滑液囊支原體活疫苗（MS-H 株）在黃羽肉種雞中的免疫效果探索

蔡曼珊，王晨燕，陳銘怡，侯 博*，瞿 浩*

（1.廣東省農業科學院動物科學研究所，廣東廣州 510640；2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建福州 350013；3.廣東智威農業科技股份有限公司，廣東廣州 510640；4.豬禽種業全國重點實驗室，廣東廣州 510640）

滑液囊支原體（Mycoplasma synovia，MS）是感染雞和火雞的一種致病性病原體，目前已廣泛存在于我國不同品種雞群中。2010—2015 年我國21 個省份的44395 只非免疫雞MS 抗體總陽性率為41.19%，不同年份血清陽性率在24.70%～57.20%；在463 個商品雞群中，375 個（80.99%）雞群MS 血清抗體陽性[1]；同期，MS 病原調查表明MS 在我國多日齡混養的地方品種肉雞中廣泛流行，雞胚中的感染率已達16.29%[2]。福建地區2018—2020 年非免疫蛋雞群MS 抗體總陽性率為64.09%，非免疫肉雞群MS 病原總陽性率為49.62%，且MS 抗體陽性率和病原陽性率在肉雞和蛋雞中均表現為隨日齡增加而升高，各年齡段蛋雞MS 抗體均為陽性[3]。因此評價MS 疫苗在商品雞群中的免疫效果，對于開展MS 防控技術研究具有十分重要的意義，且可以為臨床生產實踐中MS 感染防控積累經驗。滑液囊支原體感染主要引起傳染性滑膜炎和腱鞘炎以及亞臨床的呼吸道癥狀，此外還具有較強的水平傳播和垂直傳播能力[4]。MS 以不同途徑感染SPF 雞后臨床表現和發病率差異較大，爪墊注射和胸部皮下注射可導致100%的雞發生爪墊腫大或胸部囊腫，而氣管注射可引起33%～50%的雞發生嚴重氣囊炎，點眼感染基本不能引起臨床病理變化，但點眼感染的氣管MS 病原再分離率可達100%[5]。在臨床上，MS 感染主要表現為上呼吸道亞臨床癥狀或無癥狀，通過點眼人工感染SPF 雞，很難表現出明顯的臨床癥狀，但是支原體可以在氣管中長期存在[5]，在產蛋雞造成蛋重和產蛋數量下降[6,7]，并且引起產蛋雞的蛋殼頂端異常（Eggshell Abonormalities，EAA）[8,9]，造成蛋品質下降和破損率增加，在種雞造成垂直傳播、雞胚孵化率下降[10]，在商品肉雞導致飼料報酬率和胴體品質等級降低[10,11]。因此MS 的大范圍流行給家禽業帶來了巨大的經濟損失。目前，MS 的預防和治療多采用敏感性的抗生素來實現，但經過短期抗生素的使用卻不能徹底根治MS 感染，抗生素治療僅能減輕感染和降低MS 傳播速度，不能從根本上解決問題[7,12]。本研究嘗試在黃羽肉種雞中免疫MS-H 株疫苗后，定期對雞群血清抗體和上顎裂拭子中的MS-H 疫苗菌株和野毒菌株進行監測，對MS-H 株在雞群中的定殖能力和定殖維持時間進行評估，科學評估MS-H 疫苗使用后對于MS野毒菌株感染的預防效果，為有效防控MS 提供新的技術支持，為臨床科學防控雞群MS 的感染提供科學方法或理論依據，為后續開展滑液囊支原體病的綜合防控技術研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料

MS-H 株疫苗購自青島信得藥業有限公司，其由澳大利亞生物資源公司生產；MS 抗體檢測試劑盒Mycoplasma Synoviae Antibody Test Kit 購自BioChek 公司；細菌DNA 提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；可鑒別疫苗株MS-H和野毒菌株的雞滑液囊支原體雙重熒光定量PCR檢測試劑盒購自山東信達基因科技有限公司。

1.2 動物試驗設計

選取一個黃羽肉種雞父母代場，同一個品種共6 個批次雞群。每個批次在1～14 日齡使用兩輪支原體敏感抗生素進行藥物預防，21、90 日齡各免疫MS-H 活疫苗1 羽份，全程不免疫MS 滅活疫苗，14 日齡后不使用支原體敏感抗生素。從1 日齡開始以大約2 周的間隔定期跟蹤采樣，每批雞每次隨機采集24 份血液樣品和24 份上顎裂拭子，其中每3 份上顎裂拭子合并為1 個混合樣品，實行3 合一檢測。將采集的上顎裂拭子置于3mL 的PBS 緩沖液中，-20℃保存用于MS 病原熒光定量PCR 檢測。

