蟾毒靈抑制M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)直腸癌遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

唐東豪,陳進(jìn)寶,賈琳琳,沈東曉,尚 靖,馮月嬌,盧佳豪,肖增友,何鈺潔,王 杰

結(jié)直腸癌 (colorectal cancer, CRC)是世界第三大常見的惡性腫瘤,大多數(shù)結(jié)直腸癌患者的死亡是由于腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟。全球范圍內(nèi),每年診斷出約 140 萬例新增結(jié)直腸癌病例,約 25% 的患者在診斷時(shí)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移[1]。 控制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移對(duì)于改善預(yù)后至關(guān)重要。很多報(bào)道[2]表明腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的重要因素。巨噬細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的主要成分,其中M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)等,通常以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展為導(dǎo)向[3]。IL-6是一種重要的促炎細(xì)胞因子,高表達(dá)的 IL-6 與 CRC 的不良預(yù)后相關(guān)[4]。有研究[5]表明M2型巨噬細(xì)胞釋放IL-6可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。越來越多研究[6]表明蛋白激酶B (threonine-specific protein kinase, AKT)/ 磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphoinositide 3-Kinase, PI3K)是腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一。但關(guān)于M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的IL-6對(duì)于AKT/PI3K信號(hào)通路的激活報(bào)道還比較少[7]。蟾毒靈(bufalin,BU)是臨床用藥華蟾素的主要活性成分,有促腫瘤細(xì)胞凋亡,抗血管生成,抑制轉(zhuǎn)移的作用[8]。該文旨在研究BU對(duì)于M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人急性白血病單核細(xì)胞THP-1、結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株,從中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所購買。

1.2 試劑及耗材RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗、胰酶(Trypsin-EDTA)、胎牛血清購自美國Gibco公司;佛波酯(美國SIGMA公司);ELISA 試劑盒(BOSTER,武漢);蟾毒靈購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞、人急性白血病單核細(xì)胞THP-1均含有1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。取生長狀態(tài)良好(對(duì)數(shù)生長期)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 條件培養(yǎng)基(condition medium, CM)收集取對(duì)數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞鋪板于6 孔板,每孔種植1×106個(gè)細(xì)胞,加入IL- 4 和 IL-13。待分化為M2型巨噬細(xì)胞后棄去培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基添加2 ml/孔, 48 h后收取上清液,離心800 r/min,10 min,獲得CM。

1.5 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)提取細(xì)胞RNA根據(jù)艾科瑞生物試劑盒說明書去操作,逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒的說明書。PCR反應(yīng)組分：2×SYBR 5 μl Template 1μl,Primer F 0.2 μl, Primer R 0.2 μl RNase free water 3.6 μl;參照儀器操作手冊(cè)設(shè)置反應(yīng)條件。見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)HCT116到對(duì)數(shù)生長期,胰酶消化,計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/ml,100 μl細(xì)胞懸液加入到96孔板的每個(gè)孔中。第二天細(xì)胞貼壁后,去除培養(yǎng)基,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的BU或條件培養(yǎng)基處理,培養(yǎng)箱中孵育48 h。配制對(duì)CCK-8反應(yīng)液,具體條件為CCK-8 ∶無血清培養(yǎng)基=1 ∶9(避光條件下)。去掉原先孔中培養(yǎng)基,將100 μl 配制好的反應(yīng)液加入到每孔中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1～2 h。通過酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光值檢測(cè),一般為 450 nm波長處,進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞存活率,采用 Graphpad8軟件作圖。

1.7 單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化對(duì)人急性白血病單核細(xì)胞THP-1進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),接種 1×106個(gè)單核細(xì)胞于6孔板中,加入 IL- 4 和 IL-13 刺激。IL- 4 和 IL-13 濃度均為 20 μg/ml。確定 IL- 4 和 IL-13 刺激時(shí)間2 d 時(shí)用ELISA、熒光定量PCR檢測(cè)表面分子標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示,單核細(xì)胞表面IL-10 和 TFG-β的表達(dá)在 IL- 4 和 IL-13 刺激2 d 后明顯增加。

