采用慢病毒載體干擾TRAF2表達的MH7A細胞穩轉株的構建及意義

陳露穎,蔣勵萍,王偉康,左書俊,蒯佳婕,馬 旸,韓陳陳,魏 偉

類風濕關節炎(rheumatoidarthritis, RA)是一種慢性、侵蝕性疾病,具有高致殘致畸的特點,病理特征為滑膜炎、關節破壞及血管翳的形成[1],其中成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-likesynoviocyte, FLS)的異常活化在RA的發展中發揮了關鍵作用[2]。活化的FLS過度增殖會產生多種炎癥因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶,如腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor, TNF)-α、白細胞介素(interleukin, IL)-6等,造成關節的慢性炎癥和持續性破壞[3]。腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumour necrosis factor receptor-associated factor2, TRAF2)是TNF-α信號轉導的重要銜接蛋白,在TNF-α誘導的TNFR1和TNFR2信號活化中起著至關重要的作用,參與調控多種細胞內蛋白,包括JNK、核因子(nuclear factor, NF)-κB和p38[4]。其中,NF-κB信號的異常激活可引起持續的炎癥,導致IL-6等多種炎性因子水平升高,誘發RA的發生,并在FLS的異常增殖中發揮了重要作用[5]。該實驗研究TRAF2低表達后TNF-α誘導RA患者滑膜細胞株(MH7A)增殖功能及下游信號的改變,旨在進一步研究TRAF2蛋白在TNF-α誘導的MH7A增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞、菌株、載體 RA患者滑膜細胞株MH7A購自北京金恒盛世科技有限公司;人胚腎HEK 293T 細胞購自中國科學院上海細胞庫;病毒質粒、TOP10 感受態細胞購自通用生物(滁州)公司。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM 培養基及 PBS 購自以色列 BI 公司;SolutionⅠ連接酶、dNTP、6×Loading Buffer、DNA Marker DL10000均購自日本TaKaRa公司;限制性內切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;嘌呤霉素購自優寧維生物科技有限公司;切膠回收試劑盒和質粒小提取試劑盒購自TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司;兔源TRAF2購自艾博抗(上海)貿易有限公司; p-P65和P65購自美國Cell Signaling Technology; Jet PRIME transfection reagent 轉染試劑購自法國PolyPlus公司; PVDF膜購自美國Millipore公司;逆轉錄和PCR試劑盒購自莫納生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 T100 Thermal Cycler PCR 基因擴增儀(美國Bio-Rad公司); Tanon 1600全自動數碼凝膠成像系統(上海天能科技有限公司);Image Quant LAS 4000 熒光及化學發光成像系統(美國 GE 公司);Tanon EPS-300 瓊脂糖凝膠電泳儀(蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司);SIGMA1-16K小型臺式高速冷凍離心機(德國西格瑪公司);ZWY-2102C智誠恒溫培養振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司);核酸電泳儀和 DYY-6C 型電泳系統(北京六一公司)。

1.2 PLKO.1-TRAF2-shRNA質粒構建

1.2.1設計TRAF2-shRNA的PCR引物 通過https：//www.ncbi 查找人TRAF2的基因序列(NM_021138.4),設計特異性靶向TRAF2基因的3對shRNA序列,引物的合成由北京擎科生物有限公司完成。見表1。

表1 3對TRAF2-shRNA引物序列

1.2.2TRAF2-shRNA引物退火 將合成的TRAF2-shRNA引物稀釋成終濃度為10 mmol/l的儲藏液。將以上3對TRAF2-shRNA引物在PCR儀上進行退火形成雙鏈DNA,TRAF2-shRNA的正向、反向引物各5 μl,梯度降溫,循環30次。4 ℃保存短暫保存退火產物。

1.2.3準備線性化載體 使用限制性核酸內切酶AgeI、EcoRI及其配套試劑配制 50.0 μl酶切反應體系[ddH2O 31.0 μl,10 × Cut Smart Buffer 5.0 μl,純化的質粒 DNA (PLKO.1-puro,劑量為0.5 μg/μl)10.0 μl,AgeⅠ和EcoRⅠ各2.0 μl],依序加入試劑后輕輕吹打混勻,室溫下以相對離心力280 r/min短暫離心15 s,37 ℃水浴2 h,對載體酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳,回收酶切產物,回收線性載體并檢測濃度。

