IL-1Ra基因多態(tài)性與無(wú)癥狀細(xì)菌性陰道病自然轉(zhuǎn)歸關(guān)系的研究

張 瑞,高佳惠子,董翰宇,李 昶,尹海旭

無(wú)癥狀性細(xì)菌性陰道病(asymptomatic bacterial vaginosis,aBV)是臨床最常見(jiàn)的一種陰道微生態(tài)失衡狀態(tài),其微生態(tài)學(xué)特征與細(xì)菌性陰道病相同[1-2]。研究[2]表明,aBV與多種不良結(jié)局密切相關(guān),然而臨床治療面臨的最大困境是高復(fù)發(fā)率,缺乏獲得長(zhǎng)久療效的策略。前期研究[1]的結(jié)果提示,應(yīng)該深入研究影響aBV結(jié)局的影響因素,探索根據(jù)不同特征將aBV患者進(jìn)行分組管理和干預(yù)以獲得良好臨床轉(zhuǎn)歸的可能性。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵物質(zhì)[3]。IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra)能競(jìng)爭(zhēng)性地與IL-1β受體結(jié)合,從而阻斷IL-1β的生物效應(yīng),參與局部免疫調(diào)控[4]。IL-1Ra基因第2內(nèi)含子的多態(tài)性導(dǎo)致IL-1Ra有5個(gè)等位基因,其中等位基因A2與IL-1β的反應(yīng)遲鈍有關(guān),近而影響正常免疫反應(yīng)[5]。該研究將探討等位基因A2與aBV不同結(jié)局之間的關(guān)系,為探討分組干預(yù)管理、獲得良好臨床轉(zhuǎn)歸提供基礎(chǔ)性信息。

1 材料與方法

1.1 病例資料aBV患者納入標(biāo)準(zhǔn)：從2016年9月至2019年1月在北京大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心體檢人群中篩選年齡18～45歲,無(wú)自覺(jué)癥狀且陰道微生態(tài)分析Nugent評(píng)分大于6分的育齡期女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 妊娠、哺乳期;② 4月內(nèi)用藥者(抗生素、抗真菌藥、避孕藥等);③ 有其它疾病需要治療者;④ 婦科檢查發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性體征者;⑤ 依從性不好;⑥ 下列任何一項(xiàng)影響：衣原體、淋球菌、AV、滴蟲(chóng)和假絲酵母菌。該研究獲得北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有志愿者均自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本收集

1.2.1陰道灌洗液標(biāo)本 做婦科檢查時(shí),取膀胱截石位,打開(kāi)窺器,暴露陰道,用10 ml無(wú)菌生理鹽水沖洗陰道壁中段,吸取并收集5 ml灌洗液,于4 ℃離心機(jī)6 500 r/min離心5 min,取上清液保存于冰箱(-80 ℃)備用。

1.2.2血液標(biāo)本收集 患者的血樣標(biāo)本均來(lái)自其體檢血液學(xué)檢測(cè)時(shí)的剩余標(biāo)本。

1.3 臨床隨訪研究終點(diǎn)為4個(gè)月,根據(jù)癥狀及微生態(tài)學(xué)分析,將所有志愿者的結(jié)局劃分為3種：自愈、進(jìn)展及無(wú)明顯改變[1]。

1.4 基因分型檢測(cè)[6]IL-1Ra基因多態(tài)性采用PCR擴(kuò)增含有第2內(nèi)含子基因片段的方法來(lái)分析。IL-1Ra第2內(nèi)含子中有86 bp重復(fù)單元,能擴(kuò)增出412、240、498、326、584 bp的片段,分別代表等位基因IL-1Ra-1(A1)、IL-1Ra-2(A2)、IL-1Ra-3(A3)、IL-1Ra-4(A4)、IL-1Ra-5(A5)。引物序列：正向5′-CTCAGCAACACTCCTAT-3′,反向5′-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3′。采用25 μl反應(yīng)體系,含有PCR Master Mix(Promega)、DNA模板、正反向引物各1 ml。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)0.1%溴化乙錠染色后在分析儀上檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 陰道分泌物中IL-1β和IL-1Ra濃度的檢測(cè)IL-1β和IL-1Ra的檢測(cè)采用ELISA試劑盒(Abcam,ab303763, ab211650)檢測(cè),操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本收集情況該研究共納入1 014例aBV患者,其中984例完成該研究的所有隨訪。13例患者凍存的標(biāo)本在進(jìn)行IL-1Ra基因多態(tài)性、IL-1β和IL-1Ra檢測(cè)時(shí)沒(méi)有獲得數(shù)據(jù)結(jié)果。共有971例患者的檢測(cè)結(jié)果納入本研究。按照臨床轉(zhuǎn)歸,971例患者分為：自愈40例,病情進(jìn)展430例,病情無(wú)明顯變化501例。見(jiàn)表1。

