微小RNA-15a表達與妊娠期糖尿病患者胎兒心臟畸形的關系分析

王 彥,周 淑,于 萍,余 建,張瑞琪

(1.四川大學華西第二醫院 中國出生缺陷監測中心,四川 成都,610000;2.四川錦欣婦女兒童醫院 產科,四川 成都,610000)

妊娠期糖尿病(GDM)是妊娠期間常見并發癥,全球GDM的發生率為2%～38%[1]。GDM患者母體血糖升高可導致胎兒血糖升高,容易誘發子代心臟發育異常,從而導致胎兒心臟畸形,嚴重危害胎兒和母體健康,加重家庭和社會經濟負擔[2]。臨床采用孕期超聲篩查胎兒心臟畸形,但因胎兒心臟病理解剖相對復雜,搏動速度過快,導致超聲檢查容易出現漏診和誤診現象,且超聲檢查主要是用于診斷已發生的胎兒心臟畸形,無法提前篩選出存在高風險的胎兒[3]。因此,尋找可靠有效的生物標志物,及早發現高風險胎兒并采取預防手段,對降低新生兒出生缺陷,提高出生人口質量具有重要意義。微小RNA(miRNA)在各種疾病的病理生理過程中均發揮重要作用。研究[4]報道miRNA與GDM的發病機制有關,并可作為診斷新生兒出生缺陷的生物標志物。研究[5]發現miR-15a過表達可參與調控心臟纖維化的發生發展,可作為診斷心肌纖維化的生物標志物和治療靶點。血清miR-15a異常高表達與2型糖尿病的疾病進展密切相關[6]。但miR-15a在GDM患者血清中的表達情況及其與胎兒心臟畸形的關系尚鮮有文獻報道。本研究通過探討GDM患者血清miR-15a表達與胎兒心臟畸形的關系,旨在為臨床早期防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準:① 疾病組均符合GDM相關診斷標準[7],空腹血糖≥5.1 mmol/L,若空腹血糖在4.4～5.1 mmol/L,則行75 g口服葡萄糖耐量試驗; ②健康組均經孕檢確診身體健康; ③ 均為自然受孕、單胎妊娠者; ③ 確診孕周≥24周者; ④ 均意向在本院進行后續產檢、生產者; ⑤ 均簽署知情同意書者。

排除標準:① 孕早期發現胎兒心臟畸形流產者; ② 孕期接觸過藥物、輻射、寵物、裝修、酒精、吸煙等致畸因素者; ③ 既往存在胎兒畸形者; ④ 合并其他妊娠期疾病者; ⑤ 嚴重心、肝、腎等功能障礙者,精神認知障礙者; ⑥ 合并惡性腫瘤者; ⑦ 子宮畸形、胎位異常、產道異常、宮內感染者; ⑧ 血液、免疫系統疾病者; ⑨ 孕期有呼吸道感染疾病史患者; ⑩ 甲狀腺、腎上腺疾病者。

脫落標準:① 依從性差者; ② 主動退出者; ③ 失訪者; ④ 對于引產或死產的胎兒家屬不同意進行尸體解剖者。

1.2 方法

血清miR-15a的檢測方法:疾病組于治療前、健康組于體檢當天均采集清晨空腹靜脈血5 mL,置于無菌抗凝管,4 000轉/min離心10 min分離血清,取上清液置于-80 ℃冰箱中保存待測。采用TRIzol裂解法提取總RNA,并檢測RNA的濃度和純度(紫外分光光度計法)。根據逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)進行PCR擴增,PCR擴增條件:96 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、66 ℃ 30 s,71 ℃ 30 s,共40個循環,為減少誤差每個反應均重復3次以上,采用2-△△Ct方法計算miR-15a表達。miR-15a引物序列:正向引物5′-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3′,反向引物5′-GCCTCTAACATTGACAGC-3′; 內參U6正向引物5′-CCATGCTCTTCTACTCCT-3′,反向引物5′-CACTGATGTCGGTTAGTT-3′。

所有患者均進行跟蹤隨訪至妊娠結束,其中針對引產或死產的胎兒,經家屬同意后進行尸體解剖,以確診胎兒心臟畸形; 持續妊娠者,在胎兒娩出后,通過超聲檢查和實驗室檢查明確心臟情況。根據GDM患者是否發生胎兒心臟畸形將其分為畸形組和非畸形組。

