花生赤霉素3-β-雙加氧酶(AhGA3ox)基因家族的全基因組鑒定及表達分析

李海芬 魯 清 劉 浩 溫世杰 王潤風 黃 璐 陳小平 洪彥彬 梁炫強

花生赤霉素3-β-雙加氧酶(AhGA3ox)基因家族的全基因組鑒定及表達分析

李海芬 魯 清 劉 浩 溫世杰 王潤風 黃 璐 陳小平 洪彥彬 梁炫強*

廣東省農業科學院作物研究所/ 廣東省農作物遺傳改良重點實驗室/ 國家油料作物改良中心南方花生分中心, 廣東廣州 510640

赤霉素3-β-雙加氧酶(gibberellin 3-beta-dioxygenase, GA3ox)是參與赤霉素生物合成的關鍵酶之一, 可通過影響赤霉素的形成調控植物的生長發育, 目前在花生中尚無系統研究。本研究利用生物信息學方法在花生栽培種基因組數據庫中篩選花生GA3ox家族基因, 對鑒定出的7個在栽培種花生基因組中的分布、結構及進化特征、理化性質、啟動子順式作用元件進行分析, 并利用qRT-PCR技術對其進行花生組織結構表達模式分析, 同時對AhGA3ox家族基因在不同莢果大小的2個花生品系中的表達量進行分析。結果表明, 7個基因分布在7條染色體上, 均由1個內含子和2個外顯子組成。花生AhGA3ox蛋白中均包含1個DIOX_N結構域和1個2OG-FeII_Oxy結構域, 系統進化分析表明與大豆的親緣關系較近, 在根、莖、葉、花、果針5個組織中呈現出不同表達模式, 不僅在花生果殼不同發育時期的表達量不同, 在2個莢果大小不同的花生品系果殼相同發育時期的表達量也不相同, 但多數發育時期在大果品系中的表達量均顯著高于小果品系, 推測該家族基因的表達可能對莢果的形成具有促進作用。

花生;; 表達分析; 生物信息學; 功能分析

赤霉素(gibberellins, GAs)是一種廣泛存在于植物中的二萜類羧酸, 包括功能活性分子GA1、GA3、GA4、GA7, 以及非活性分子GA9、GA19、GA20、GA29、GA511。GAs具有多種生物學功能, 在植物的發育和生長過程中起著重要的調控作用, 如枝條伸長、葉片擴張和形狀、開花、種子萌發和果實發育[1-5]。GA的生物合成和代謝由6種關鍵酶催化, 分別是: 古巴焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase, CPS)、內根-貝殼杉烯合成酶(ent-kaurene synthase, KS)、內根-貝殼杉烯-19-氧化酶(ent-kaurene oxidase, KO)、內根-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase, KAO)、GA20-氧化酶(GA20ox)和GA3-氧化酶(GA3ox)以及催化活性GAs失活或GAs前體消耗的GA2-氧化酶(GA2ox)[1,5]。GA3ox則是將非活性赤霉素前體GA5/GA9/GA20/GA44催化生成有活性的GA3/GA4/GA1/GA38[5-6]。目前, 已在水稻[6]、小麥[7]、葡萄[8]、豌豆[9]、桃子[10]和擬南芥[11]等物種中克隆了部分基因。在大多數植物物種中, GA3ox由多基因家族編碼, 但目前尚不清楚每個基因組中存在多少基因, 其中在擬南芥中已鑒定出4個基因(～)[11-12], 殷小林等[12]以(LOC_Os05g08540)作為靶序列, 利用BlastP 在水稻基因組數據庫中共檢索到了24個同源基因, 同源性為80%～90%。He等[13]利用葡萄基因組數據庫中的BLAST軟件鑒定到6個基因。

研究發現,在玉米[14]、水稻[6]、擬南芥[11]和苜蓿[15]中的突變均導致植株矮稈。Wei等[16]利用西瓜正常品系M08和矮稈品系N21的F2分離群體, 在9號染色體32.88 kb的區域內精確定位了一個隱性矮稈等位基因(), 基因注釋顯示編碼赤霉素3β-羥基化酶的cl015407基因可能是的最佳候選基因。Hu等[17]通過基因組重測序發現了一種有益的單倍型, 有助于提高種子重量, 并在大豆的遺傳轉化中得到了進一步證實。但目前有關花生GA3ox家族基因的研究報道卻比較少, 本研究在花生栽培體基因組中對基因()進行鑒定, 并系統分析了基因的結構、染色體位置、保守基序、啟動子區順式作用元件、系統發育分類以及基因在不同組織器官和發育階段的表達譜, 分析了AhGA3ox與擬南芥()、野生豆()、大豆()同源蛋白的系統發育關系, 并對AhGA3ox家族基因在花生不同組織器官以及在2個莢果大小不同的花生品系不同發育時期的果殼中的表達模式進行了分析本研究結果將為下一步明確AhGA3ox家族基因的功能, 促進其在作物遺傳改良中的應用提供良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料種植