1.3 血清抗體的檢測

將采集的血液37℃放置4h，2～8℃放置6h后，1000r/min 離心10min 后分離血清，-20℃保存用于MS 抗體檢測。采用BioChek 公司MS 抗體檢測試劑盒，按照試劑盒說明書對血清中的MS 抗體進行檢測，結果判定標準：根據S/P值≥0.500 或效價范圍≥594，判為MS 抗體陽性，否則判為MS 抗體陰性。

1.4 MS-H 株和MS 野毒菌株的熒光定量PCR 檢測

樣品前處理參照中華人民共和國國家行業標準 《禽支原體PCR 檢測方法》（NYT 553—2015）進行，取上顎裂拭子樣品2000r/min，離心5min；取上清液1mL 置于1.5mL 離心管中，12000r/min，4℃離心10min，仔細吸取所有上清液，將沉淀采用細菌DNA 提取試劑盒提取MS基因組DNA 作為模板進行雙重熒光定量PCR 擴增檢測。

采用山東信達基因科技有限公司雞滑液囊支原體雙重熒光定量PCR 檢測試劑盒，按照說明書進行MS-H 疫苗株和野毒菌株的檢測。檢測結果判定標準為：當陽性對照FAM、VIC/HEX 通道Ct 值≤32，陰性對照FAM、VIC/HEX 通道無擴增曲線，或者擴增曲線為直線或輕微斜線時，則陰陽性對照成立即試驗成立，其中FAM 通道對應MS-H 疫苗株，VIC/HEX 通道對應MS 野毒菌株；待測樣品結果判定標準如下：當待測樣品有指數增長期擴增曲線且Ct 值≤36 判定為陽性，無擴增曲線判定為陰性；當待測樣品36＜Ct 值＜40 時，判定為結果可疑，需重測，當重測結果仍為可疑時，判定為陽性。

2 結果

2.1 MS 抗體檢測結果

由圖1 可知，所有雞群的雞在1 日齡采樣檢測MS 抗體均呈現陽性，平均滴度在3000～5000，隨著日齡的增加母源抗體水平逐漸降低，在14、28、42 日齡時MS 抗體基本呈現陰性，且陽性率較低。在21 日齡進行MS-H 疫苗免疫后，所有雞群在56 日齡陸續出現MS 抗體轉陽。

圖1 MS-H 株疫苗免疫的6 批次父母代黃羽肉種雞MS 抗體檢測

在6 批雞群中有4 批雞群在56 日齡前沒有檢測到野毒（圖2），說明56 日齡檢測到的抗體主要來源于疫苗免疫，即活苗免疫后28d 可以陸續產生抗體，逐漸出現MS 抗體轉陽，但此時的平均抗體滴度較低，一般在2000 以下。雞群20211112 批在56 日齡的MS 抗體陽性程度較高，其平均滴度接近5000（圖1），結合病原監測數據，該批雞在42 日齡發生了較嚴重的MS 野毒感染。MS 抗體轉陽后滴度水平較少升高至5000，這與MS 野毒感染的滴度抗體水平達到10000，甚至30000 相比，疫苗免疫的MS 抗體水平較低，且MS 抗體水平起伏較小。在140 日齡雞群準備開產時，6 批雞抗體陽性率在56%～95%，此時抗體滴度處于養殖全期高峰，后續沒有野毒持續刺激的情況下，在200 日齡前后抗體滴度下降到2000 左右（圖1）。

圖2 MS-H 株疫苗免疫的6 批次父母代黃羽肉種雞MS 野毒感染檢測

2.2 MS 病原的熒光定量PCR 檢測結果

6 批次雞群中，2 批次在42 日齡首次檢出野毒菌株，陽性率分別為100%、37.5%。另外4 批次群分別在70、70、84、112 日齡檢出野毒菌株，且陽性率均在25%以下（圖2）。

MS-H 疫苗菌株定殖和維持方面：6 批雞群在疫苗免疫后1 周均檢出了MS-H 株，大部分雞群在免疫后3～5 周定殖率達到了最高，均超過了80%，部分雞群的定殖率可達100%（圖3）；維持方面，檢測結果顯示直到52 周齡，MS-H 株的檢出率仍維持在62.5%～87.5%（圖3），說明雞群在90 日齡前進行兩次MS-H 株活苗免疫，在雞群中定殖率較高，且維持時間較長。通過對整個飼養周期野毒菌株和MS-H 疫苗株的檢測結果分析，發現飼養期間即使出現多批次野毒菌株反復感染的情況，但除了2 批雞在42 日齡出現一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株陽性率均未超過25%，未出現大范圍的MS 野毒感染（圖2 和圖3），說明即便試驗周期內存在早期MS 野毒菌株的感染，但并未在雞群中大范圍的蔓延和擴散。

