茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因預(yù)測

張力嵐 楊 軍 王讓劍,*

茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因預(yù)測

張力嵐1,2楊 軍1,2王讓劍1,2,*

1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所, 福建福州 350013;2國家茶樹改良中心福建分中心, 福建福州 350013

橙花叔醇與芳樟醇是廣泛分布于植物中的揮發(fā)性萜烯醇類化合物, 在茶樹新梢中主要以櫻草糖苷形式存在, 提高其含量對茶葉香氣品質(zhì)改良具有重要意義。為揭示茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷的遺傳機(jī)制, 本研究以169個(gè)茶樹自然雜交后代單株為關(guān)聯(lián)群體, 利用均勻分布在茶樹染色體上的675,245個(gè)SNP標(biāo)記, 對3個(gè)年份下茶樹新梢中橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)。結(jié)果表明, 橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量的表型變異系數(shù)為60.83%～80.08%, 廣義遺傳力分別為51.29%與61.87%, 基本符合正態(tài)分布, 具有典型的數(shù)量性狀遺傳特征。全基因組關(guān)聯(lián)分析共檢測到50個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn), 各位點(diǎn)分別對橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量變化的貢獻(xiàn)率均超過20%, 其中橙花叔醇櫻草糖苷含量(nerolidol primeveroside content, NPC)變化位點(diǎn)最大貢獻(xiàn)率為38.73%, 芳樟醇櫻草糖苷含量(linalool primeveroside content, LPC)變化位點(diǎn)最大貢獻(xiàn)率為39.07%。通過等位變異效應(yīng)分析, 鑒定出4個(gè)主效SNP位點(diǎn)及其優(yōu)異等位變異, 并發(fā)現(xiàn)1個(gè)可同時(shí)調(diào)控NPC和LPC的一因多效位點(diǎn)。結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道和基因的功能注釋, 篩選出每個(gè)顯著位點(diǎn)置信區(qū)間內(nèi)最有可能的候選基因共59個(gè), 主要涉及茶樹的糖類代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、萜烯類生物合成等多個(gè)生物學(xué)過程, 其中26個(gè)基因在適制綠茶品種和適制烏龍茶品種單芽中的表達(dá)水平存在顯著差異。本研究為深入解析茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量的遺傳機(jī)制提供了新的信息, 為加速培育高香型優(yōu)異茶樹新品種提供了重要的基因資源。

茶樹; 橙花叔醇櫻草糖苷; 芳樟醇櫻草糖苷; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 候選基因

茶樹是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一, 2021年在全球的種植面積約為525萬公頃, 產(chǎn)量達(dá)到2819萬噸(http://faostat.fao.org/)。香氣是茶樹重要的感官品質(zhì)之一, 很大程度影響茶葉的市場價(jià)值和大眾消費(fèi)者的購買欲望。因此, 香氣品質(zhì)的優(yōu)劣一直都是茶樹育種工作者最關(guān)注的性狀之一。闡明茶樹香氣品質(zhì)相關(guān)性狀的合成調(diào)控機(jī)理, 對提高茶樹育種的效率和準(zhǔn)確性、推動(dòng)茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要的研究意義。

橙花叔醇屬于倍半萜烯醇, 有水果百合、花木香和木香的香韻。芳樟醇又名沉香醇, 屬單萜烯醇類, 有玉蘭或百合花的香氣。橙花叔醇與芳樟醇在茶樹體內(nèi)主要以櫻草糖苷(二糖糖苷)的形式存在, 且二者均為茶葉中極具代表性的香氣成分, 對茶葉香氣的形成有重要的作用[1]。Liu等[2]通過揭示茶樹中橙花叔醇與芳樟醇的生物合成調(diào)控機(jī)制, 為改善茶葉香氣品質(zhì)提供了新的研究思路。Wei等[3]基于高通量SNP芯片, 定位到一個(gè)與綠茶特征香氣成分(E)-異丁香酚生物合成相關(guān)的強(qiáng)選擇位點(diǎn)。茶葉中關(guān)鍵呈香成分生物合成及其調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道, 為茶葉香氣品質(zhì)的提升提供了重要的研究基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。近年來, 利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association analysis, GWAS)技術(shù)進(jìn)行位點(diǎn)和基因挖掘已經(jīng)廣泛應(yīng)用在各類植物的香氣性狀研究中。在桃樹中, 對256份種質(zhì)資源成熟果實(shí)中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了測定, 基于全基因組關(guān)聯(lián)分析定位到一個(gè)編碼萜烯合成酶的基因, 該基因位于已報(bào)道的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)區(qū)域內(nèi), 且與芳樟醇的生物合成有關(guān)[4]。在西瓜中, 利用包括GWAS在內(nèi)的多組學(xué)技術(shù), 在4號(hào)染色體上挖掘到一個(gè)類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid clea-vage dioxygenase, CCD)基因, 該基因已被證實(shí)參與萜類揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds, VOCs)的合成與代謝[5]。在藍(lán)莓中, 研究人員對886份個(gè)體的17種VOCs進(jìn)行了測定, 通過GWAS關(guān)聯(lián)到6個(gè)與芳樟醇有關(guān)的基因, 8個(gè)與桉葉醇有關(guān)的基因[6]。