收集患者的一般資料,包括年齡、確診孕周、孕前體質量指數、文化程度、不良孕產史(不明原因的自然流產、胚胎停育、產后大出血、難產、死胎和死產)、產婦類型、血糖控制情況(空腹血糖≤5.3 mmol/L、餐后2 h血糖≤6.7 mmol/L記為血糖控制良好,空腹血糖>5.3 mmol/L、餐后2 h血糖>6.7 mmol/L記為血糖控制不良)、妊娠早期是否規律服用葉酸和鈣鐵等。另根據確診孕周不同,將疾病組患者分為A組(565例,確診孕周≤32周)和B組(270例,確診孕周>32周)[8]; 根據空腹血糖升高程度將血糖控制不良的190例患者分為C組(105例,空腹血糖5.3～6.1 mmol/L)和D組(85例,空腹血糖≥6.1 mmol/L)[9]。

1.3 觀察指標

比較疾病組和健康組血清miR-15a表達水平; 統計胎兒心臟畸形的發生情況,并比較畸形組和非畸形組血清miR-15a表達水平及一般資料。比較不同確診孕周患者血清miR-15a表達水平與胎兒心臟畸形發生率。比較不同空腹血糖升高程度患者血清miR-15a表達水平與胎兒心臟畸形發生率。分析GDM患者發生胎兒心臟畸形的影響因素。分析血清miR-15a表達水平對GDM患者胎兒心臟畸形的預測價值。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 疾病組和健康組血清miR-15a表達

疾病組血清miR-15a表達水平為(2.07±0.48),高于健康組的1.00,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 畸形組和非畸形組血清miR-15a表達及一般資料比較

835例GDM患者中發生胎兒心臟畸形24例,發生率為2.87%(24/835)。畸形組和非畸形組確診孕周、文化程度、產婦類型、妊娠早期規律服用鈣鐵比較,差異無統計學意義(P>0.05); 畸形組血清miR-15a表達水平、年齡、孕前體質量指數和不良孕產史、血糖控制不良占比均高于非畸形組,妊娠早期規律服用葉酸占比低于非畸形組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 畸形組和非畸形組血清miR-15a表達及一般資料比較

2.3 A組和B組的血清miR-15a表達與胎兒心臟畸形發生率比較

A組、B組的血清miR-15a表達及胎兒心臟畸形發生率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 A組和B組血清miR-15a表達與胎兒心臟畸形發生率比較

2.4 C組和D組血清miR-15a表達與胎兒心臟畸形發生率比較

D組的血清miR-15a表達水平、胎兒心臟畸形發生率高于C組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 C組和D組血清miR-15a表達與胎兒心臟畸形發生率比較

2.5 GDM患者胎兒心臟畸形的多因素分析

將上述表2中有統計學差異的臨床資料進行賦值,年齡(實測值)、孕前體質量指數(實測值)、不良孕產史(有=1,無=0)、血糖控制情況(良好=0,不良=1)、妊娠早期規律服用葉酸(有=0,無=1)、血清miR-15a表達(實測值)作為自變量,以胎兒心臟畸形作為因變量(發生=1,未發生=0)。進行多因素Logistic回歸分析法(逐步向前法)結果顯示,血清miR-15a表達、年齡、血糖控制不佳均是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響GDM患者胎兒心臟畸形的多因素分析

2.6 血清miR-15a表達對GDM患者胎兒心臟畸形的預測價值

ROC曲線分析結果顯示,血清miR-15a表達預測GDM患者胎兒心臟畸形的Cut-off值、靈敏度、特異度、AUC分別為2.34、87.50%、73.24%、0.827(95%CI:0.799～0.852)。見圖1。

圖1 血清miR-15a表達對GDM患者胎兒心臟畸形的預測ROC曲線

3 討 論

GDM是導致子代畸形的常見母體疾病,胎兒心臟畸形是子代畸形中比較常見的一種先天性畸形疾病[10]。近年來,隨著人們生活水平提高和飲食結構的改變,GDM發病率呈逐年上升趨勢,胎兒心臟畸形的發生率也明顯增加,其已經成為導致死胎和嬰兒死亡的主要原因[11]。本研究結果顯示,835例GDM患者中發生胎兒心臟畸形24例,總發生率為2.87%,稍高于張亮等[12]報道的2.17%,這可能與選取樣本的個體差異性有關,但均證實了GDM患者胎兒心臟畸形的發生率較高。因此,積極探尋GDM患者胎兒心臟畸形影響因素,對指導臨床制定干預對策,預防胎兒心臟畸形、降低新生兒死亡率具有重要意義。

