GNB4和Riplet基因甲基化檢測在原發性肝癌診斷中的價值研究

楊玉萍,徐恩君,汪軒軒,唐宜桂,鄭美娟,王 悅,儲夢真,徐家丹,王中新

原發性肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一,是慢性肝臟疾病患者最常見的死因,病死率居惡性腫瘤第三位[1]。診斷原發性肝癌目前已經確認的一些血清蛋白質標志物的敏感度和特異度有限,如一些肝臟良性疾病、生殖腺胚胎源性腫瘤和轉移性肝癌等也表現出甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)升高,部分肝癌患者AFP濃度始終保持低水平狀態[2]。有研究[3-4]表明在癌癥患者外周血的循環游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)中可以找到由各種類型癌癥引起的DNA碎裂產物,是一種可以通過檢查人體血漿中的cfDNA來鑒別正常人還是潛在危險人群的方法。腫瘤相關基因發生甲基化修飾是導致腫瘤發生的早期事件[5],GNB4即鳥嘌呤核苷酸結合蛋白β4亞基,是異源三聚體G蛋白的關鍵亞基,在許多種類的惡性腫瘤的發生和發展中發揮著重要的作用,如尿路上皮癌、食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、胃癌等[6-9],研究[10]報道證實該基因的甲基化與肝癌的發生高度相關。Riplet是一個泛素連接酶,研究[11]表明Riplet促進維甲酸誘導基因Ⅰ介導的干擾素β啟動子激活,抑制負鏈RNA病毒的增殖,該基因的甲基化作為診斷肝細胞癌的分子標志物也有相關報道[12-13]。該研究通過對人外周血血漿cfDNA中GNB4和Riplet基因甲基化以及血清AFP的檢測,探討AFP、GNB4和Riplet基因甲基化單獨和聯合檢測在原發性肝癌診斷中的診斷效能和臨床價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2022年12月至2023年8月在安徽醫科大學第一附屬醫院就診的313例患者作為研究對象。78例原發性肝癌患者,其中男性62例,女性16例,年齡19～84(61.47±12.24)歲。157例良性肝臟疾病患者,其中男性89例,女性68例,年齡20～78(43.96±12.21)歲,包含肝硬化30例,乙型肝炎87例,丙型肝炎4例,自身免疫性肝炎2例,膽汁淤積性肝炎1例,脂肪肝7例,其他良性肝病(肝血管瘤、肝囊腫等)26例。41例其他消化系統腫瘤患者,其中男性27例,女性14例,年齡37～86(66.10±10.83)歲,包含胃部惡性腫瘤19例,結直腸惡性腫瘤14例,胰腺惡性腫瘤4例,膽管惡性腫瘤4例。17例非消化系統腫瘤患者,其中男性13例,女性4例,年齡42～82(67.53±12.10)歲,包含腎惡性腫瘤8例,前列腺惡性腫瘤8例,尿路上皮癌1例。20例原發性肝癌術后患者。采用甲基化熒光定量PCR(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)法檢測所有患者血漿中GNB4和Riplet基因甲基化水平,直接化學發光法(雙抗體夾心法)檢測血清AFP水平。本項研究已通過安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的審核與授權(YJ2022-09-06),所有參與者均簽署了知情同意書。

1.1.1入選標準 ① 符合《原發性肝癌診療指南(2022年版)》[14]臨床診斷標準的原發性肝癌患者。② 干擾患者：良性肝臟疾病患者,包括肝硬化、肝炎、脂肪肝、肝腺瘤、肝囊腫等;未經治療的其他消化系統腫瘤患者,包括食管癌、胰腺癌、結直腸癌、膽囊/管癌、胃癌等;未經治療的非消化系統腫瘤患者,包括肺癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、宮頸癌等。③ 行肝切除、移植的肝癌術后患者且有術前評價試劑檢測。

1.1.2排除標準 ① 無術前評價試劑檢測的肝癌術后患者和已接受放/化療等治療患者;② 肝癌合并患有其他惡性腫瘤;③ 未按要求保存或溶血的樣本;④ 術前術后對照研究有遠處轉移的肝癌術后患者。

1.2 方法

1.2.1樣本的采集、制備和保存 用含EDTA抗凝劑的采血管采集不少于10 ml的全血,顛倒8～10次混勻后立刻分離成血漿。不應放置在室溫超過3 h或在2～8 ℃超過8 h,不可冷凍全血。以離心力 3 500 r/min離心10 min后提取血漿,放入15 ml的離心管內再次離心10 min(3 500 r/min),將血漿轉入新的15 ml離心管內。血漿樣本可被儲存在2～8 ℃最多18 h,在-25～-15 ℃可穩定28 d,在(-80±5) ℃可儲存12個月。選擇無抗凝劑的干燥管采集2～3 ml全血,離心5 min(轉速3 500 r/min)獲取血清檢測AFP。室溫可儲存8 h,2～8 ℃可保存48 h,若48 h不能完成檢測則將標本冷凍于-20℃。