花生品系P92-1和P92是本課題組多年培育的重組自交系超大果和超小果品系, 種植于廣東省農業科學院白云區試驗基地。各品系按小區種植, 單粒播種, 每小區種植共4行, 每行播種5穴。株距20 cm, 行距23.3 cm。3次重復隨機種植, 大田常規種植管理。花生果針剛開始向地伸長時系上標記塑料線, 其中P92-1系紅色塑料線, P92系白色塑料線, 并在果針進入土壤后第10 (S1)、17 (S2)、24 (S3)、31 (S4)和38 (S5)天, 選取大小一致的莢果, 取果殼備用。每個品系每個發育時期取50個莢果, 各3個生物學重復。

1.2 AhGA3ox家族基因的鑒定及生物信息學分析

本研究中花生GA3ox家族基因信息參考“伏花生”分析結果, 參考基因組信息從Peanutbase (https:// www.peanutbase.org/)下載; Pfam (http://pfam.xfam. org/)下載所有的結構域的hmm格式文件, 基于TBtools[18]進行Simple HMM搜索, 尋找候選蛋白; 使用NCBI保守結構域庫(CDD: https://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd)和SMART (http://smart.embl-heidelberg. de/)進行候選蛋白驗證; 利用ExPASy的ProtParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對GA3ox家族基因編碼的蛋白氨基酸序列、相對分子量(molecular weight, MW)、等電點(isoelectric point, pI)、總平均親水性(grand average of hydrophilicity, GRAVY)等蛋白理化性質進行分析; 利用在線軟件WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位預測; 使用MapChart分析AhGA3ox家族基因成員的染色體分布; 使用NCBI-Protein (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/)搜索其他物種包括大豆、水稻以及擬南芥GA3ox蛋白; 利用DNAMAN和BLAST檢索多重序列比對和同源性分析; 利用MEGA11.0軟件進行鄰接法(Neighhbor-Joining, NJ)構建系統發育樹; 使用MEME (http://MEME.nbcr. net/MEME/cgibin/MEME.cgi)進行保守結構域分析; 從花生栽培種基因組數據庫中獲得基因編碼序列(coding sequence, CDS)上游2000 bp的基因組DNA序列, 利用PlantCARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子區域潛在的順式元件進行分析。

1.3 花生AhGA3ox家族基因表達模式分析

分別提取大莢果材料P92-1和小莢果材料P92的根、莖、葉、花、果針5個不同組織的RNA, 進行表達量分析; 同樣分別提取莢果膨大期5個關鍵發育時期(果針進入土壤后10、17、24、31和38 d)的果殼RNA, 進行實時熒光定量PCR分析, 所用引物可見表1。其中, RNA提取和反轉錄分別參照TaKaRa公司RNA提取和反轉錄試劑盒操作手冊進行; qRT-PCR析在CFX96 (Bio-Rad)定量PCR儀中進行, 采用EvaGreen試劑盒(Bio-Rad), 根據操作手冊進行, 分析方法采用2–ΔΔCT, 每個樣本包含3個生物學重復。

表1 qRT-PCR所用引物

1.4 數據統計和分析

用SPSS19.0 (SPSS Institute, Inc., 美國)進行數據統計分析, LSD法檢驗各比較組之間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 花生AhGA3ox基因鑒定

利用DIOX_N (PF14226)和2OG-FeII_Oxy (PF03171)結構域, 通過TBtools以及NCBI在線分析工具在花生四倍體栽培種“伏花生”全基因組中共發現7個基因。這7個基因的CDS長度在1047～1125 bp范圍, 以Ahy_A07g037374最長, 編碼產物含有375個氨基酸, 以Ahy_A06g030353, Ahy_ B06g085507最短, 編碼產物僅含有349個氨基酸; 這些蛋白的等電點范圍為5.53～8.11; 不穩定參數為36.94～57.23; 脂溶指數為75.79～86.29; 親水性平均數–0.462～ –0.221; 帶正電荷殘基數目30～46; 帶負電荷殘基數目31～44。利用網站(https://wolfpsort. hgc.jp/)對7個AhGA3ox蛋白進行亞細胞定位預測發現, 該蛋白最可能出現在細胞核和細胞質中(表2)。根據基因組注釋, 這7個分別分布在花生的7條染色體上, 包括A06、A07、A08、A09、B06、B08、B09染色體上(圖1)。為研究AhGA3ox的進化關系, 利用其氨基酸序列構建了AhGA3ox蛋白的系統發育樹。AhGA3ox家族成員分為2支(圖2-A)。分支I由Ahy_A06g030353、Ahy_A08g040809、Ahy_ B06g085507、Ahy_B08g089553組成。分支II由Ahy_ A07g037374、Ahy_A09g046613、Ahy_B09g094759組成。