茶樹性狀遺傳背景十分復(fù)雜, 與香氣品質(zhì)相關(guān)的基礎(chǔ)研究一直是茶樹遺傳育種的難點(diǎn)和重點(diǎn)。迄今, 有關(guān)茶樹橙花叔醇櫻草糖苷含量(nerolidol primeveroside content, NPC)和芳樟醇櫻草糖苷含量(linalool primeveroside content, LPC)全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究報(bào)道較少, 遺傳機(jī)制尚不明晰。已經(jīng)定位克隆的位點(diǎn)或基因, 并不能完全解釋茶樹香氣品質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳變異, 其復(fù)雜的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究以169個(gè)不同遺傳背景的茶樹自然雜交后代單株作為關(guān)聯(lián)群體, 結(jié)合包含675,245個(gè)SNP標(biāo)記的簡化基因組測序數(shù)據(jù), 對NPC和LPC性狀展開全基因組關(guān)聯(lián)分析, 挖掘茶樹群體中調(diào)控NPC和LPC的重要位點(diǎn)及候選基因, 為解析茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量的遺傳機(jī)制, 推進(jìn)高香型茶樹新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為包含169個(gè)茶樹種質(zhì)的關(guān)聯(lián)群體, 為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所構(gòu)建的高香型優(yōu)異茶樹種質(zhì)FT516、FT104的自然雜交后代單株, 保存于福建省烏龍茶種質(zhì)資源圃內(nèi)(27°13′40″N, 119°32′11″E) (附表1)。其中FT516為黃觀音(♀)×鐵觀音(♂)雜交后代, FT104為毛蟹(♀)自然雜交后代。沙培從母樹上獲得的成熟種子, 2015年3月單株種植于田間, 株距0.5 m, 行距1.5 m, 每份種質(zhì)材料為單株種植, 田間管理措施相對一致。取相同生長環(huán)境下的已推廣品種‘福云6號(hào)’與‘悅茗香’的健康無損傷單芽, 通過轉(zhuǎn)錄組測序, 輔助篩選候選基因。其中, ‘福云6號(hào)’為適制綠茶品種, 新梢單芽中NPC和LPC較低, ‘悅茗香’為適制烏龍茶的高香型品種, 新梢單芽中NPC和LPC較高。

1.2 表型數(shù)據(jù)測定與分析

2018、2019和2020連續(xù)3年分別采摘群體內(nèi)各種質(zhì)春季新梢健康無損傷單芽, 每份材料確保有3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 用于測定橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷的含量。

稱取2 g嫩芽置于50 mL塑料離心管中(精確至0.01 g), 加入20 mL甲醇, 10,000轉(zhuǎn) min-1均質(zhì)2 min, 超聲20 min, 1960′離心5 min, 移取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)樣。

色譜條件: 流速0.3 mL min–1; 柱溫40℃; 樣品盤溫度15℃; 進(jìn)樣量2 μL; 流動(dòng)相A為0.1% (v/v)甲酸水溶液, 流動(dòng)相B為乙腈; 梯度洗脫條件為: 0～3 min, 10%B; 3～9 min, 25%B; 9～11 min, 40%B; 11～12 min, 90%B; 12.0～12.1 min, 90%B; 12.1～ 16.0 min, 10%B。

質(zhì)譜條件: 離子源為電噴霧離子源ESI; 負(fù)離子模式; 檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測; 大氣壓電離(API)氣體為氮?dú)?純度>95%, 壓力600～900 kPa); 碰撞氣體為高純氬; 界面電壓3.0 kV; 界面溫度300℃; 脫溶劑溫度250℃; 干燥氣10 L min–1, 霧化氣3 L min–1, 加熱氣10 L min–1, 熱塊溫度400℃。

稱取橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg, 用甲醇溶解并定容至10 mL, 即為1 mg mL–1的單標(biāo)儲(chǔ)備液, –20℃下貯存于密封的棕色玻璃瓶中, 用其配制成不同濃度梯度的橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣, 以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo), 定量離子峰面積為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并分別對待測種質(zhì)橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷進(jìn)行定量。

采用Microsoft Excel 2021, 對關(guān)聯(lián)群體的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。利用軟件SPSS 26.0, 進(jìn)行表型性狀的統(tǒng)計(jì)描述以及廣義遺傳力(2)的計(jì)算[7]。采用皮爾遜(Pearson)相關(guān)分析, 計(jì)算不同年份間茶樹新梢中各糖苷含量間的相關(guān)系數(shù)。

1.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)過III酶切茶樹的基因組DNA、酶切片段3￠端加A處理、連接Dual-index測序接頭、PCR擴(kuò)增純化以及目的片段文庫質(zhì)檢等一系列主要流程, 對待測群體的種質(zhì)資源進(jìn)行SLAF-seq測序(specific locus amplified fragment sequencing)。以上工作基于北京百邁客生物科技有限公司的Illumina HiSeq測序平臺(tái)完成。以舒茶早品種基因組序列[8]作參考, 對獲得的10,802,426個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)控篩選, 根據(jù)最小等位基因頻率(MAF)≥0.05, 缺失率(miss)≤0.2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾, 保留675,245個(gè)SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析[9]。

利用過濾質(zhì)控后的高質(zhì)量SNP標(biāo)記, 對關(guān)聯(lián)材料的群體結(jié)構(gòu)(值)和親緣關(guān)系(值)進(jìn)行了分析。使用軟件TASSEL 5.0的混合線性模型(mixed linear model, MLM), 以Q和K作協(xié)變量, 對橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量在單一年份下的表型值進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。顯著性閾值設(shè)置為:<1.48×10–6[=(10)–1,為使用標(biāo)記的總數(shù)], 因此–log10()≥6.0時(shí), 認(rèn)為該標(biāo)記與目的性狀顯著關(guān)聯(lián)。