1.2.4退火產物與酶切載體連接 將以上得到的退火產物及雙酶切線性化的載體通過Solution Ⅰ 連接酶進行連接,50 ℃下連接 15 min,得到連接產物。

1.2.5重組質粒的轉化擴增及測序 將10.0 μl連接產物加入到 TOP10 感受態細胞中,輕彈管壁數下混勻,冰上放置30 min。42 ℃熱激 90 s,冰水浴孵育 2 min。加入無抗性的溶菌肉湯(Luria-Bertani, LB)培養基 500.0 μl,置于37 ℃搖床振蕩培養1 h。取適量菌液均勻涂布在含有氨芐抗性的LB固體瓊脂培養基上,在恒溫培養箱中倒置培養 12～16 h, 挑取平板上的單個菌落于3 ml的含有氨芐抗性的LB培養液中,搖菌12～16 h,利用質粒小抽提取試劑盒提取質粒,將提取出的質粒進行DNA序列測序。

1.3 慢病毒包裝感染MH7A構建穩轉株

1.3.1慢病毒包裝體系 人HEK 293T細胞以每孔1×106細胞接種于6孔板中,10% DMEM培養液培養,置于37 ℃、5% CO2箱中孵育24 h,至細胞達到對數增長期更換新鮮培養基,進行轉染。將PLKO.1-TRAF2-shRNA質粒與慢病毒包裝質粒共轉入HEK 293T細胞中：① 制備轉染復合物：取無菌 1.5 ml EP 管,加入 200 μl的jet PRIME buffer,再加入2 μg DNA混合物,快速渦旋10 s,混勻后,加入4 μl的jet PRIME reagent 轉染試劑,快速渦旋10 s,混勻后室溫靜置10 min。② 轉染： 將6孔板中培養基棄去,加入 2 ml 10% DMEM,將轉染復合物加入孔中,置于37 ℃、5% CO2孵箱內培養48 h后培養基變黃,收集上清溶液至無菌離心管中,4 000 r/min離心5 min。使用0.45 μm過濾器過濾,分裝到無菌離心管中于-80 ℃保存。

1.3.2嘌呤霉素篩選最佳濃度的確定 提前1 d接種0.5×105個細胞/孔至24孔板中,加入0.5 ml含血清培養基,37 ℃、5%CO2培養至MH7A細胞生長密度達到40%～50%,加入嘌呤霉素濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/ml的含10%血清的DMEM培養基,每隔1 d換新鮮含嘌呤霉素的溶液(濃度不變)。37 ℃、5%CO2培養3 d,顯微鏡下觀察細胞的死亡情況。細胞處理0、24、48、72 h后細胞死亡情況,使MH7A細胞全部死亡的嘌呤霉素濃度即為篩選濃度。

1.3.3病毒液感染和穩轉細胞的篩選 按照每孔1×106的細胞密度鋪板6孔板,觀察細胞長勢;當密度在50%～70%,將PLKO.1空載體及PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒病毒液感染MH7A細胞,加入最適篩選濃度的嘌呤霉素,維持嘌呤霉素濃度,每日觀察細胞狀態,約2～3 d后篩選出TRAF2敲低的MH7A穩轉株,更換新鮮篩選培養基,繼續培養TRAF2敲低的MH7A穩轉株。

1.4 qRT-PCR檢測使用TRIzol收取細胞RNA裂解液,按照說明書提取RNA,測定RNA濃度,逆轉錄RNA成cDNA后進行qRT-PCR檢測,TRAF2正向引物：5′-CTGCGGCAAGAAGA AGATCC-3′,反向引物： 5′-AATCTGCAAGGGACTCG ACA-3′;內參基因 GAPDH 正向引物：5′- ACCCA GAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物：5′-TCAGCT CAGGGATGACCTTG-3′,使用2-ΔΔCt算法處理原始CT數值。