本研究結果顯示,疾病組血清miR-15a表達高于健康組,提示血清miR-15a表達可能與GDM的發生發展密切相關。miRNA可通過抑制或降解調控基因表達,參與細胞增殖、分化、死亡、糖脂代謝等多種生物學過程,與GDM的發病機制和胰島素抵抗之間存緊密聯系。miR-15a表達在糖尿病患者血漿中異常升高,且與病情嚴重程度相關,其在胰島β細胞分泌胰島素的過程中起到重要作用[13]。研究[14]報道,GDM患者血清miR-15a表達高于健康孕婦,本研究報道與之相符。研究[15]發現,GDM患者骨骼肌中miR-15a過表達能夠改變胰島素信號通路蛋白表達,從而影響胰島素分泌。由此可見,miR-15a表達可能參與了GDM的發生發展。本研究結果顯示,畸形組血清miR-15a表達高于非畸形組,且經多因素Logistic回歸分析法分析顯示,血清miR-15a高表達是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素,提示血清miR-15a表達與GDM患者胎兒心臟畸形的發生密切相關。miRNA參與胚胎心臟的發育過程,在心臟形態形成、心肌細胞生長分化的過程中有至關重要的作用。研究[16]發現,胎兒臍帶血中的miRNA可作為先天性心臟病產前篩查工具。miR-15a過表達可通過誘導氧化應激,影響心肌細胞的增殖與分化,導致心肌纖維肥大、增生、排列紊亂,血管內皮生成和心臟發育規律異常,進一步導致法洛四聯癥、室間隔缺損等胎兒心臟異常情況出現。研究[17]發現,下調miR-15a能夠激活2型糖尿病心臟中的纖維化信號,這可能成為治療或預防2型糖尿病誘導的心臟纖維化重塑的潛在靶點。另有研究[18]指出,通過抑制miR-15a-5p表達可抑制細胞凋亡,從而達到保護心肌的目的。因此,GDM患者血清miR-15a異常高表達時,可能影響胎兒心臟發育,導致胎兒心臟畸形發生。本研究結果發現,D組血清miR-15a表達與胎兒心臟畸形發生率均高于C組,說明空腹血糖水平升高程度越高,患者病情越嚴重,血清miR-15a表達越高,胎兒心臟畸形發生率也就越高。同時本研究還發現,不同確診孕周患者血清miR-15a表達與胎兒心臟畸形發生率均基本一致,這可能是因為中晚期孕婦更加注重自身和胎兒身體健康,嚴格按時體檢,能夠及時發現GDM并給予控制血糖水平,從而降低胎兒心臟畸形發生率。

本研究通過ROC曲線進一步分析顯示,血清miR-15a表達預測GDM患者胎兒心臟畸形的靈敏度、特異度、AUC分別為87.50%、73.24%、0.827,表明血清miR-15a表達對GDM患者胎兒心臟畸形具有一定的預測價值。故建議GDM患者定期檢測血清miR-15a表達,以指導臨床及時采取措施干預,降低胎兒心臟畸形的發生風險。本研究結果發現,年齡、血糖控制不良是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素。高齡GDM患者卵巢功能和卵巢質量下降,影響卵巢細胞正常分裂,染色體異常概率增加,容易增加胎兒心臟畸形的發生風險。研究[19]報道,年齡≥35歲是胎兒先天性心臟病的高危因素。血糖控制不良的GDM患者高血糖水平能夠通過胎盤破壞卵黃囊的發育,影響胚胎的增殖分化,導致胎兒心臟氧化應激損傷或生長發育異常,從而增加胎兒心臟畸形的發生率。既往研究[20]報道,GDM孕婦血糖控制情況與胎兒畸形發生率有關。此外,本研究結果顯示,畸形組孕前體質量指數、不良孕產史雖均高于非畸形組,妊娠早期規律服用葉酸雖低于非畸形組,但上述因素均并非胎兒心臟畸形的危險因素,與既往研究報道[21]不一致,原因可能是:近年來隨著人們生活水平和醫療保健水平提高,孕產婦及其家屬孕期健康認知水平也逐漸增強,產前檢查、孕期積極鍛煉、規律服用葉酸等的依從性均顯著增強,且GDM患者存在個體差異,均可影響研究結果。本研究存在一定的不足之處:首先,血清miR-15a表達與GDM患者胎兒心臟畸形的具體發病機制尚為完全闡明; 其次,如何利用該指標指導臨床治療方案的制定也有待商榷。今后可在此基礎上進行更深入的探討。

綜上所述,GDM患者血清miR-15a異常高表達,其表達升高可增加胎兒心臟畸形的發生風險,且對GDM患者胎兒心臟畸形具有一定的預測價值。年齡、血糖控制不佳是GDM患者胎兒心臟畸形的影響因素,建議臨床根據以上因素進行早期預防,以降低GDM患者胎兒心臟畸形的發生風險。miR-15a表達在GDM患者血清中異常升高,在胎兒心臟畸形患者血清中表達更高,且與GDM患者胎兒心臟畸形的發生密切相關,并對該不良事件具有一定預測價值,可幫助臨床早期篩查胎兒心臟畸形,為臨床治療提供重要指導。