脂氧素A4抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減緩膿毒癥性急性腎損傷

龔書豪,曹春水,王 纓,梅松波

膿毒癥是感染導致的全身炎癥性反應,可引起遠離感染部位的各個器官功能障礙,是導致患者發(fā)生急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)的重要原因之一[1]。腎臟是膿毒癥最容易受累的靶器官,當膿毒癥性急性腎損傷(sepsis-induced acute kidney injury, SAKI)出現(xiàn)時,患者的死亡率將升高至70%[2]。

脂氧素A4( lipoxin A4, LXA4 )具有顯著的炎癥負性調(diào)控作用[3],可減輕膿毒癥相關的炎癥反應并改善膿毒癥患者的生存率[4]。Toll樣受體4(toll-like receptor4, TLR4)是一類重要的病原模式識別受體,被認為是炎癥反應的啟動閘門[5]。急性炎癥反應中,炎癥細胞因子的產(chǎn)生可激活TLR4,經(jīng)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88, MyD88)依賴通路產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應。隨后,核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)進入細胞核,NF-κB核轉位促進炎癥因子產(chǎn)生及釋放[6]。該研究擬建立SAKI小鼠模型,探討TLR4/MyD88/NF-κB通路在SAKI發(fā)生發(fā)展中的作用以及LXA4是否通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路減緩SAKI,為SAKI的診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料無特定病原體級雄性C57BL/6J小鼠40只,體質量18 ～ 22 g,由南昌大學醫(yī)學院動物科學部提供。LXA4購于美國Cayman公司;血清、尿液生化指標及炎癥因子測定相關的ELISA試劑盒購于無錫艾爾諾生物技術有限公司;兔抗小鼠TLR4多克隆抗體、兔抗小鼠MyD88多克隆抗體、兔抗小鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司;鼠抗β-Actin單克隆抗體購于石家莊博海公司;辣根酶標記羊抗鼠IgG、辣根酶標記羊抗兔IgG購于無錫艾爾諾生物技術有限公司;免疫細胞化學試劑盒購于江蘇晶美公司;PCR試劑盒購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組及SAKI小鼠模型的制備 依據(jù)隨機數(shù)表法將40只C57BL/6J小鼠分為SAKI組、 SAKI+LXA4組、假手術組、假手術+LXA4組,每組小鼠各10只。采用盲腸結扎穿孔術制備SAKI小鼠模型[7],小鼠予以2%戊巴比妥腹腔麻醉,以腹部正中為手術切口,大約制備1 cm的切口,將小鼠腹膜逐層打開,找到盲腸后對盲腸遠端游離處理,并將盲腸內(nèi)的糞便擠向遠端,使用3號絲線對小鼠盲腸中段進行結扎,使用12號針頭對盲腸遠端進行穿孔處理,將少許糞便擠壓至盲腸表面,隨后回納盲腸、縫合腹膜、關閉腹腔,術畢使用生理鹽水1 ml皮下注射以補充術中丟失的體液,術后小鼠自由飲水、進食。造模后小鼠直腸溫度較造模前升高至少1 ℃、心率及呼吸頻率為術前的2倍、尿量減少并出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、少動等表現(xiàn),術后24 h監(jiān)測小鼠血肌酐(serum creatinine, Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, Bun)、尿液中性粒細胞明膠酶相關性脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)及腎損傷分子1(kidney injury molecule 1, KIM-1)水平,若小鼠出現(xiàn)上述表現(xiàn)且Scr、Bun、NGAL、KIM-1較正常值升高則表示造模成功。SAKI+LXA4組在SAKI造模術后30 min腹腔注射LXA4(40 ng/kg)[8]。假手術組除不行盲腸結扎穿孔外,余操作同SAKI組。假手術+LXA4組在假手術術后30 min腹腔注射LXA4(40 ng/kg)[8]。