1.4 等位變異分析

利用重要SNP位點(diǎn)對供試群體進(jìn)行基因分型, 計(jì)算不同等位變異對應(yīng)表型的均值, 單因素方差分析比較不同等位變異間糖苷含量的差異。利用數(shù)據(jù)分析平臺(tái)SangerBox繪制箱線圖, 展示位點(diǎn)的等位變異效應(yīng)。

1.5 候選基因的篩選

以關(guān)聯(lián)群體連鎖不平衡的衰減距離(100 kb)為連鎖區(qū)間, 基于數(shù)據(jù)庫TeaGVD[10](http://www.teaplant. top/teagvd)、NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及舒茶早品種參考基因組[8]的注釋信息, 在顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)上下游各100 kb的范圍內(nèi), 初步篩選候選基因。利用eggNOG-mapper (http://eggnog-mapper. embl.de/)數(shù)據(jù)庫, 對關(guān)聯(lián)基因的功能進(jìn)行預(yù)測與注釋, 輔助候選基因的篩選?；赥PIA[8](http://tpia. teaplants.cn/)數(shù)據(jù)庫, 檢索候選基因在茶樹8個(gè)代表性組織(頂芽、花、果、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖)中的表達(dá)數(shù)據(jù)。取已推廣的栽培品種‘福云6號(hào)’與‘悅茗香’的春梢單芽作為樣品, 在北京百邁客生物科技有限公司(Biomarker Technologies)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序, 每個(gè)樣品確保3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用百邁客云分析平臺(tái)(https://international.biocloud.net/)完成2個(gè)品種間差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)的篩選, 將已獲得的GWAS候選基因在DEGs中搜索, 最終得到基因表達(dá)存在差異的GWAS候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型描述統(tǒng)計(jì)分析

對3個(gè)年份下(E2018、E2019及E2020)共169份材料NPC與LPC的表型值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 該群體材料的NPC和LPC在不同年份間均存在明顯的差異(圖1)。

圖1 關(guān)聯(lián)群體在不同年份下表型值的箱線圖

對于NPC, 3個(gè)年份下的均值在0.0049～0.0144 μg mL–1之間, 表型變異范圍在0.0013～0.0508 μg mL–1之間, 變異系數(shù)在72.55%～80.08%; 對于LPC, 3個(gè)年份下的均值在0.0073～0.0139 μg mL–1之間, 表型變異范圍在0.0014～0.0500 μg mL–1之間, 變異系數(shù)在60.83%～66.71% (表1)。NPC和LPC在3個(gè)年份下的變異系數(shù)均大于60%, 說明該關(guān)聯(lián)群體在2個(gè)目標(biāo)性狀中存在豐富的表型變異。NPC與LPC的峰度和偏度值在0.77～2.81之間, 均小于3, 近似正態(tài)分布, 屬于較典型的數(shù)量性狀, 符合關(guān)聯(lián)分析的基本要求。相關(guān)性分析結(jié)果表明, NPC與LPC在不同年份間均存在極顯著的正相關(guān)(＜0.01), NPC的相關(guān)系數(shù)在0.58～0.76之間, LPC的相關(guān)系數(shù)在0.59～0.78之間(圖2)。計(jì)算NPC和LPC的廣義遺傳力分別為51.29%和61.87% (表1)。以上結(jié)果表明, 這2個(gè)性狀的遺傳效應(yīng)主要受基因控制, 但在一定程度上也會(huì)受到環(huán)境因素的影響。

表1 不同年份間橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量的描述統(tǒng)計(jì)分析

圖2 不同年份間橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量的相關(guān)性分析

A: 橙花叔醇櫻草糖苷含量(NPC); B: 芳樟醇櫻草糖苷含量(LPC)。**表示在0.01概率水平差異顯著。

A: nerolidol primeveroside content (NPC); B: linalool primeveroside content (LPC).** represents significant difference at the 0.01 probability level.

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究基于混合線性模型, 利用675,245個(gè)SNP標(biāo)記對NPC和LPC進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 篩選到顯著SNP位點(diǎn)共50個(gè)(表2)。在6次獨(dú)立的關(guān)聯(lián)事件中,共有28個(gè)位點(diǎn)被檢測到2次及其以上, 4個(gè)位點(diǎn)(SNP_2、SNP_3、SNP_39和SNP_40)被檢測到3次, 可將其視為穩(wěn)定的高可信度標(biāo)記位點(diǎn), 可能含有控制茶樹NPC和LPC的保守基因。其中, NPC共檢測到39個(gè)顯著SNP, 貢獻(xiàn)率在21.06%～38.73%之間,值最小的位點(diǎn)為SNP_2, 在E2018檢測到的SNP位點(diǎn)有4個(gè), E2019與E2020分別為23個(gè)和35個(gè), 有21個(gè)被檢測到2次及其以上, 2個(gè)被檢測到3次。LPC共檢測到12個(gè)顯著SNP, 貢獻(xiàn)率在24.98%～39.07%之間,值最低的位點(diǎn)為SNP_40, 在E2018檢測到的SNP位點(diǎn)有3個(gè), E2019與E2020分別為7個(gè)和10個(gè), 有7個(gè)被檢測到2次及其以上, 1個(gè)被檢測到3次(表2)。SNP_39 (Sca.1970:1955068)與NPC和LPC均為顯著關(guān)聯(lián), 說明該位點(diǎn)附近可能存在一因多效。

表2 橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)

(續(xù)表2)

a: 括號(hào)中的數(shù)字代表在每個(gè)鑒定年份中檢測到的SNP的–log10()值;1):2為在多個(gè)年份間檢測的最高值。NPC: 橙花叔醇櫻草糖苷含量; LPC: 芳樟醇櫻草糖苷含量。

a: the numbers in parentheses represent the –log10() values of SNP detected in each test years;1): only the highest value of2detected in multiple years was showed. NPC: nerolidol primeveroside content; LPC: linalool primeveroside content.