1.8 ELISA實(shí)驗(yàn)根據(jù)ELISA試劑盒的說明,用人源IL10、 TGF-β的試劑盒,測(cè)出巨噬細(xì)胞TGF-β、IL10的水平。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn)棄掉培養(yǎng)皿的上清液,加入PBS溶液清洗,加入裂解液,于冰上靜置15 min后,使用細(xì)胞刮刀收取懸液放入EP管,使用超聲振蕩后進(jìn)行定量,再進(jìn)行金屬浴。之后上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜。封閉后將抗體進(jìn)行稀釋Beta Actin(鼠 1 ∶3 000) 、PI3K(兔 1 ∶1 000) 、P-PI3K(兔 1 ∶1 000)、 AKT(兔 1 ∶1 000) 、P-AKT(兔1 ∶2 000) 、MMP9(兔 1 ∶1 000)、MMP2(兔1 ∶1 000)、E-Cadherin(兔 1 ∶1 000)、 N-Cadherin(兔 1 ∶1 000)。4 ℃過夜,次日用二抗孵育1 h,最后去顯影。

1.10 劃痕實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞消化后離心,按照1×106個(gè)/ml放入6孔板中,待細(xì)胞貼壁占據(jù)90%面積。取6孔板內(nèi)最大直徑,用200 μl槍頭沿著直尺快速劃下,清洗2次,在倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.11 Transwell實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞制成懸液,并計(jì)數(shù)2.5×105個(gè)/ml。在24孔板的下方加入700 μl含有20%FBS的培養(yǎng)基,用槍頭將小室放入培養(yǎng)基上方。加入300 μl細(xì)胞懸液到小室。2 d后,將上清液吸出,在空白孔內(nèi)加入500 μl結(jié)晶紫,將小室放入后清洗3次,清洗完畢使用固定液固定20 min,用棉簽輕輕擦拭掉小室內(nèi)壁的細(xì)胞,在倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 M2型巨噬細(xì)胞的鑒定THP-1 細(xì)胞被 PMA 誘導(dǎo) 48 h成為 M0型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages, TAM),然后被 IL-4 和 IL-13 誘導(dǎo) 48 h成為 M2-TAM,可以觀察到細(xì)胞由圓餅形狀轉(zhuǎn)變成梭形(圖1A、B),RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá),結(jié)果表明,與M0巨噬細(xì)胞相比,誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物IL10、TGF-β升高(圖1C,tIL-10=19.39,P<0.01;tTGF-β=17.13,P<0.01)。此外,ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清液中M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物也發(fā)生了同樣改變。(圖1D,tIL-10=42.56,P<0.01;tTGF-β=16.87,P<0.001)。

圖1 M2型巨噬細(xì)胞的鑒定

圖2 兩組細(xì)胞分泌IL-6水平

2.2 M2型巨噬細(xì)胞的IL-6分泌在腫瘤微環(huán)境中,M2型巨噬細(xì)胞通常會(huì)分泌IL-6, ELISA實(shí)驗(yàn)表明了HCT116和M2型巨噬細(xì)胞的IL-6水平(圖3,t=42.69,P<0.05)。

圖3 M2型巨噬細(xì)胞上清液通過AKT/PI3K磷酸化促進(jìn)HCT116遷移

2.3 M2型巨噬細(xì)胞上清液促進(jìn)HCT116遷移,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞AKT/PI3K磷酸化表達(dá)將HCT116分為兩組,一組普通培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照,另外一組加M2型巨噬細(xì)胞上清液培養(yǎng)。Transwell實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示M2型巨噬細(xì)胞上清液培養(yǎng)的HCT116遷移能力增強(qiáng)(圖3A、B,t劃痕=113.8,P<0.01;tTranswell=30.13,P<0.05),Western blot實(shí)驗(yàn)顯示條件培養(yǎng)基作用于HCT116后 MMP9、MMP2、N-Cadherin 蛋白水平上升,E-Cadherin蛋白水平下降(圖3C)。MMP9、MMP2、N-Cadherin mRNA水平上升,E-Cadherin mRNA水平下降(圖3D,tMMP9=9.356,P<0.05;tMMP2=11.45,P<0.01;tE-Cadherin=12.00,P<0.05;tN-Cadherin=5.973)。此外,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示條件培養(yǎng)基作用于HCT116激活了AKT/PI3K磷酸化表達(dá)。這部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了M2型巨噬細(xì)胞上清液可以促進(jìn)HCT116的遷移,在這個(gè)過程中激活了AKT/PI3K的磷酸化(圖3E)。

