wnt 通路等[4]。

非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA）是一類不編碼蛋白質的表觀遺傳學調節因子，根據核苷酸序列長短可分為短鏈非編碼RNA（Small non-coding RNA,sncRNA）和長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA），sncRNA 是長度＜200nt 的ncRNA，如微小RNA（MicroRNA，miRNA）、小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）、核小RNA（Small nuclear RNA，snRNA）等；lncRNA 是長度＞200nt 的ncRNA；另外還有一種結構特殊的ncRNA——環狀RNA（Circular RNA，circRNA）[5]。隨著分子生物學及高通量測序技術的快速發展，ncRNA 在細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程中發揮的重要調控作用被進一步揭示，已有研究發現ncRNA 在前體脂肪細胞分化過程中發揮重要功能。有研究表明，miRNA 通過靶向基因影響靶mRNA 的穩定性或翻譯過程，從而調控牛前體脂肪細胞分化；lncRNA 作為調控元件或者競爭性內源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）影響前體脂肪細胞分化；circRNA 作為ceRNA 海綿吸附miRNA，從而削弱miRNA 對靶基因的抑制作用，進而調控牛前體脂肪細胞分化[6]。

目前，對前體脂肪細胞分化機制研究主要集中在脂質合成相關通路和編碼基因的表達水平上，而關于ncRNA 調控前體脂肪細胞分化的研究較少。因此，本文主要就ncRNA 調控牛前體脂肪細胞分化相關研究進行綜述，以期為研究ncRNA 調控牛前體脂肪細胞分化的分子機制提供理論參考。

1 m iRNA 調控牛前體脂肪細胞分化

miRNA 是長度為19～25 個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，在物種之間具有強烈的功能保守性，是第1 個被鑒定和表征的非編碼RNA[7]。當miRNA 和mRNA 完全互補時，miRNA 可通過形成沉默復合體（miRNA-containing RNA induced silencing coplex，miRISC），將靶mRNA 特異降解；當miRNA 和mRNA 不完全互補，僅在某些位點結合時，那么靶mRNA 不會被特異降解，而是抑制mRNA 翻譯過程，使其不能合成蛋白質，從而發揮作用[8]。

1.1 差異miRNA 的鑒定

研究發現，不同牛品種間脂肪組織、肌肉組織及不同部位脂肪組織間存在miRNA 差異表達。Li 等[9]對新疆褐牛與哈薩克牛背最長肌進行差異分析，鑒定出346 個差異表達的miRNA；Jin 等[10]在極低和極高背膘厚牛的皮下脂肪組織中鑒定到15個顯著差異表達的miRNA，其中7 個miRNAs 在高背膘厚牛的皮下脂肪組織中高表達，8 個miRNAs 在低背膘厚牛的皮下脂肪組織中高表達；汪海洋等[11]在西門塔爾牛皮下脂肪和肌內脂肪中鑒定到88 個顯著差異表達miRNA；Zhang 等[12]在秦川閹牛和公牛肌內脂肪中鑒定到52 個差異表達miRNA，KEGG 通路富集分析表明其通過脂質代謝和脂肪細胞分化相關通路發揮作用。此外，在脂肪細胞分化不同時期，miRNA 也存在顯著的差異。Yang 等[13]選取不同分化階段的秦川牛肌內前體脂肪細胞進行轉錄組測序，鑒定到77 個與分化期差異表達miRNA；Yu 等[14]在西門塔爾牛前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞中鑒定到250 個差異表達的miRNA，其中131 個miRNA 在脂肪細胞中高表達，119 個miRNA 在前體脂肪細胞中高表達。以上結果表明，miRNA 可能在前體脂肪細胞分化過程中發揮重要調控作用。

1.2 miRNA 與脂肪分化

在轉錄組測序基礎之上，目前開展了大量的miRNA 功能研究。有研究發現，miR-130a/b、miR-149-5p、miR-224、miR-15a 等miRNA 可通過下調脂肪細胞分化相關基因的表達抑制前體脂肪細胞分化；而miR-1271、miR-378、miR-381、miR-302b 等miRNAs 通過上調脂肪細胞分化相關基因的表達促進前體脂肪細胞分化（詳見表1）。除此之外，miRNA 可靶向特定基因調控相關信號通路來發揮作用，AKT1 是位于mTOR 通路下游調節脂肪沉積的重要蛋白質。Chen 等[15]發現bta-miR-150 靶向AKT1 基因，通過miRISC 特異的降解AKT1 的mRNA 調控mTOR 通路，從而抑制秦川肉牛前體脂肪細胞分化。Zhang 等[16]發現miR-33a 可直接靶向胰島素受體底物2（IRS2），通過IRS2-Akt 途徑抑制牛前體脂肪細胞的分化。上述研究揭示了miRNA 在脂肪組織及不同分化階段脂肪細胞中的表達譜，數十個miRNAs 被證明影響脂肪細胞分化，但目前關于miRNA 與lncRNA 和circRNA 等ncRNAs 相互調控研究較少。