1.2.2樣本的處理 ① 核酸提取：取2 ml血漿,使用核酸提取試劑進行核酸提取,獲取cfDNA。② 亞硫酸氫鹽轉化及純化：取獲得的核酸提取液35 μl,使用核酸純化試劑進行快速亞硫酸氫鹽轉化,并將轉化液進行純化。獲得的純化液即可用于GNB4和Riplet基因甲基化檢測。③ PCR擴增：根據需擴增的樣本數量配置PCR反應液并按10 μl/管分裝至反應管中/板中,然后依次加入處理好的陰性對照、樣本核酸轉化液和陽性對照各40 μl。加樣并蓋好管蓋或封膜,短暫離心30 s(2500 r/min)后,立即進行PCR擴增反應。

1.2.3實驗結果的讀取 利用ABI 7500實時熒光定量PCR分析儀獲取數據。通過Atellica IM全自動化學發光免疫分析儀對血清中的AFP進行精確測量。

1.3 診斷標準本實驗使用GNB4和Riplet基因甲基化聯合檢測試劑盒(熒光PCR法),由武漢艾米森生命科技有限公司提供。該試劑盒能夠在體外對人的外周血血漿cfDNA中的GNB4和Riplet基因進行甲基化定性分析。根據說明書,待測樣本內控基因ACTB Ct值≤35(VIC通道)則樣本有效,否則判定樣本無效。陰性對照應符合ACTB(VIC通道)、GNB4(FAM通道)、Riplet(ROX通道)Ct值>43或Unde(無擴增);陽性對照應符合ACTB(VIC通道)、GNB4(FAM通道)、Riplet(ROX通道)Ct值≤33。陰陽性對照和內控合格后,對檢測結果進行判定：Ct值≤43(FAM通道),且呈S型擴增曲線趨勢,GNB4甲基化陽性;Ct值≤43(ROX通道),且呈S型擴增曲線,Riplet甲基化陽性;Ct值>43或Unde(無擴增)為陰性。聯合檢測采用平行聯合診斷法,當有一個檢測結果判定為陽性則診斷為陽性。

根據目前國際上普遍接受的臨界值20 ng/ml,AFP<20 ng/ml為AFP陰性組,而20≤AFP<200 ng/ml為AFP低水平組,若AFP≥200 ng/ml為AFP高水平組。

1.4 統計學處理使用SPASS 22.0軟件進行數據處理。采用χ2檢驗,方差檢驗,二元logistics回歸分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各分組基因甲基化檢測結果不同分組基因甲基化的檢測結果見表1,GNB4和Riplet基因的甲基化陽性率在原發性肝癌組中顯著超過了其他各個分組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 GNB4和Riplet在不同分組陽性率的比較

2.2 各分組年齡、性別、AFP結果的分布情況腫瘤組患者的平均年齡高于肝良性疾病組,且男性患者比例也高于肝良性疾病組,差異均有統計學意義(P<0.05)。78例肝癌患者中AFP<20 ng/ml有33例(42.31%),而在157例肝良性疾病中AFP≥200 ng/ml有3例(1.91%),在17例非消化系統腫瘤患者中AFP≥200 ng/ml有1例(5.88%),各組具體分布情況見表2。

2.3GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同AFP濃度中的表達情況78例原發性肝癌患者GNB4和Riplet基因甲基化的表達水平在不同血清AFP濃度的情況,見表3。GNB4和Riplet基因甲基化聯合檢測時在3個分組中差異無統計學意義(P=0.103>0.05)。

表3 GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同 AFP 濃度分組中表達情況

2.4 AFP、GNB4基因甲基化、Riplet基因甲基化單獨和聯合檢測在原發性肝癌中的診斷效能評價

表4 各指標診斷肝癌多因素回歸分析結果

2.4.2構建原發性肝癌的診斷模型并繪制ROC曲線 根據GNB4基因甲基化水平、Riplet基因甲基化水平、性別、年齡及血清AFP這些指標創建6個診斷模型,見表5,且繪制ROC曲線,見圖1。其中 AFP 診斷模型曲線下面積AUC為0.775(95%CI0.706～0.844),靈敏度為51.3%,特異度為94.3%。GNB4基因甲基化診斷模型ROC曲線下面積AUC為 0.912(95%CI0.862～0.962),靈敏度為83.3%,特異度為99.4%。Riplet基因甲基化診斷模型曲線下面積AUC為0.860(95%CI0.799～0.921),靈敏度為73.1%,特異度為99.4%。GNB4和Riplet基因甲基化聯合診斷模型曲線下面積AUC為0.958(95%CI0.923～0.998),靈敏度為92.3%,特異度為98.7%。AFP、GNB4和Riplet基因甲基化三者聯合診斷模型曲線下面積AUC為0.956(95%CI0.917～0.994),靈敏度為92.3%,特異度為98.7%,當加入年齡與性別這兩個因素后的聯合診斷模型 AUC為0.989(95%CI0.979～1.000),靈敏度為93.6%,特異度為97.5%。各模型曲線下面積結果差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 不同診斷模式ROC曲線分析