2.4 BU對(duì)HCT116細(xì)胞活性的增殖影響CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察BU對(duì)HCT116細(xì)胞作用48 h后增殖活性的影響,BU對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖活性具有抑制作用,且有濃度依賴性,本實(shí)驗(yàn)采用BU的非殺傷濃度12.5 nmol/L (IC30)(圖4,F=922.1,P<0.001)。

圖4 BU對(duì)HCT116的增殖活性影響

2.5 BU可以調(diào)節(jié)AKT/PI3K蛋白磷酸化抑制HCT116遷移能力將HCT116分為2組,一組加M2型巨噬細(xì)胞上清液作為對(duì)照,另外一組M2型巨噬細(xì)胞上清液加BU(12.5 nmol/L)培養(yǎng)。Transwell實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示BU可以抑制M2型巨噬細(xì)胞上清液促進(jìn)HCT116遷移的效應(yīng)(圖5A、B,t劃痕=72.63,P<0.01;tTranswell=26.38,P<0.05),Western blot實(shí)驗(yàn)從蛋白水平驗(yàn)證BU可以減弱HCT116的上皮間質(zhì)化能力, MMP9、MMP2、N-Cadherin 蛋白水平降低,E-Cadherin蛋白水平上升(圖5C)。同時(shí)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)表明MMP9、MMP2、N-Cadherin 基因水平下降,E-Cadherin基因水平升高(圖5D,tMMP9=100.01,P<0.000 1;tMMP2=11.45,P<0.01;tE-Cadherin=32.98,P<0.001;tN-Cadherin=5.973,P<0.01;)。設(shè)置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)、巨噬細(xì)胞上清液、M2型巨噬細(xì)胞上清液加BU組驗(yàn)證BU抑制AKT/PI3K的磷酸化的作用。這部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明BU可以抑制HCT116遷移,抑制AKT/PI3K磷酸化。(圖5E)。

圖5 BU通過AKT/PI3K磷酸化抑制HCT116遷移

3 討論

CRC是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,CRC作為一種常見的惡性腫瘤,雖然治療上有很大的進(jìn)步,但CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是患者病死率居高不下的罪魁禍?zhǔn)住Ｄ[瘤微環(huán)境主要是指成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞之間相互影響的場(chǎng)所,是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的局部病理環(huán)境[9]。大量研究顯示,腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與M2型巨噬細(xì)胞等腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞通常可以通過重塑其腫瘤微環(huán)境,從而避開免疫系統(tǒng),侵入底層間質(zhì),在惡劣的循環(huán)環(huán)境中存活,滲入其他人體的器官,塑造適合腫瘤生長的微環(huán)境,最后,長成臨床可檢測(cè)的轉(zhuǎn)移病灶,而M2型巨噬細(xì)胞就參與了這一過程[10]。BU是我國已臨床使用的華蟾素注射液的主要功效成分,目前臨床上已經(jīng)使用華蟾素來全身治療多種腫瘤[11]。 研究[12]顯示BU在抑制遷移和侵襲、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成等抗腫瘤作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

本研究中,將THP-1用試劑誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞, Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力增加。IL-6通過其受體 IL-6R對(duì)許多細(xì)胞發(fā)揮作用,在維持慢性炎癥中起主要作用[13],此外,有研究[14]表明 IL-6作為一種促癌因子,促進(jìn)腫瘤發(fā)展,并有助于CRC中慢性炎性和致瘤性微環(huán)境的形成。另外有研究[15]報(bào)道IL-6參與了AKT/PI3K信號(hào)通路的磷酸化過程 。ELISA實(shí)驗(yàn)顯示M2型巨噬細(xì)胞分泌IL-6水平顯著高于HCT116。Western blot實(shí)驗(yàn)中,M2巨噬細(xì)胞上清液可以激活HCT116中AKT/PI3K蛋白磷酸化,促進(jìn)HCT116遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。將BU加入M2巨噬細(xì)胞上清液培養(yǎng)HCT116,結(jié)果BU逆轉(zhuǎn)了M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并且減少了AKT/PI3K蛋白磷酸化。

綜上所述,M2型巨噬細(xì)胞可以通過分泌IL-6使結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并促進(jìn)AKT/PI3K通路磷酸化,而BU能夠抑制M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的 HCT116 AKT/PI3K通路磷酸化。