1.5 Western blot在6孔板中每孔接入1×106個MH7A和TRAF2低表達的MH7A細胞,小心棄去上清培養基,使用冷PBS清洗2次,將細胞使用已加蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液RIPA刮下收集在1.5 ml EP管中,冰上裂解30 min,4 ℃離心取上清液使用BCA濃度定量試劑盒進行定量,加入5 × SDS loading buffer,95 ℃、10 min進行蛋白變性,隨后使用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳,5%脫脂牛奶封閉2 h,1 ∶1 000 比例稀釋一抗抗體4 ℃孵育過夜,次日TPBS洗滌3次后,1 ∶50 000比例稀釋二抗抗體,室溫孵育2 h,TPBS洗滌3次,ECL化學發光顯影,以GAPDH作為內參。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖在96孔培養板中分別加入1×104個MH7A和TRAF2低表達的MH7A細胞懸液100 μl,置于37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h。提前4 h分別將培養基更換為90 μl DMEM完全培養基和10 μl CCK-8混合液,繼續孵育30 min,用酶標儀分別檢測450 nm處的光密度(optical density, OD),實驗重復3次。

2 結果

2.1 PLKO.1-TRAF2-shRNA敲低質粒構建與鑒定查找人源TRAF2基因,通過shRNA設計網址設計TRAF2-shRNA引物對,合成TRAF2-shRNA(1)、TRAF2-shRNA(2)和TRAF2-shRNA (3)引物對,通過PCR進行引物對退火,同時雙酶切PLKO.1-puro載體,將獲得的線性PLKO.1-puro片段進行1% 瓊脂糖電泳,回收酶切產物。通過連接酶連接TRAF2-shRNA引物對和線性PLKO.1-puro片段,將連接產物進行轉化,挑選陽性克隆質粒PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)(圖1A)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)(圖1B)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)(圖1C),進行DNA測序和比對分析,測序結果與目的基因序列完全一致,成功構建3種PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質粒。

圖1 3種PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質粒的部分測序結果

2.2 MH7A細胞進行嘌呤霉素濃度篩選MH7A分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/ml嘌呤霉素培養24、48、72 h。結果表明,培養48 h后,嘌呤霉素濃度為2.0、2.5 μg/ml作用所有的細胞均全部死亡,故確定嘌呤霉素作用時間為48 h, 篩選濃度為2.0 μg/ml(圖2)。

圖2 不同濃度嘌呤霉素培養不同時間對MH7A細胞的影響 ×10

2.3 PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒感染MH7A對TRAF2 mRNA的影響3種PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質粒分別和慢病毒包裝質粒共轉入HEK 293T細胞,培養48 h,收集病毒液,通過病毒液感染MH7A,加入2 μg/ml嘌呤霉素,篩選TRAF2低表達的MH7A穩轉株,通過3次獨立qPCR實驗檢測MH7A中TRAF2的表達情況,結果表明,與PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩轉株相比,只有PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) 可以顯著下調MH7A的TRAF2 mRNA水平(t=5.015,P<0.01),提示TRAF2低表達的MH7A穩轉株構建成功(圖3)。

圖3 qPCR檢測MH7A細胞中TRAF2 mRNA的表達情況

2.4 PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒感染MH7A對TRAF2蛋白表達的影響進一步通過Western blot檢測PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒感染MH7A對TRAF2蛋白的抑制效果。結果顯示,與PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩轉株相比,只有PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) 可以顯著下調MH7A的TRAF2蛋白水平(t=8.847,P<0.01),進一步證明了TRAF2低表達的MH7A穩轉株構建成功(圖4)。