1.2.2標本留取 尿液標本：各組小鼠分別在造模術后24 h給予3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,行腹正中縱行切口,分離小鼠膀胱行膀胱穿刺術以收集膀胱內(nèi)的尿液,離心后取上清液置于-80℃冰箱;留取小鼠尿液標本后,打開小鼠胸腔心臟取血,離心后取上清液置于-80℃冰箱;留取小鼠尿液及血液標本后,立即剝離腎皮質周圍結締組織,切下腎臟組織,剝離腎包膜,并沿腎臟矢狀面切開腎臟,切取腎臟皮質,予以9 g/L鹽水沖洗,使用無菌紗布吸干表面水分,將部分腎臟皮質置于10%中性甲醛固定,石蠟包埋,用于病理染色以及免疫組化,將另一部分腎臟皮質放置于-80℃冰箱中用于免疫印跡實驗及實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3血清、尿液生化指標及因子測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測小鼠Scr、Bun、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α),尿液NGAL及KIM-1水平。

1.2.4光鏡檢查及腎組織病理評分 腎組織予以10%中性甲醛固定24 h后,石蠟包埋,并予以切片,厚度為2 μm,進行HE及PAS染色,觀察并拍照記錄。每張切片在光鏡(×400)觀察下,在病變嚴重處用Paller法對腎小管損傷程度進行評分,即每個高倍視野隨機選擇10個有病變的腎小管,按100個腎小管計分,標準如下：腎小管明顯擴張、細胞扁平(1分)、刷狀緣損傷(1分)、刷狀緣脫落(2分)、管型(2分)、腎小管管腔內(nèi)有脫落或壞死的細胞(1分)。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測 TRIzol法以提取細胞總RNA,并用紫外分光光度計以檢測RNA濃度,要求A260 nm/A280 nm比值在1.8至2.0之間,以RNA為模板反轉錄生成cDNA。定量PCR檢測均使用SYBRGreen法,所有引物序列由Invitrogen公司提供。各引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.6免疫組織化學法 石蠟切片二甲苯脫蠟2次,并運用微波熱修復抗原,冷卻后用磷酸緩沖鹽(phosphate buffer salt, PBS)液沖洗。滴加3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,室溫孵育15 min,用PBS液沖洗,滴加合適濃度的一抗：兔抗小鼠TLR4(1 ∶100),兔抗小鼠MyD88(1 ∶150),兔抗小鼠NF-κB p65(1 ∶150),兔抗小鼠p-NF-κB p65(1 ∶150)以PBS液替代一抗為陰性對照。PBS液沖洗切片,并滴加辣根過氧化物酶以標記二抗IgG多聚體,滴加新鮮二氨基聯(lián)苯胺顯色劑,運用顯微鏡觀測,棕褐色或棕黃色則為陽性信號。顯色終止,使用Image-ProPlus6.0圖片分析軟件予以半定量分析,同一條件下選取20個不同的400倍視野,以陽性面積/視野總面積來表示相對陽性表達量。

1.2.7蛋白免疫印跡實驗 將-80℃冰箱保存的小鼠腎皮質取出,加裂解液勻漿,測定各蛋白濃度,取各樣品50 μg總蛋白上樣電泳,再轉入聚偏二氟乙烯膜。加入封閉液稀釋的兔抗TLR4多克隆抗體(1 ∶1 000),兔抗MyD88多克隆抗體(1 ∶300),兔抗NF-κB p65多克隆抗體(1 ∶300),兔抗p-NF-κB p65多克隆抗體(1 ∶300),鼠抗β-Actin單克隆抗體(1 ∶200)一抗。4 ℃過夜。TBST洗滌緩沖液洗膜,再加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶500),室溫條件下孵育、洗膜,增強化學發(fā)光法顯色并曝光。運用LabWork4.5軟件系統(tǒng)對其進行定量分析,光密度(optical density, OD)值代表目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 實驗小鼠觀察SAKI組10只小鼠術后24 h均出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)蓬亂、活動遲緩,伴有呼吸及心跳加快、發(fā)熱、少尿等表現(xiàn),1只小鼠于6 h死亡,剩余9只小鼠術后24 h經(jīng)檢測Scr、Bun、NGAL、KIM-1均較正常值升高,表示造模成功。SAKI+LXA4組10只小鼠術后24 h均存活,并出現(xiàn)SAKI組類似表現(xiàn),但癥狀均較SAKI組小鼠輕,且Scr、Bun、NGAL、KIM-1也較正常值升高。假手術組及假手術+LXA4組小鼠術后無死亡,一般情況良好,Scr、Bun、NGAL、KIM-1均在正常范圍值內(nèi)。