表1 非編碼RNA 在脂肪發育中的功能

2 lncRNA 調控牛前體脂肪細胞分化

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類從基因組轉錄而來的ncRNA，保守性較低，長度超過200nt[16,17]。lncRNAs 通常根據其相對于蛋白質編碼基因的轉錄位點進行分類，有增強子lncRNAs、啟動子lncRNAs、反義lncRNAs（從蛋白質編碼基因以反義方向轉錄）、基因間lncRNAs，以及內含子和/ 或外顯子產生的環狀lncRNAs[18]。lncRNAs 可以通過染色體重塑和變構調節參與轉錄前調控；通過啟動子或轉錄因子影響轉錄水平；通過mRNA 成熟、轉運、蛋白質合成等過程參與轉錄后調控，從而影響細胞分化、發育、免疫反應和腫瘤發生等生物學過程[19]。

2.1 差異lncRNA 的鑒定

近年來通過轉錄組測序，在不同品種、組織、年齡及脂肪細胞分化階段中鑒定了大量差異表達的lncRNAs。Liu 等[20]在山東黑牛和魯西牛的背最長肌中鑒定出480 個差異表達的lncRNA。Choi 等[21]從Hanwoo 牛骨骼肌和3 種脂肪組織（肌內、皮下和網膜）中鑒定出了76 個組織特異性的lncRNA。不同年齡階段的牦牛組織中lncRNAs 存在顯著差異，0.5 歲和2.5 歲牦牛在肌肉組織中差異表達4 個lncRNA 和223 個circRNA，而在脂肪組織中差異表達9 個lncRNA[22]。不同生長階段的秦川牛脂肪組織中有119 個差異表達的lncRNA[23]。研究lncRNA 在牛脂肪組織的表達譜，可以進一步理解lncRNA 對脂肪生成功能的調控機制。

2.2 lncRNA 與脂肪分化

目前有研究表明，lncRNA 可以作為“分子海綿”，競爭性結合miRNA，從而發揮作用[24]。Ran 等[25]發現lncFAM200B 的可靶向bta-miR-6529a 負向調控牦牛前體脂肪細胞的增殖和分化，同時lncRNA-420 可作為競爭性內源RNA（ceRNA）結合miR-129-5p，特異性調節DLK1 基因從而抑制牛前體脂肪細胞分化進而影響脂質代謝[26]。ADNCR 是一種新發現的lncRNA，可通過靶向miR-204 發揮作用，在mRNA 和蛋白質水平上顯著調節牛前體脂肪細胞中靶向SIRT1 基因的表達，從而抑制脂肪生成[27]。而lnc MIR221HG 可能通過調節miR-221 的表達來抑制脂肪細胞分化[28]。

此外，lncRNA 也可通過順式作用元件或者反式作用元件調控牛脂肪的生成。lnc SLC30A9通過抑制AKT 蛋白的表達來抑制增殖，并通過將FOS 蛋白募集到過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的啟動子來促進脂肪細胞的分化[29]。lnc BNIP3 可以通過調節細胞周期、DNA 復制途徑和直接調節CDC6 表達來抑制牛肌內前體脂肪細胞增殖[30]。lncRNA BADLNCR1 與GLRX5 基因的啟動子結合從而抑制基因的轉錄活性和mRNA 的表達，進而抑制牛的成脂分化[30,31]。而過表達lnc210 可上調水牛肌內脂肪細胞中過氧化物酶體增殖物從而激活PPARγ 和CCAAT 增強子結合蛋白α（C/EBPα）的mRNA 表達來促進脂質積累[32]。

目前，關于lncRNA 調控脂肪生成的研究在小鼠和人類中較多，在牛脂肪沉積方面的研究還處于起步階段，許多lncRNA 的調控機制仍有待發現。

3 circRNA 調控牛前體脂肪細胞分化

環狀RNA 是通過在真核細胞中對基因外顯子的前RNA 進行反向剪接而產生的，具有共價鍵合的閉環結構，不易被核酸外切酶RNase 降解，因此穩定性比線性RNA 更強[33]。與mRNA和lncRNA 不同，circRNA 不含poly A 尾，因此circRNA 主要富集在沒有poly A 尾巴的RNA 中。有研究發現circRNAs 主要有4 種功能：一是circRNA 與蛋白質結合形成作用于靶基因的RNA-蛋白質復合物。例如，circ-FOXO3 可以與細胞周期依賴性激酶2（Cycle dependent kinase 2，CDK2）和P21 結合形成circ-FOOO3-CDK2-P21三元復合物，進而抑制細胞周期[34]。二是circRNA 可以用作miRNA 海綿，與細胞質中的mRNA競爭與miRNA 結合，從而調節基因表達。三是circRNA 可以編碼蛋白質，circ-ZNF609 翻譯產生參與肌肉生長和發育的蛋白質[35]。四是circRNAs可以調節基因轉錄[36]，如circFUT10 和一些肌肉衍生的分化因子共同調節骨骼肌的生長發育[37]。