2.3 重要位點(diǎn)等位變異鑒定及效應(yīng)分析

結(jié)合表型數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), NPC和LPC共有4個(gè)主效SNP位點(diǎn)的等位變異在3年間均可導(dǎo)致其表型差異呈極顯著水平(圖3)。位點(diǎn)SNP_2 (Sca.2168:1897613)的基因型CC可使NPC提高0.0031～0.0068 μg mL–1, 因此CC為優(yōu)異等位變異; 位點(diǎn)SNP_3 (Sca.2542:459511)的基因型CC可使NPC提高0.0003～0.0126 μg mL–1, 因此CC為優(yōu)異等位變異; 位點(diǎn)SNP_49 (Sca.2268: 2160703)的基因型TT可使LPC提高0.0031～0.0070 μg mL–1, 因此TT為優(yōu)異等位變異。

(圖3)

NPC: 橙花叔醇櫻草糖苷含量; LPC: 芳樟醇櫻草糖苷含量。NPC: nerolidol primeveroside content; LPC: linalool primeveroside content.

此外, 與NPC和LPC共同關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)SNP_39 (Sca.1970:1955068)在2個(gè)性狀中的有利等位基因是相同的, 均為AA。該等位變異可導(dǎo)致E2018、E2019和E2020年份的平均NPC比等位變異TT分別提高0.0086、0.0068和0.0072 μg mL–1, LPC則分別提高0.0102、0.0072和0.0074 μg mL–1, 其差異均呈極顯著水平(圖3)。該主效SNP位點(diǎn)對茶樹NPC和LPC均具備顯著的調(diào)控效應(yīng), 其周圍區(qū)域可能存在對茶樹NPC和LPC具有重要調(diào)控作用的基因, 是茶樹香氣品質(zhì)遺傳改良的潛在重要區(qū)域。

2.4 候選基因的挖掘

以LD衰減距離100 kb[9]作為SNP位點(diǎn)上下游的候選區(qū)間, 基于茶樹基因組的物理位置, 在舒茶早基因組上對50個(gè)候選區(qū)間進(jìn)行基因掃描。根據(jù)SNP位點(diǎn)注釋信息、基因表達(dá)水平以及相關(guān)研究報(bào)道, 最終篩選出59個(gè)與NPC和LPC相關(guān)的候選基因, 其中47個(gè)與NPC的變化有關(guān), 13個(gè)與LPC的變化有關(guān)(附圖1)。這些基因主要涉及編碼萜烯合成、糖基化以及糖苷水解等多種類型, 其中還包括了一些重要的轉(zhuǎn)錄因子, 如WRKY、MYB、NAC。

在5個(gè)編碼萜烯類化合物生物合成的基因中,編碼ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase, CPS)蛋白,與編碼α-萜品醇合酶蛋白,編碼萜烯合成酶(terpene synthase, TPS)蛋白, 而編碼的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXS)是萜烯合成2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl- D-erythritol-4-phosphate, MEP)途徑的關(guān)鍵酶之一, 其中與在頂芽與嫩葉中的表達(dá)量較高(附圖1)。

在4個(gè)主效SNP位點(diǎn)中, SNP_49關(guān)聯(lián)區(qū)域的候選基因?yàn)榫幋a糖基轉(zhuǎn)移酶的, SNP_2的候選基因?yàn)榫幋aβ-甘露糖苷酶的, 而SNP_3上的2個(gè)候選基因與均編碼細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)蛋白。其中,雖在不同茶樹組織中均有表達(dá), 但在老葉與成熟葉片中的表達(dá)量更高, 而與的表達(dá)水平則在頂芽與嫩葉中較高(附圖1)?；蛭挥谂cNPC和LPC同時(shí)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記SNP_39 (Sca.1970:1955068)的候選區(qū)間上, 編碼BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白, 只在幼嫩葉片組織中特異性表達(dá)(附圖1), 參與植物次生代謝產(chǎn)物如揮發(fā)性芳香化合物合成修飾的重要過程[11]。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 59個(gè)GWAS候選基因中有26個(gè)基因的表達(dá)水平在綠茶品種‘福云6號(hào)’與烏龍茶品種‘悅茗香’的新梢單芽中存在顯著差異(表3和圖4)。其中, 8個(gè)候選基因編碼催化萜類生物合成的CYP450活性蛋白, 分別為、、、、、、和; 3個(gè)編碼糖苷水解酶活性蛋白, 分別為、和; 12個(gè)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白, 分別為、、、、、、、、、、和; 2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子和, 以及1個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子。

表3 候選基因鑒定

(續(xù)表3)

NPC: 橙花叔醇櫻草糖苷含量; LPC: 芳樟醇櫻草糖苷含量。NPC: nerolidol primeveroside content; LPC: linalool primeveroside content.