2.2 IL-1Ra基因多態(tài)性如表2所示,本研究中的971例aBV患者中,檢測(cè)到的基因型有A1/A1、A1/A2和A2/A23種,其中主流人群的基因型在各組均為A1/A1,最少見(jiàn)的基因型均為A2/A2,未發(fā)現(xiàn)少見(jiàn)類(lèi)型的基因型女性。2個(gè)等位基因在3種結(jié)局的人群中表現(xiàn)頻率存在一定差異。其自愈組A2等位基因的陽(yáng)性頻率最低,與進(jìn)展組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與無(wú)變化組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組IL-1Ra基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

2.3 陰道分泌物中IL-1β和IL-1Ra的含量所有標(biāo)本中均能檢測(cè)到IL-1β和IL-1Ra,其中自愈組的IL-1β水平高于進(jìn)展組(P<0.05),而自愈組的IL-1Ra水平低于進(jìn)展組(P<0.05)。在等位基因A2攜帶時(shí),IL-1Ra的水平較等位基因不攜帶時(shí)更高,但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 IL-1β和IL-1Ra在各組的含量

3 討論

aBV是臨床工作中非常常見(jiàn)的一種女性生殖系統(tǒng)異常狀態(tài),其微生態(tài)學(xué)特征與細(xì)菌性陰道病一樣,但是缺乏臨床癥狀。研究[7-8]表明,aBV患者更易被人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續(xù)感染,而高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的最主要因素。aBV與人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、淋球菌、衣原體和滴蟲(chóng)感染明顯相關(guān)。另外,aBV能導(dǎo)致盆腔炎、不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破及多種不良結(jié)局,嚴(yán)重影響母兒健康[9]。由于aBV具有隱蔽性,其巨大的危害常常被大家忽略。aBV患者無(wú)自覺(jué)癥狀,很難被發(fā)現(xiàn)和確診。隨著社會(huì)的發(fā)展、人民生活水平的提高,逐步推廣的健康體檢,讓越來(lái)越多的aBV患者被發(fā)現(xiàn)和診斷。根據(jù)課題組前期的研究[1]結(jié)果,如何將aBV患者人群按照一定的特征進(jìn)行分類(lèi)之后,再實(shí)施不同的管理和干預(yù)策略,可能是一個(gè)有意義的探索方向。

IL-1β是一個(gè)主要的前炎癥因子,能誘導(dǎo)許多細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的合成,參與免疫反應(yīng)過(guò)程[10]。IL-1Ra是個(gè)天然的IL-1β效應(yīng)抑制劑,能夠通過(guò)一定的機(jī)制抑制IL-1β的反應(yīng),調(diào)控IL-1β介導(dǎo)的免疫反應(yīng),多數(shù)情況下,IL-1Ra抑制了IL-1β產(chǎn)生的過(guò)渡免疫反應(yīng),保護(hù)正常的組織結(jié)構(gòu)免受免疫反應(yīng)的破壞[10]。研究[3,10]表明,革蘭陰性短桿菌和陰道加德納菌能刺激IL-1β和IL-1Ra基因的表達(dá)。陰道菌群異常和細(xì)菌性陰道病時(shí),IL-1β和IL-1Ra均會(huì)不同程度升高[11]。IL-1Ra的編碼基因第2內(nèi)含子存在多態(tài)性,有5種不同重復(fù)組合等位基因(包括IL-1RaA1、IL-1RaA2、IL-1RaA3、IL-1RaA4和IL-1RaA5),各等位基因在不同人群中的分布存在差別。在中國(guó)人群中IL-1RaA1發(fā)生頻率最高,IL-1RaA2次之,其它類(lèi)型及其少見(jiàn)[12]。不同的基因型對(duì)陰道菌群的反應(yīng)、對(duì)IL-1β的調(diào)控效力可能存在差別[13]。該研究首次探討了IL-1Ra基因第2內(nèi)含子多態(tài)性與aBV患者自然結(jié)局的關(guān)系。結(jié)果顯示,aBV患者中,A1/A1是主流的基因型,占據(jù)人群的68.5%～87.5%,而A2/A2基因型比例最低,僅占人群的2.5%～11.4%。其中等位基因A1的比例78.5%～92.5%,而等位基因A2的比例7.5%～21.5%。這與中國(guó)人群中基因多態(tài)性的分布特征一致[14]。最重要的是A2等位基因的比例在自愈組和病情進(jìn)展組存在顯著差異,這提示A2等位基因可能是導(dǎo)致aBV患者出現(xiàn)不同結(jié)局的重要因素之一。

IL-1Ra的水平從一定程度上反應(yīng)了IL-1Ra基因表達(dá)的情況。本研究顯示IL-1β和IL-1Ra水平在自愈組和進(jìn)展組均存在顯著差異,這提示這兩個(gè)因子可能與aBV的結(jié)局存在相關(guān)性。在自愈組和進(jìn)展組,IL-1β和IL-1Ra呈反向相關(guān),這提示了IL-1Ra對(duì)IL-1β可能存在負(fù)性調(diào)控。而當(dāng)A2等位基因存在時(shí),IL-1LRa的水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化時(shí),IL-1β的水平在兩組間也有明顯差異,這提示除了IL-1Ra能夠調(diào)控IL-1β之外,可能存在其它機(jī)制也參與了IL-1β的調(diào)控。