3.1 差異circRNA 的鑒定

隨著RNA 測序（RNA-Seq）和生物信息學技術的發展，研究牛轉錄組差異基因與特定性狀之間的關系已成為目前的研究熱點。Reyhan 等[38]整合了5 個肉牛品種（安格斯牛、中國西門塔爾牛、鹿西牛、南洋牛和山東黑牛）的差異表達分析轉錄組圖譜，鑒定了34 個參與脂質代謝的circRNAs。Yang 等[39]比較了雷瓊牛和陸豐牛這兩種類型的中國南方牛背最長肌中的circRNA 轉錄物，鑒定出3330 個差異表達的circRNA，并分析了circRNA 相關的ceRNA 網絡。有學者在牦牛脂肪細胞分化過程中鑒定了circRNA 的表達模式，發現脂肪細胞分化后的第2 天有7 個circRNA 差異表達，第12 天有136 個circRNA 差異表達[40]。Zhao 等[41]使用RNA-Seq 技術從牛脂肪細胞中篩選了調節ACSL1 基因和其他UFA 合成相關基因的39 個circRNA，進一步了解了牛脂肪細胞中PUFA 合成的分子調節機制。綜上，不同牛品種間脂肪組織、肌肉組織及不同部位脂肪組織間均存在circRNA 差異表達，即circRNA 在牛脂肪細胞分化中發揮著重要作用。

3.2 circRNA 與脂肪分化

目前對circRNA 的研究主要集中在競爭性內源RNA（ceRNA）網絡的調節作用上[42]。circBDP1 通過啟動靶向Sirt1/TRARG1 的miR-181b/miR-204 來調節牛的脂肪發育[43]。而circBTBD7主要位于細胞質中，作為競爭性內源RNA（ceRNA）通過circBTBD7/miR-183/SMAD4 軸抑制PPARγ 的表達[44]。研究發現circUBE2Q2 在肉質相關肌肉、脂肪組織和細胞中含量豐富，其表達在MuSCs 成肌分化和SVFs 成脂分化過程中顯著上調，同時circUBE2Q2 可以作為miR-133a 的海綿來調節MuSC 的分化[45]。circFUT10 與海綿分子let-7c 結合并通過靶向牛脂肪細胞中的PPARG C1B 來促進細胞增殖并抑制細胞分化[46]。研究發現circDAMTS16 靶向miR-10167-3p 抑制牛脂肪細胞分化并促進其增殖[47]。也有研究表明circRNF111 與脂肪細胞分化呈正相關并作為miR-27a-3p 海綿發揮作用，消除miR-27a-2p 對PPARγ 基因的抑制作用，從而促進脂肪生成[48]。

circRNA 通過ceRNA 機制調節牛脂肪和肌肉細胞的增殖和分化，并在調節脂肪沉積和肌肉生長發育中發揮重要作用[49]。但仍然需要進一步的研究來鑒定不同circRNAs 亞型的差異表達，以及不同的circRNA 亞型是否具有不同的功能。

4 小結

脂肪沉積的分子調控機制錯綜復雜，涉及多種調節因子和信號通路。現有研究表明，ncRNAs作為基因表達的調節因子在脂肪生成和發育中發揮著至關重要作用。隨著科技不斷進步，分子生物學技術、單細胞和空間多組學、高分辨率顯微鏡、單分子分析方法等研究手段可以更準確地揭示更多關于ncRNAs 的功能信息。現有關于ncRNA 調節脂肪生成的研究大部分集中在單個ncRNA 對脂肪細胞分化的影響，其更深層次的作用機制仍然不夠明確。此外，還應考慮ncRNAs 之間的互作網絡：lncRNA 可以吸收miRNA 來調節靶基因的表達，同樣，circRNA 也可以直接吸附miRNA 來緩解對基因的抑制作用。lncRNA、miRNA 和circRNA 的相互作用網絡是細胞中潛在的關鍵調節機制，可能對脂肪生成產生相當大的影響。因此，以ncRNAs 為中心的脂肪調節網絡仍需進一步深入研究。隨著研究手段不斷進步和牛ncRNAs 數據庫的不斷完善，加上ncRNAs分子功能與調節機制的研究進展不斷加快，以ncRNA 為切入點研究肉牛脂肪沉積的研究成果會越來越多，這將為牛肉肉質性狀改善和新品種選育改良提供理論支持。