微小RNA-26a通過抑制鐵死亡減少高糖誘導的腎小管上皮細胞細胞外基質合成

李星月,喬云陽,鄭 輝,季嘉玲,張愛青

糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最常見的并發癥,也是終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因。腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)是腎臟損傷后主要的纖維化效應細胞之一,包括腎小管間質纖維化(tubular interstitial fibrosis, TIF)以及細胞外基質(extracellular matrix, ECM)合成,ECM的過度沉積是DKD病理改變的關鍵環節[1]。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度為21～23個核苷酸的單鏈非編碼RNA,參與RNA沉默和基因表達的轉錄后調控[2]。前期研究證實了微小RNA-26a(microRNA-26a,miR-26a)對DKD中的TIF具有緩解作用,揭示了miR-26a在DKD中的潛在機制,但其作用方式尚不完全明確。鐵死亡是一種鐵依賴性的程序性細胞死亡方式,以鐵的過量蓄積和脂質過氧化為特征[3]。在腎臟病領域,有研究[4]顯示miR-20a通過靶向ACSL4依賴性鐵死亡從而緩解腎臟缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)。鐵死亡與非編碼RNA的相互作用關系提供了一個新的角度。該研究通過高糖(high-glucose,HG)誘導RTECs以構建體外DKD模型,探討miR-26a在HG誘導的RTECs中ECM合成的作用機制,為DKD的臨床治療策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞系本實驗所用的小鼠RTECs由東南大學附屬中大醫院腎臟病中心饋贈。

1.2 主要試劑和儀器細胞培養所用的DMEM及胎牛血清購自美國Gibco公司;葡萄糖購自廣州賽國生物科技有限公司;miR-26a mimics購自上海吉瑪有限公司;細胞ROS檢測試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司;GPX4抗體(貨號：ab125066)、溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)抗體(貨號：ab175186)、fibronectin抗體(貨號：ab2413)、collagen Ⅰ(貨號：ab34710)抗體均購自美國Abcam公司,酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family 4,ACSL4)抗體(貨號：sc-365230)購自美國Santa Cruz公司,轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor-1,TFR-1)抗體(貨號：AF5343)、β-actin抗體(貨號：AF7018)購自美國Affinity公司;增強型化學發光(ECL)顯影液購自北京蘭杰柯科技有限公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國默克密理博有限公司;TRIzol購自美國Invitrogen公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養和分組 將RTECs接種于6孔板,鏡下觀察細胞生長到密度為30%～50%時,依實驗需要處理細胞。細胞分組如下：①對照(Control)組：以正常糖濃度(5.5 mmol/L)培養細胞;②HG組：以HG培養細胞,其中葡萄糖終濃度為30 mmol/L;③HG+miR-26a組：在HG誘導的RTECs中通過細胞轉染的方法過表達miR-26a;④HG+miR-NC組：在HG誘導的RTECs中轉染miR-26a mimic的陰性對照(negative control,NC);⑤HG+鐵死亡抑制劑 (ferrostatin-1, Fer-1)組：細胞在HG誘導同時添加Fer-1(溶于0.1%DMSO);⑥HG+DMSO組：細胞在HG誘導同時添加0.1%DMSO。以上各組細胞培養48 h后收集并用于后續實驗。

1.3.2miR-26a過表達轉染 將RTECs接種于6孔板,鏡下觀察細胞密度達到50%時,按照riboFECTTMCP轉染試劑說明書進行轉染。轉染時棄去舊培養基,用PBS洗2次,每孔加入1 866 μl培養基。用120 μl riboFECTTMCP Buffer稀釋2 μl、20 μmol/L miR-26a mimic(正向序列：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU;反向序列：CCUAUCCUGGAUUACUUGAAUU)或mimic NC(正向序列：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT;反向序列：ACGUGACACGUUCGGAGAATT),混勻后室溫孵育5 min,隨后加入3 μl轉染Reagent,室溫孵育15 min后形成轉染復合物,以134 μl/孔加入細胞培養板,培養48 h后收集細胞用于后續實驗。