圖3 MS-H 株疫苗免疫的6 批次父母代黃羽肉種雞MS-H 株疫苗定植檢測

3 討論

從2010 年至今，滑液囊支原體感染給我國養雞行業造成了嚴重的危害和損失，MS 可以水平傳播和垂直傳播，一旦感染就會在雞體內終生定殖。雖然各大養殖企業都采取了加強生物安全措施、支原體敏感抗生素使用、支原體滅活疫苗免疫等手段，但MS 在中國仍然廣泛流行。因此，目前的防控方法都無法阻止MS 野毒在雞群中的水平傳播，尤其是在多日齡混養的雞場，MS 野毒在雞場循環感染，造成雞群生產性能受到嚴重影響。

本研究旨在評估MS-H 株疫苗在黃羽肉種雞父母代雞群中的定殖效果和定殖時間，評價MS-H 株預防和阻止MS 野毒菌株感染的能力，給養殖企業提供一個有效控制MS 野毒菌株感染的方案。有研究表明在SPF 雞當MS-H 株免疫劑量等于或大于4.8×105CCU 時，免疫后6 周進行攻毒，免疫雞的氣囊損傷程度、氣囊損傷發生率顯著降低，MS 攻毒毒株在氣管和氣囊的定殖率均顯著下降[13]，且MS-H 株誘導的保護性免疫在疫苗接種后至少可維持40 周[14]。本研究通過在規模化養殖場連續對6 批次雞群免疫后，定期跟蹤MS 抗體水平以及對MS-H 株疫苗菌株和MS 野毒菌株的檢測來看，通過滑液囊支原體活疫苗MS-H 的2 次免疫，疫苗株可以在雞體內終生定殖，且MS 野毒菌株的感染率較低。MS-H 株活疫苗免疫可以降低MS 野毒菌株攻毒的氣管中的載量和在雞群中的水平傳播，可以使MS 陽性的多日齡農場轉為MS 感染陰性[15]。本研究通過對6 批次雞群采用MS-H 株疫苗兩次免疫后，大部分雞群在免疫后3～5 周MS-H 株定殖率達到了最高，均超過了80%，部分雞群的定殖率可達100%，直到52 周齡MS-H 株的檢出率仍維持在62.5%～87.5%，在野毒菌株檢測方面發現除了2批雞在42 日齡出現一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株陽性率均未超過25%，未出現大范圍的MS 野毒感染。有研究表明MS-H 株的免疫可以成功的替換雞群中的MS 野毒菌株[15]，而MS 滅活疫苗免疫卻不能阻止MS的感染[16]，本研究中的6 批次雞群MS 野毒菌株未發生嚴重感染可能與MS-H 株免疫阻斷MS 野毒菌株的水平傳播和替換雞群中已感染的MS 野毒菌株相關。因此從本研究中的6 批雞免疫后的抗體水平監測、疫苗菌株在雞群的定殖和野毒在雞群的感染情況監測，生產上可以通過定期監測疫苗定殖率、野毒率、以及抗體滴度、抗體離散度來判斷雞群免疫是否成功以及野毒感染情況。由于種雞感染MS 后，可造成蛋殼質量變差、孵化率下降以及引起垂直傳播，因此在種雞中的支原體疫苗免疫的最主要目的是避免中大雞或產蛋雞的MS 野毒菌株感染。在本研究的20211112 批的雞群中，雞群在42 日齡已經監測到100%野毒感染，56 日齡抗體滴度接近5000，即使雞群已經進行了活疫苗免疫，且活疫苗定殖率最高時達到100%，仍然出現了早期嚴重的野毒感染和不同日齡野毒的多次檢出，提示在生產上，除了做好疫苗免疫外，要抓好飼養管理，包括雞群健康、生物安全、環境消毒等，采取綜合措施以減少野毒菌株在雞群的水平感染。本研究結果顯示MS-H 株疫苗的使用以及在雞群的定殖可能會阻止MS 野毒菌株的感染，控制MS 感染在雞群的水平擴散和傳播，這將為控制和根除MS 感染具有重要作用。

4 結論

商品化的MS-H 株疫苗黃羽肉種雞群中，進行2 次免疫，可以成功的阻止MS 野毒株在雞群中的水平傳播能力，降低MS 野毒株的感染率。