圖4 轉(zhuǎn)錄組與GWAS篩選共有基因的表達(dá)水平熱圖

Fuyun 6_1、Fuyun 6_2、Fuyun 6_3: 候選基因在綠茶品種‘福云6號(hào)’單芽中的表達(dá)水平; Yuemingxiang_1、Yuemingxiang_2、Yuemingxiang_3: 候選基因在烏龍茶品種‘悅茗香’單芽中的表達(dá)水平。

Fuyun 6_1, Fuyun 6_2, Fuyun 6_3: expression level of candidate genes in buds of green tea variety ‘Fuyun 6’; Yuemingxiang_1, Yue-mingxiang_2, Yuemingxiang_3: the relative expression level of candidate genes in buds of oolong tea variety ‘Yuemingxiang’.

這26個(gè)基因與茶樹新梢中橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷合成積累相關(guān), 并且在不同適制性茶樹品種之間顯著差異表達(dá), 進(jìn)一步說明這些基因?qū)Σ煌m制性茶樹品種香氣品質(zhì)的形成具有重要作用, 可初步視為茶樹橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷合成積累的候選基因。基于候選基因注釋結(jié)果與前人的研究進(jìn)展, 繪制出茶樹橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷合成積累的調(diào)控模型示意圖(圖5)。

TFs: 轉(zhuǎn)錄因子; TPS: 萜烯合成酶; CYP450: 細(xì)胞色素P450; GHs: 糖苷水解酶; GTs: 糖基轉(zhuǎn)移酶。

TFs: transcription factors; TPS: terpene synthase; CYP450: cytochrome P450; GHs: glycoside hydrolases; GTs: glycosyltransferases.

3 討論

3.1 香氣品質(zhì)性狀遺傳特征分析

本研究結(jié)果顯示, 3個(gè)年份中169份參試材料NPC和LPC性狀的平均值基本符合正態(tài)分布, 這與之前Fang等[12]、Hazra等[13]、Huang等[14]以及Yamashita等[15]對其他品質(zhì)性狀的研究結(jié)果一致。基于相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)NPC與LPC在不同年份間均存在極顯著的正相關(guān)(<0.01), 說明目標(biāo)性狀主要受遺傳因素影響, 遺傳改良前景可觀。2018年NPC和LPC均顯著高于其他年份, 但顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)較少。

通過對表型性狀的統(tǒng)計(jì)及其全基因組關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)2018年NPC和LPC均顯著高于其他兩年, 但關(guān)聯(lián)到的顯著位點(diǎn)卻較少。這可能是因?yàn)? 2018年春季實(shí)驗(yàn)材料取樣點(diǎn)所在茶區(qū)遭受嚴(yán)重晚霜凍害, 促使茶樹體內(nèi)NPC和LPC大量積累, 進(jìn)而起到抵御寒冷的作用, 而2019年與2020年NPC和LPC表型值的區(qū)分度更好, 故檢測到的顯著位點(diǎn)更多。通過比較SNP在茶樹基因組上的物理位置, 可發(fā)現(xiàn)在不同年份間穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn)。如, 3年間NPC均可檢測到2個(gè)顯著的SNP位點(diǎn)(SNP_2和SNP_3), 而LPC也可檢測到一個(gè)顯著SNP (SNP_40)。這些結(jié)果表明, 雖然香氣品質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜, 但利用多年份鑒定的方法仍可以有效挖掘到穩(wěn)定遺傳的基因位點(diǎn)。

前人研究表明, 香氣品質(zhì)通常由多基因控制, 是受遺傳因素及環(huán)境互作等多方面影響的數(shù)量性狀[16]。全基因組關(guān)聯(lián)分析可以有效地鑒定出調(diào)控性狀的關(guān)鍵位點(diǎn)和候選基因, 具有較高的分辨率, 為研究復(fù)雜農(nóng)藝性狀的遺傳機(jī)制提供了更多線索[17-18]?；贕WAS, 從305份草莓群體中確定了62個(gè)與揮發(fā)性香氣物質(zhì)有關(guān)的信號(hào)簇, 并對其物理位置和亞基因組信息進(jìn)行了基本闡述, 通過開發(fā)相對應(yīng)的分子標(biāo)記, 可進(jìn)行輔助選擇, 達(dá)到改善草莓風(fēng)味的效果[19]。對321份番茄群體中的結(jié)構(gòu)變異(structural variations, SVs)進(jìn)行基因分型, 基于GWAS在10號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)347 bp的缺失變異, 該變異與番茄果實(shí)中香葉酮的含量密切相關(guān)[20]。Wang等[21]通過多組學(xué)相結(jié)合的方式, 在萜類合成酶的基因中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)變異, 并對烏龍茶高香氣特征的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行了剖析。本研究利用169個(gè)茶樹自然雜交后代單株進(jìn)行NPC與LPC的全基因組關(guān)聯(lián)分析, 共檢測到顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)50個(gè), 其中共定位SNP位點(diǎn)1個(gè), 說明NPC與LPC間的調(diào)控機(jī)制可能存在較大的差異。