1.3.3實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 使用TRIzol提取細胞內總的RNA,隨后根據逆轉錄試劑盒說明書操作,將總RNA逆轉錄成cDNA,檢測各組細胞中mRNA和miRNA表達水平。以β-actin作為內參,采用2-ΔΔCt計算各組細胞中mRNA相對表達水平;以U6作為內參,采用2-ΔΔCt計算各組細胞中miR-26a相對表達水平。本研究所用的mRNA引物均購自上海捷瑞生物工程有限公司,miR-26a及其陰性對照引物購自上海吉瑪有限公司,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.4Western blot 使用RIPA裂解液收集細胞并于冰上裂解1 h,在4℃、12 000 r/min條件下離心30 min,取上清液,使用BCA法測定蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液并于沸水中煮沸5 min,-80℃冰箱保存樣品。加載制備好的蛋白樣品并經過SDS-PAGE電泳,分離后的蛋白凝膠通過400 mA恒流轉移至PVDF膜上,使用TBST和脫脂奶粉按照20 ∶1配置封閉液,在室溫下將PVDF膜封閉2 h,隨后加入配置好的collagen Ⅰ、fibronectin、TFR-1、ACSL4、SLC7A11和GPX4抗體(1 ∶1 000),于4℃冰箱內孵育過夜。次日,TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)及辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(1 ∶2 000),室溫下將PVDF膜孵育2 h,再次洗膜,加入ECL顯色液顯影并于凝膠成像儀曝光。Image J軟件分析光密度值,以β-actin為內部參照計算目的蛋白表達量。

1.3.5細胞ROS水平檢測 采用熒光探針DCFH-DA進行RTECs中ROS水平檢測。具體操作按照ROS檢測試劑盒進行。按1 ∶3 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,去除細胞培養液,加入適當體積稀釋好的DCFH-DA,37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻,使探針和細胞充分接觸,用無血清細胞培養液洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA,使用熒光顯微鏡觀察,ROS水平與熒光強度成正比。

2 結果

2.1 miR-26a在HG誘導的RTECs中的表達水平通過RT-qPCR和Western blot檢測HG誘導的RTECs中ECM合成相關指標的表達情況,結果顯示fibronectin和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達量較對照組升高(圖1B、C),提示DKD細胞模型構建成功,同時使用RT-qPCR方法檢測miR-26a的表達量,結果顯示與Control組相比,HG組miR-26a表達量降低(圖1A)。

圖1 miR-26a在HG誘導的RTECs中的表達水平

2.2 過表達miR-26a對RTECs中ECM合成的影響為了探究miR-26a對HG誘導的RTECs中ECM合成的影響,在HG誘導的RTECs中過表達miR-26a,通過RT-qPCR驗證過表達效果(圖2A),同時檢測ECM合成相關指標fibronectin和collagen Ⅰ表達水平。RT-qPCR結果顯示,與HG組相比,HG+miR-26a組細胞中miR-26a表達上調,提示miR-26a過表達成功(圖2A)。在ECM合成方面,RT-qPCR和Western blot結果顯示,與HG組比較,HG+miR-26a組fibronectin和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表達水平下降,HG+miR-NC組細胞中表達水平無明顯差異(圖2B、C)。

圖2 過表達miR-26a對RTECs中ECM合成的影響

2.3 抑制鐵死亡對RTECs中ECM合成的影響為明確鐵死亡對HG處理的RTECs中ECM合成的影響,使用鐵死亡抑制劑Fer-1處理RTECs。使用RT-qPCR和Western blot檢測鐵死亡相關指標表達水平以明確Fer-1對鐵死亡的抑制效果。結果顯示,與Control組相比,HG組細胞中SLC7A11和GPX4表達降低, TFR-1和ACSL4表達升高(圖3A、B),提示DKD模型中鐵死亡的發生;與HG組相比,HG+DMSO處理組差異無統計學意義,提示Fer-1溶劑對細胞無明顯毒性,HG+Fer-1組鐵死亡相關指標表達量改變(圖3A、B)。在此基礎上,進一步檢測RTECs中ECM合成相關指標fibronectin和collagen Ⅰ的表達水平。RT-qPCR和Western blot結果顯示,與HG組相比,HG+Fer-1組ECM合成相關指標表達量降低(圖3C、D)。