2.2 各組小鼠血清、尿液生化指標、因子測定結果SAKI及SAKI+LXA4組Scr、Bun、IL-1β、IL-6、TNF-α、NGAL、KIM-1均高于假手術組、假手術+LXA4組(P<0.05),SAKI+LXA4組小鼠各項指標均低于SAKI組小鼠(P<0.05),假手術組與假手術+LXA4組各項指標無明顯升高,且兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組小鼠各項指標測定結果見表2。

表2 各組小鼠血清、尿液生化指標、炎癥因子測定結果

2.3 各組小鼠光鏡結果及腎組織病理評分比較SAKI組腎小球體積明顯增大,系膜細胞以及基質明顯增多,腎小管明顯擴張,可見大量刷狀緣損傷及刷狀緣脫落,并可見大量管型、部分腎小管管腔內(nèi)有脫落或壞死的細胞;SAKI +LXA4 組腎小球體積稍增大,系膜細胞以及基質增多,腎小管可見擴張,少量腎小管上皮細胞出現(xiàn)腫脹、空泡變性,未見刷狀緣脫落,可見少量管型,少量腎小管管腔內(nèi)有脫落或壞死的細胞;假手術組及假手術+LXA4組腎小球形態(tài)和系膜細胞正常,腎小管基本正常,未見明顯壞死和凋亡。小鼠HE及PAS染色見圖1。SAKI組腎臟組織病理評分(16.41±2.22)高于SAKI+LXA4組(9.17±2.01),且SAKI組、SAKI+LXA4組腎臟組織病理評分均高于假手術組及假手術+LXA4組(F=6.432,P<0.05),假手術組(1.68±0.16)及假手術+LXA4組(1.69±0.14)腎臟組織病理評分相比差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 各組小鼠腎臟病理 ×400

2.4 實時熒光定量PCR對比各組小鼠腎臟TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA水平SAKI組TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA水平均高于SAKI+LXA4組(P<0.05),且SAKI組、SAKI+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA水平均高于假手術組及假手術+LXA4組(F=6.338,P<0.05),假手術組及假手術+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相比差異無統(tǒng)計學意義。運用實時熒光定量PCR技術,SAKI組、SAKI+LXA4組、假手術組、假手術+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA水平見圖2。

圖2 各組小鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的比較

2.5 免疫組化法對比各組小鼠腎臟TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達SAKI組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達量均高于SAKI+LXA4組(P<0.05),且SAKI組、SAKI+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達量均高于假手術組及假手術+LXA4組(F=4.456,P<0.05),假手術組及假手術+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達量相比差異無統(tǒng)計學意義。運用免疫組化法,SAKI組、SAKI+LXA4組、假手術組、假手術+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達見圖3、4。

圖3 各組小鼠腎臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達情況 免疫組化染色×400

圖4 各組小鼠免疫組化各指標定量積分比較

2.6 蛋白免疫印跡實驗檢測對比各組小鼠腎臟TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白水平SAKI組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達量均高于SAKI+LXA4組(P<0.05),且SAKI組、SAKI+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達量均高于假手術組及假手術+LXA4組(F=7.338,P<0.05),假手術組及假手術+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達量相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。運用蛋白免疫印跡實驗,SAKI組、SAKI+LXA4組、假手術組、假手術+LXA4組TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達情況見圖5。

圖5 各組小鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達情況

3 討論

SAKI患者腎組織出現(xiàn)毛細血管內(nèi)皮損傷、腎間質中性粒細胞等炎性細胞浸潤,炎癥因子高表達,提示炎癥反應在SAKI發(fā)病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9]。膿毒癥早期積極抑制炎癥反應,對SAKI的預防和治療具有較好的效果。對膿毒癥和非膿毒癥的重癥監(jiān)護室患者的腎臟病理進行分析,膿毒癥患者腎臟病理改變以炎癥細胞浸潤為主要特征,非膿毒癥患者并無相關病理改變[10]。以上研究表明炎癥反應與SAKI發(fā)生發(fā)展密切相關。