3.2 香氣品質(zhì)相關(guān)性狀候選基因預(yù)測

基于混合線性模型、位點(diǎn)注釋信息及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道, 本研究挖掘出位于SNP位點(diǎn)連鎖區(qū)間內(nèi)最可能的候選基因, 共59個(gè)。這些基因包括糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白、糖苷水解酶蛋白、CYP450蛋白、BAHD?；D(zhuǎn)移酶蛋白、MYB轉(zhuǎn)錄因子、NAC轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子以及參與萜類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因。植物的香味通常與游離的揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān), 在糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases, GTs)的作用下以糖苷形式在植物中貯存[22]。在葡萄中, 糖基轉(zhuǎn)移酶基因VvGT7和VvGT14編碼的蛋白酶以香葉醇、芳樟醇等萜類香氣成分做底物, 2個(gè)基因的表達(dá)水平與果實(shí)中糖苷的積累量相關(guān)[23]。糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)是茶葉的一種內(nèi)源酶, 通常位于細(xì)胞質(zhì)中, 能水解糖苷類香氣前體物質(zhì), 是釋放茶葉香氣物質(zhì)的有效工具[24]。由此推測, 糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶蛋白可通過控制萜烯類糖苷的合成與水解, 從而調(diào)控游離態(tài)橙花叔醇和芳樟醇的貯存與釋放, 最終影響茶葉香氣品質(zhì)。

與可可和咖啡相比, 茶樹中存在著發(fā)生了快速擴(kuò)張的基因家族, 其中TPS被認(rèn)為是與茶葉香氣有關(guān)的一種重要酶, 其家族成員的擴(kuò)張有利于提高茶葉的香氣品質(zhì)[25]。有研究發(fā)現(xiàn), TPS基因在葡萄的果實(shí)中表達(dá), 與葡萄成熟過程中香氣物質(zhì)的合成積累有關(guān)[26]。擬南芥萜類合酶與細(xì)胞色素P450編碼的基因與在花器官形成以及開花期緊密共表達(dá),可激活, 而則可產(chǎn)生多種萜烯類揮發(fā)性香氣物質(zhì)[27]。在雞蛋花中, 基因編碼的細(xì)胞色素P450家族蛋白, 可催化多種VOCs的生物合成, 在煙草花中過表達(dá)亦可導(dǎo)致VOCs的大量釋放[28]。由此推測, CYP450可通過激活TPS基因的表達(dá), 進(jìn)而催化橙花叔醇與芳樟醇的生物合成與大量釋放。

目前, 越來越多的研究表明, WRKY、MYB、NAC等轉(zhuǎn)錄因子參與植物次級(jí)代謝產(chǎn)物萜類物質(zhì)的合成代謝調(diào)控, 在植物揮發(fā)性香氣物質(zhì)的研究中發(fā)揮著重要的作用。如番茄WRKY轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá), 可顯著提高萜烯合成MEP途徑中相關(guān)基因的表達(dá)水平, 而CRISPR/Cas9-slwrky35基因敲除的番茄果實(shí)中, MEP途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平及其萜類物質(zhì)的合成顯著降低[29]。果實(shí)成熟過程中, 芳香物質(zhì)的合成會(huì)受轉(zhuǎn)錄因子NAC的調(diào)控, 且該分子機(jī)制在番茄、桃子、蘋果以及獼猴桃等多種植物中保守存在[30-32]。而MYB轉(zhuǎn)錄因子則與蝴蝶蘭[33]、蕙蘭[34]以及草莓果實(shí)[35]的香氣形成有關(guān), 可通過激活下游合成途徑中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子表達(dá), 促進(jìn)香氣物質(zhì)的生物合成。由此推測, 茶樹WRKY、MYB、NAC等轉(zhuǎn)錄因子有可能通過激活VOCs合成基因啟動(dòng)子元件的方式調(diào)控其合成基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

此外, 本研究還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)一因多效位點(diǎn)SNP_ 39, 該位點(diǎn)優(yōu)異等位變異可顯著提高NPC與LPC, 故挖掘該位點(diǎn)連鎖區(qū)域的候選基因?qū)Σ铇湎銡忸愋偷母牧季哂兄匾饬x。該位點(diǎn)候選基因編碼植物特有的BAHD?；D(zhuǎn)移酶, 是參與多種次生代謝物如萜類、花青素等合成修飾的重要酶類之一[36]。薔薇科水果梨的BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族成員與其果實(shí)的香氣生物合成密切相關(guān)[11]; 擬南芥BAHD?；D(zhuǎn)移酶基因與參與萜類化合物的合成修飾[37]。由此推測,可能通過調(diào)控萜類化合物的合成修飾從而影響茶樹的香氣品質(zhì), 其具體的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步的證實(shí)。綜上所述, 本研究挖掘到的與香氣性狀相關(guān)的候選基因, 為后續(xù)基因的精細(xì)定位、基因克隆以及香氣性狀遺傳機(jī)理的解析提供了參考。

3.3 分子標(biāo)記輔助選擇在未來育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記輔助選擇能夠加速育種進(jìn)程, 提高選擇效率, 是植物育種技術(shù)的有力工具[38]。Eggink等[39]基于感官評價(jià)與代謝分析, 在辣椒的種間回交群體中定位了果實(shí)的萜類化合物QTL位點(diǎn), 對培育獨(dú)特風(fēng)味的辣椒新品種起理論指導(dǎo)意義。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析可以挖掘到與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn), 有助于分子標(biāo)記的開發(fā)與利用。本研究所選群體的母本材料FT516與FT104是高香型的優(yōu)異種質(zhì), 研究結(jié)果可應(yīng)用于FT516與FT104自然雜交后代的群體改良與品種選育。對主效位點(diǎn)進(jìn)行有利等位變異分析, 發(fā)現(xiàn)與NPC和LPC同時(shí)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)SNP_39 (Sca.1970: 1955068)的有利等位基因型均為AA, 且不同基因型間的表型差異達(dá)到極顯著水平, 基于該變異開發(fā)與NPC和LPC相關(guān)的分子標(biāo)記, 或可達(dá)到多性狀同時(shí)改良的效果。