表5 不同診斷模式對原發性肝癌的診斷效能評價

3 討論

GNB4基因編碼異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)的β亞基,其在信號轉導中起著至關重要的作用[9],Riplet基因又稱RNF135基因,作為E3泛素連接酶的作用,通過調節T細胞中的Th1和CTLs來抑制抗腫瘤免疫反應[11],兩者甲基化均可導致腫瘤的發生。本研究中原發性肝癌GNB4基因甲基化陽性率為82.05%,明顯高于肝良性疾病組的0.63%、其他消化系統腫瘤組的31.71%、其余組別的0%,同時肝癌組Riplet基因甲基化陽性率為71.79%,明顯高于其他消化系統腫瘤組的2.44%和其他分組的0%,顯示相比于肝良性疾病和其他腫瘤患者,肝癌患者外周血液中有GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化的存在且水平明顯較高,與相關研究[15]相符,將GNB4和Riplet基因甲基化聯合檢測,在原發性肝癌組的陽性率達到92.31%,高于GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化單獨檢測,提高了對肝癌患者的診斷效能。

血清AFP是診斷肝癌與療效監測常用且重要的腫瘤標志物,但其敏感度較低,在部分肝癌中呈現低水平,尤其在腫瘤直徑小于2 cm的早期微小肝癌患者中。分析本研究中各分組AFP水平,在原發性肝癌組中AFP<20 ng/ml占42.31%,20≤AFP<200 ng/ml占25.64%,而在肝良性疾病中20≤AFP<200 ng/ml有10.19%,AFP≥200 ng/ml有1.91%,顯示在原發性肝癌中仍有相當一部分患者血清AFP呈現低水平,甚至陰性,一些良性肝病、其他惡性腫瘤中也表現出 AFP 升高,AFP靈敏度和特異度存在局限性,與相關研究[2]基本一致。當前研究將其它不同的腫瘤指標與AFP聯合檢測以提高診斷的敏感度。

為進一步探討GNB4基因甲基化和Riplet基因甲基化在肝癌診斷中的應用,將78例原發性肝癌患者作為實驗組,157例肝良性疾病患者作為對照組,以進行更深層次的分析。對兩組年齡和性別進行比較,肝癌患者的平均年齡大于肝良性疾病患者,肝癌患者男性占比高于肝良性疾病患者,與文獻[2]報道一致,這可能與男性性激素和x相關的遺傳因素有關[2]。通過多因素回歸分析,年齡、性別、GNB4基因甲基化、Riplet基因甲基化均與肝癌的發生顯著相關。關于GNB4和Riplet基因甲基化水平在不同AFP濃度中的表達情況的分析顯示：GNB4和Riplet基因甲基化聯合檢測在不同AFP濃度中的表達結果差異無統計學意義(P=0.103),顯示在AFP低水平和AFP陰性的肝癌患者中仍有較好的診斷效能,同時該結果也證實了無論血清AFP的表達情況如何,都可以采用GNB4和Riplet基因甲基化聯合檢測對原發性肝癌進行篩查,這為肝癌的診斷提供了更多的參考指標。最后,本研究將GNB4基因甲基化水平、Riplet基因甲基化水平、年齡、性別以及血清AFP指標建立6個診斷模型繪制了ROC曲線。結果顯示,對于原發性肝癌的診斷,GNB4和Riplet基因甲基化聯合檢測診斷的靈敏度顯著高于單獨AFP,也高于GNB4和Riplet基因甲基化單獨診斷的靈敏度;同時,GNB4基因甲基化診斷的靈敏度較Riplet基因甲基化高。聯合年齡、性別、AFP、GNB4和Riplet基因甲基化的診斷靈敏度最高,達到93.6%。各檢測指標及組合診斷模型中,AFP的特異度94.3%相對稍低一點,其余特異度均較高,且基本無差異。

本研究因時間有限,納入研究的原發性肝癌患者數量不夠多,其他納入研究的惡性腫瘤種類及患者數量均有限,存在一定局限,后續可擴大樣本量進一步驗證。對于原發性肝癌術后患者,本研究在手術3 d后采集患者血液,未能做到術后連續監測AFP、GNB4和Riplet基因甲基化水平的變化,且因樣本量較少未做更多研究和探討,后續可進一步做補充實驗。