圖4 Western blot 檢測MH7A細胞中TRAF2蛋白的表達

2.5 TRAF2低表達對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖的影響分別將PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩轉株和PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A穩轉株接入96孔板中,分別給予TNF-α(20 ng/ml)作用,48 h后,采用CCK-8法檢測MH7A細胞增殖能力。結果表明,在陰性對照MH7A穩轉株中,給予TNF-α作用可以促進其異常增殖(t=20.00,P<0.01);在TRAF2低表達的MH7A穩轉株中, 給予TNF-α作用未促進TRAF2低表達的MH7A穩轉株增殖(t=1.731,P>0.05),提示低表達TRAF2可以減弱TNF-α誘導的MH7A增殖能力(圖5)。

圖5 CCK-8法檢測TRAF2敲低對MH7A細胞增殖能力的影響

2.6 TRAF2低表達對TNF-α誘導的MH7A細胞中P65磷酸化的影響分別將PLKO.1-puro陰性對照MH7A穩轉株和PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A穩轉株接入6孔板中,分別給予TNF-α(20 ng/ml)作用,作用48 h后,通過Western blot檢測TRAF2下游信號P65和p-P65的表達。結果表明,在陰性對照MH7A穩轉株中,給予TNF-α 作用可以顯著促進其p-P65的表達(t=29.20,P<0.01);在TRAF2低表達的MH7A穩轉株中,給予TNF-α作用未顯著促進TRAF2低表達的MH7A穩轉株中p-P65的表達;提示低表達TRAF2可以降低TNF-α誘導的MH7A中P65磷酸化水平(圖6)。

圖6 Western blot 檢測TRAF2敲低對MH7A細胞中P65磷酸化水平的影響

3 討論

TNF-α作為一種重要的炎性因子,在RA患者血清及關節滑膜中水平升高,研究[6]表明抑制TNF-α的作用能顯著改善RA患者的臨床癥狀,提高生活質量。TRAF2作為TNF-α信號下游的一種重要銜接蛋白,TNF-α刺激條件下,TRAF2與TAK1發生泛素化,促進NF-κB活化,促進滑膜細胞增殖以及促炎因子的釋放。TRAF2可以激活IKK,IKK使IκB磷酸化,釋放NF-κB二聚體,并遷移到細胞核。這些二聚體結合特定的DNA序列并激活各種NF-κB的靶基因,促進促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MMP的轉錄和分泌。在RA的滑膜細胞異常增殖中起著重要作用[7-8]。

本實驗利用慢病毒載體系統,構建TRAF2低表達的滑膜細胞穩轉株,為探索TRAF2調控RA滑膜細胞異常增殖的機制提供了實驗方法[9]。常用病毒載體包括腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒。腺病毒一般不能整合到染色體上,適用于瞬時感染;逆轉錄病毒載體只能感染分裂期細胞,而且容量有限;而慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達目的序列的效果。較腺病毒而言,慢病毒載體可以長期表達且能產生表達shRNA的高滴度慢病毒;較轉錄病毒載體而言,慢病毒載體具有更廣的宿主范圍,可以感染非分裂期細胞、容納外源性基因片段大。慢病毒載體介導的轉基因表達能持續數月,且不產生任何有效的細胞免疫應答,可作為一種體外基因運輸的工具[6, 10-11]。慢病毒包裝系統由慢病毒表達載體和慢病毒包裝載體組成。

本研究通過雙酶切慢病毒表達載體PLKO.1-puro,設計TRAF2-shRNA引物,成功構建了PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質粒。將慢病毒包裝載體與PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒載體質粒通過脂質體轉染試劑轉染HEK 293T細胞,獲得病毒液后感染MH7A,經過嘌呤霉素篩選、qPCR和Western blot驗證,成功構建了TRAF2敲低的MH7A細胞穩轉株。將篩選的TRAF2敲低的MH7A細胞穩轉株進行功能驗證,CCK-8檢測細胞增殖,結果表明TRAF2敲低后抑制TNF-α誘導的MH7A異常增殖能力,Western blot結果表明TRAF2敲低后會明顯下調TNF-α誘導的MH7A中p-P65的表達,因為TRAF2是NF-κB下游的關鍵蛋白,敲低TRAF2抑制下游p-p65的磷酸化水平。為后續進一步研究TNF-α-TRAF2信號介導RA滑膜細胞異常增殖的機制提供初步的實驗基礎。