此外, 針對該類有利等位變異開發(fā)分子標(biāo)記, 還可在實(shí)際的選育工作中進(jìn)行有利等位基因的選擇或累加[40]。本研究對主效位點(diǎn)深入分析發(fā)現(xiàn), 4個(gè)優(yōu)異等位變異位點(diǎn)對茶樹NPC和LPC皆具有顯著調(diào)控效應(yīng), 有較大的應(yīng)用前景, 可作為茶樹香氣品質(zhì)遺傳改良的重要位點(diǎn)。例如SNP_3在不同年份間均與NPC關(guān)聯(lián)且表型貢獻(xiàn)率較高, 其有利等位變異的基因型為CC, 在育種實(shí)踐中可定向選擇該基因型達(dá)到提高NPC的效果。

4 結(jié)論

本研究以169個(gè)茶樹自然雜交后代單株作為關(guān)聯(lián)群體, 利用個(gè)675,245個(gè)SNP標(biāo)記, 采用MLM模型針對NPC和LPC進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 共檢測到50個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn), 其中在2個(gè)及其以上環(huán)境中被穩(wěn)定檢測到的有28個(gè)。針對2個(gè)目標(biāo)性狀, 共鑒定出4個(gè)主效SNP位點(diǎn), 其中1個(gè)為可同時(shí)調(diào)控NPC和LPC的一因多效位點(diǎn)。在顯著SNP位點(diǎn)上下游各100 kb的區(qū)間內(nèi), 篩選出最可能的候選基因共59個(gè), 主要涉及茶樹的糖類代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、萜烯類生物合成等多個(gè)生物學(xué)過程, 其中26個(gè)基因在綠茶品種‘福云6號(hào)’與烏龍茶品種‘悅茗香’中的表達(dá)水平存在顯著差異。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步揭示茶樹NPC和LPC的遺傳機(jī)制, 以及高香型茶樹新品種選育提供參考。

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附表1 169份茶樹自然雜交后代單株名稱及其信息來源

Table S1 Names and origin information of 169 natural hybrid progenies

序號(hào)No.名稱Name母本來源Maternal parent序號(hào)No.名稱Name母本來源Maternal parent 104-1FT104(♀)8616-15FT516(♀) 204-10FT104(♀)8716-16FT516(♀) 304-11FT104(♀)8816-17FT516(♀) 404-12FT104(♀)8916-18FT516(♀) 504-13FT104(♀)9016-19FT516(♀) 604-14FT104(♀)9116-2FT516(♀) 704-15FT104(♀)9216-20FT516(♀) 804-16FT104(♀)9316-21FT516(♀) 904-17FT104(♀)9416-22FT516(♀) 1004-18FT104(♀)9516-23FT516(♀) 1104-19FT104(♀)9616-24FT516(♀) 1204-2FT104(♀)9716-25FT516(♀) 1304-20FT104(♀)9816-26FT516(♀) 1404-21FT104(♀)9916-27FT516(♀) 1504-22FT104(♀)10016-28FT516(♀) 1604-23FT104(♀)10116-29FT516(♀) 1704-24FT104(♀)10216-3FT516(♀) 1804-25FT104(♀)10316-30FT516(♀) 1904-26FT104(♀)10416-31FT516(♀) 2004-27FT104(♀)10516-32FT516(♀) 2104-28FT104(♀)10616-33FT516(♀) 2204-29FT104(♀)10716-34FT516(♀) 2304-3FT104(♀)10816-35FT516(♀) 2404-30FT104(♀)10916-36FT516(♀) 2504-31FT104(♀)11016-37FT516(♀) 2604-32FT104(♀)11116-38FT516(♀) 2704-33FT104(♀)11216-39FT516(♀) 2804-34FT104(♀)11316-4FT516(♀) 2904-35FT104(♀)11416-40FT516(♀) 3004-36FT104(♀)11516-41FT516(♀) 3104-37FT104(♀)11616-42FT516(♀) 3204-38FT104(♀)11716-43FT516(♀) 3304-39FT104(♀)11816-44FT516(♀) 3404-4FT104(♀)11916-45FT516(♀) 3504-40FT104(♀)12016-46FT516(♀) 3604-41FT104(♀)12116-47FT516(♀) 3704-42FT104(♀)12216-48FT516(♀) 3804-43FT104(♀)12316-49FT516(♀) 3904-44FT104(♀)12416-5FT516(♀) 4004-45FT104(♀)12516-50FT516(♀) 4104-46FT104(♀)12616-51FT516(♀) 4204-47FT104(♀)12716-52FT516(♀) 4304-48FT104(♀)12816-53FT516(♀) 4404-49FT104(♀)12916-54FT516(♀)

(續(xù)附表1)