TLRs是一類重要的病原模式識別受體,是固有免疫的啟動因子和連接固有免疫與獲得性免疫的橋梁,被認為是炎癥反應的啟動閘門。在炎癥反應中,TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活是普遍認可的機制之一。該通路激活后促進IL-1β、IL-6、TNF-α等多種促炎細胞因子和黏附分子等基因的轉錄。這些炎癥介質又可以進一步激活機體的防御系統(tǒng),二者互為因果,形成炎癥瀑布,造成炎癥介質持續(xù)過度釋放,最終導致以細胞自身破壞為特征的全身炎癥反應綜合征[11]。

LX是Serhan et al[12]于1984年發(fā)現(xiàn)的二十烷類家族中一類花生四烯酸的產(chǎn)物,通過作用于多種細胞表面的受體發(fā)揮其強大的抗炎作用。LX的抗炎作用可通過調(diào)控多種炎癥信號通路以抑制炎癥因子的產(chǎn)生及釋放,其中就包括了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路。最近的研究[13]表明,LXA4通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路以抑制牙齦炎的發(fā)生,同樣LXA4也可通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路以抑制百草枯相關急性肺損傷的進展[14]。然而TLR4/MyD88/NF-κB通路在SAKI發(fā)生發(fā)展中的作用以及LXA4是否通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路減緩SAKI卻鮮有研究報道。本研究中,依據(jù)文獻制備SAKI小鼠模型,造模術后24 h小鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)蓬亂、活動遲緩,伴有呼吸及心跳加快、發(fā)熱、少尿等SAKI相關表現(xiàn)且Scr、Bun明顯升高,診斷AKI的有效生物學標志NGAL及KIM-1也明顯升高,提示SAKI小鼠造模成功,處死各組小鼠后收集血清、尿液、腎臟標本。

HE及PAS染色顯示SAKI+LXA4組較SAKI組小鼠腎臟損傷輕,應用Paller法對腎小管損傷程度進行評分,SAKI+LXA4組評分明顯低于SAKI組小鼠。同時課題組也運用ELISA法對Scr、Bun、NGAL、KIM-1進行檢測,顯示SAKI+LXA4組小鼠Scr、Bun、NGAL、KIM-1較SAKI組小鼠減低,由此推測LXA4可以減緩SAKI的腎損傷。運用ELISA法對IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子進行檢測,顯示SAKI+LXA4組小鼠上述炎癥因子較SAKI組明顯減低,這說明LXA4作用于SAKI小鼠可以減少炎癥因子的產(chǎn)生。

實時熒光定量PCR、免疫組化法、免疫印跡實驗顯示SAKI小鼠TLR4、MyD88、NF-κB在腎組織中表達升高,使用LXA4作用于SAKI小鼠,TLR4、MyD88、NF-κB在腎組織中的表達則明顯減低。在炎癥反應中,TLR4/MyD88/NF-κB信號通路促進炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生及釋放。膿毒癥早期減少炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α產(chǎn)生及釋放,對腎功能的保護及SAKI的預防和治療具有較好的效果[15]。本研究也表明SAKI小鼠TLR4/MyD88/NF-κB在腎組織中高表達,且血液炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α明顯升高,推測TLR4/MyD88/NF-κB通路介導IL-1β、IL-6、TNF-α在內(nèi)的炎癥因子高表達,LXA4則抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路介導IL-1β、IL-6、TNF-α在內(nèi)的炎癥因子高表達。目前的共識是,腎小管損傷在SAKI的進展中起著重要作用。膿毒癥發(fā)病期間,腎小管上皮細胞可被IL-1β、IL-6、TNF-α在內(nèi)的炎癥因子直接損傷,受損的腎小管上皮細胞反過來可以調(diào)節(jié)和放大腎內(nèi)炎癥反應[15],而課題組應用Paller法對腎小管損傷程度進行評分,SAKI+LXA4組小鼠腎小管損傷程度明顯低于SAKI組小鼠。由此推測TLR4/MyD88/NF-κB信號通路通過介導IL-1β、IL-6、TNF-α在內(nèi)的炎癥因子的產(chǎn)生及釋放,加重腎組織損傷,參與SAKI的發(fā)生發(fā)展。LXA4則通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路以減少IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生及釋放,減緩腎損傷從而抑制SAKI的發(fā)生發(fā)展。此項研究為SAKI的發(fā)病機制及治療提供了新的依據(jù),但LXA4作用于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的具體機制仍需體內(nèi)及體外實驗進一步探討。