圖3 抑制鐵死亡對RTECs中ECM合成的影響

2.4 過表達miR-26a對RTECs鐵死亡的影響上述實驗中,過表達miR-26a和抑制鐵死亡有著減少ECM合成這一共同作用,課題組提出miR-26a抑制鐵死亡進而減少了HG誘導的RTECs中ECM合成,為了驗證這一假設,在轉染了miR-26a的RTECs中通過RT-qPCR和Western blot檢測鐵死亡相關指標TFR-1、ACSL4、SLC7A11和GPX4表達水平。結果顯示,與HG組相比,HG+miR-26a組SLC7A11和GPX4表達升高,TFR-1和ACSL4表達降低,HG+miR-NC組相關指標表達水平差異無統計學意義(圖4A、B),HG+miR-26a組ROS熒光強度的降低同樣提示了miR-26a對鐵死亡的抑制作用(圖4C)。

圖4 過表達miR-26a對RTECs鐵死亡的影響

3 討論

TIF被廣泛認為是DKD進展至ESRD的必經途徑。RTECs是腎小管結構和功能的基本單位,缺血、感染和中毒可引起RTECs變性和壞死,從而導致腎功能障礙[5]。在所有腎細胞中,RTECs是啟動和介導腎纖維化的主要細胞。因此,保護RTECs免受損傷對于預防DKD的發生和發展至關重要。

越來越多的研究表明,miR-26a與各種器官的纖維化過程有關。例如,miR-26a在過敏性哮喘小鼠模型中被證明可以通過調節靶基因影響支氣管組織肺纖維化,從而影響哮喘小鼠的氣道重塑[6]。另一項研究[7]表明過表達miR-26a不僅可以有效減輕鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型的心肌纖維化,而且在體外能抑制HG誘導的心肌細胞損傷。此外,miR-26a可以緩解特發性肺纖維化,并且抑制小鼠晶狀體纖維化[8]。有研究[9]結果表明在心肌細胞中過表達miR-26a可以緩解慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)中發生的尿毒癥性心肌病。在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)小鼠模型中,miR-26a可靶向結締組織生長因子,抑制CKD腎臟纖維化[10]。本研究中,HG誘導的RTECs中miR-26a表達降低,HG誘導RTECs中ECM合成;相比之下,過表達miR-26a顯著抑制ECM合成。這與課題組前期研究miR-26a可以抑制DKD中TIF結果相一致。這些結果表明,miR-26a可能在緩解RTECs中ECM合成發揮重要作用。

鐵死亡主要特征是鐵超載和細胞內ROS的持續積累,是一種由鐵依賴性脂質過氧化作用介導的新型調節性細胞死亡[3]。SLC7A11和GPX4被認為是鐵死亡的重要標志物,是細胞內抗氧化系統的重要組成部分,缺乏它們可能導致大量ROS產生和GSH合成障礙[11-12],TFR-1參與細胞內鐵代謝,鐵代謝異常是鐵死亡的必要過程[13],ACSL4是調節脂質過氧化的關鍵酶,參與氧化細胞膜磷脂的合成,從而導致細胞發生鐵死亡[14]。本研究顯示,在HG培養的RTECs中,ROS積聚增加,鐵死亡相關指標顯著改變,驗證了鐵死亡的發生,進一步過表達miR-26a顯著抑制鐵死亡相關指標表達水平,這提示miR-26a可能參與調控鐵死亡過程。另有研究[15]表明,在UUO小鼠和IRI小鼠模型中,抑制鐵死亡可以在很大程度上減輕 UUO和 IRI后小鼠的腎損傷、ECM和炎癥細胞積聚,提示鐵死亡和TIF的發生發展密切相關。本研究表明使用鐵死亡抑制劑后,ECM合成減少,過表達miR-26a后,ECM合成增加,鐵死亡相關指標改變,提示miR-26a可能通過抑制RTECs鐵死亡從而減少HG誘導的ECM合成。

本研究尚有不足之處,miR-26a在鐵死亡中的作用機制或作用靶點仍需進一步探討,課題組擬在后續實驗中補充糖尿病腎病小鼠模型,為DKD臨床診治提供更堅實的理論基礎。