序號(hào)No.名稱Name母本來源Maternal parent序號(hào)No.名稱Name母本來源Maternal parent 4504-5FT104(♀)13016-55FT516(♀) 4604-50FT104(♀)13116-56FT516(♀) 4704-51FT104(♀)13216-57FT516(♀) 4804-52FT104(♀)13316-58FT516(♀) 4904-53FT104(♀)13416-59FT516(♀) 5004-54FT104(♀)13516-6FT516(♀) 5104-55FT104(♀)13616-60FT516(♀) 5204-56FT104(♀)13716-61FT516(♀) 5304-57FT104(♀)13816-62FT516(♀) 5404-58FT104(♀)13916-63FT516(♀) 5504-59FT104(♀)14016-64FT516(♀) 5604-6FT104(♀)14116-65FT516(♀) 5704-60FT104(♀)14216-66FT516(♀) 5804-61FT104(♀)14316-67FT516(♀) 5904-62FT104(♀)14416-68FT516(♀) 6004-63FT104(♀)14516-69FT516(♀) 6104-64FT104(♀)14616-7FT516(♀) 6204-65FT104(♀)14716-70FT516(♀) 6304-66FT104(♀)14816-71FT516(♀) 6404-67FT104(♀)14916-72FT516(♀) 6504-68FT104(♀)15016-73FT516(♀) 6604-69FT104(♀)15116-74FT516(♀) 6704-7FT104(♀)15216-75FT516(♀) 6804-70FT104(♀)15316-76FT516(♀) 6904-71FT104(♀)15416-77FT516(♀) 7004-72FT104(♀)15516-78FT516(♀) 7104-73FT104(♀)15616-79FT516(♀) 7204-74FT104(♀)15716-8FT516(♀) 7304-75FT104(♀)15816-80FT516(♀) 7404-76FT104(♀)15916-81FT516(♀) 7504-77FT104(♀)16016-82FT516(♀) 7604-78FT104(♀)16116-83FT516(♀) 7704-79FT104(♀)16216-84FT516(♀) 7804-8FT104(♀)16316-85FT516(♀) 7904-9FT104(♀)16416-86FT516(♀) 8016-1FT516(♀)16516-87FT516(♀) 8116-10FT516(♀)16616-88FT516(♀) 8216-11FT516(♀)16716-89FT516(♀) 8316-12FT516(♀)16816-9FT516(♀) 8416-13FT516(♀)16916-90FT516(♀) 8516-14FT516(♀)

FT516、FT104是“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題任務(wù)“福建茶樹種質(zhì)鑒定評價(jià)與新品種選育(2011BAD01B01-FJCKS)”鑒定的10個(gè)優(yōu)異種質(zhì)中制茶品質(zhì)得分居前2位的高香型優(yōu)異種質(zhì)。

FT516 and FT104 are the top 2 high aroma excellent tea varieties among the 10 excellent germplasm identified in the “Fujian Tea Germplasm Identification and Evaluation and New Variety Selection (2011BAD01B01-FJCKS)” project of the National Science and Technology Support Plan for the 12th Five-Year Plan.

附圖1 GWAS候選基因在茶樹各組織中的表達(dá)

Fig. S1 Expression profiles of candidate genes in different tissues of tea by GWAS

Genome-wide association study and candidate gene prediction of nerolidol and linalool primeveroside content in tea plants

ZHANG Li-Lan1,2, YANG Jun1,2, and WANG Rang-Jian1,2,*

1Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, Fujian, China;2Fujian Branch, National Center for Tea Improvement, Fuzhou 350013, Fujian, China

Nerolidol and linalool are volatile terpene alcohols compounds widely distributed in plants. They are mainly existing in the form of primeveroside in tea plant tender shoots, and increasing their content is of great significance for improving the aroma quality of tea. The objective of this study is to reveal the genetic mechanism of nerolidol and linalool primeveroside in tea plants. 169 natural hybrid progenies were used as associated populations, and the contents of nerolidol and linalool primeveroside in tea plant tender shoots in three years were analyzed by using 675,245 single nucleotide polymorphism (SNP) markers evenly distri-buted uniformly on the chromosomes of tea genome. The results showed that the phenotypic variation of nerolidol and linalool primeveroside content were 60.83%–80.08%, and the broad-sense heritability were 51.29% and 61.87% respectively. Nerolidol and linalool primeveroside content were in normal distribution, suggesting that the traits have typical genetic characteristics of quantitative traits. A total of 50 significantly associated loci were detected by GWAS, and each locus contributed more than 20% to the variations of nerolidol and linalool primeveroside content, of which the maximum contribution rate of nerolidol primeveroside content (NPC) variation site was 38.73%, and the maximum contribution rate of linalool primeveroside content (LPC) variation site was 39.07%. Furthermore, the elite alles of the four major SNPs was identified by allelic variation effect analysis, among which one locus that could affected NPC and LPC simultaneously. Finally, a total of 59 genes were annotated in the confidence intervals of each significantly associated loci, and the most likely candidate genes were predicted according to the comparison with previous reports and gene functional annotations. These candidate genes were mainly involved in multiple biological processes such as sugar metabolism, transcriptional regulation, terpene biosynthesis. Among them, there were significant differences in the relative expression levels of 26 genes between green tea varieties and oolong tea varieties. This study provides new information for further dissecting the genetic mechanism of nerolidol and linalool primeveroside content in tea plants, and provides important gene resources for accelerating the breeding of new tea varieties with high quality.

; nerolidol primeveroside; linalool primeveroside; genome-wide association study; candidate gene

10.3724/SP.J.1006.2024.34124

本研究由福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2023R1090)和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技專項(xiàng)(ZYTS202408)資助。

This study was supported by the Technology Plan Project of Fujian Province (2023R1090) and the Science and Technology Specific Project of Fujian Academy of Agricultural Science (ZYTS202408).

王讓劍, E-mail: wangrj@faas.cn

E-mail: lilanzhang0114@foxmail.com

2023-07-18;

2023-10-23;

20213-11-13.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231110.0856.004

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