圖1 AhGA3ox基因家族的染色體分布

黑色代表染色體, AhGA3ox家族基因標記在染色體右邊, 左側比例尺表示染色體長度。

The black bars represent the chromosomes. GA3ox genes are marked to the right of the chromosomes. The scale bar on the left indicates the length of the chromosomes.

為分析家族基因的結構, 通過比較基因組DNA和轉錄組序列來分析內含子和外顯子的組成。所有均包含2個外顯子(圖2-A)。結合基因結構和系統發育樹發現親緣關系越近的基因, 它們之間基因結構越相似可能為花生A和B亞基因組的直系同源基因; 如Ahy_A06g030353與Ahy_ B06g085507、Ahy_A08g040809與Ahy_B08g089553、Ahy_A09g046613均含有2個內含子, 且結構、長度、分布差異較小(圖2-B)。對AhGA3ox蛋白結構進行研究發現, 所有的AhGA3ox蛋白的N端都含有一個DIOX_N結構域, C端含有1個2OG-FeII_Oxy結構域(圖2-B)。其中DIOX_N結構域是一個具有2-氧戊二酸/鐵(II)依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N端區域。2OG-FeII_Oxy結構域中2種組氨酸和1種天冬氨酸殘基催化結合金屬離子, 通常是鐵離子, 但在某些情況下, 另一種金屬直接參與催化。靠近C端部分的保守的精氨酸或賴氨酸殘基作為堿性殘基與酸性底物相互作用[12]。

2.2 AhGA3ox基因的系統發育分析、基因結構和組成

為了解花生AhGA3ox家族各成員間親緣關系與生物學功能, 明確花生與其他物種的GA3ox異同, 本研究對鑒定到的7個花生AhGA3ox與來自擬南芥()、水稻()、大豆()、野生大豆()、野生四倍體花生()、野生二倍體花生(,)的64個GA3ox進行多序列比對, 并構建系統進化樹, 結果表明GA3ox蛋白可分為4類(圖3), Class I類11個蛋白均來自擬南芥, Class II類的GA3ox成員最多, 共23個, Class III類15個, Class IV類22個。其中來自花生栽培種基因組的Ahy_B06g085507、Ahy_A06g030353、Ahy_A08g040809、Ahy_B08g089553屬于Class II, Ahy_A07g037374、Ahy_B09g094759、Ahy_ A09g046613則屬于Class IV, 這些基因均與花生四倍體野生種和二倍體野生種的距離較近。在不同的分支中, 擬南芥、水稻的GA3ox蛋白均分別成簇出現, 可見花生與擬南芥、水稻的親緣關系較遠, 與大豆的親緣關系較近。

表2 AhGA3ox家族基因蛋白理化性質預測

圖2 花生AhGA3ox家族基因及編碼蛋白的系統發育與結構分析

(A) 利用AhGA3ox的氨基酸序列構建系統發育樹。(B)基因的結構。綠色矩形、黃色矩形和黑色線條分別代表UTR、CDS和內含子。底部比例尺代表UTR、CDS和內含子長度。(C) AhGA3ox蛋白的結構。藍色和紫色矩形表示DIOX_N結構域, 2OG-FeII_Oxy結構域結構域。底部比例尺表示結構域長度。

(A) phylogenetic tree is constructed with amino acid sequences of AhGA3ox; (B) the structure ofgenes. Green rectangles, yellow rectangles, and black line represent UTR, CDS, and introns; (C) the structure of AhGA3ox protein. Blue and purple rectangles represent DIOX_N and 2OG-FeII_Oxy domains.

為進一步研究AhGA3ox蛋白的特性, 基于motif的序列分析工具MEME對來自擬南芥、水稻、大豆、野生大豆和花生5個物種71個GA3ox蛋白進行了在線分析(圖4), 共得到10種保守基序, 大部分基因包含所有基序。花生栽培體基因組中, Ahy_A09g0466135、Ahy_A07g037374、Ahy_A08g040809、Ahy_B08g089553中包含所有的基序, Ahy_A06g030353包含9個motif,缺失motif 10。Ahy_B09g094759缺失motif 9, 來自花生四倍體野生種的5個基因中EVM0006872.1僅有7個基序, 缺失motif 2、motif 5、motif 9。EVM0038100.1、EVM0025264.1缺失motif 10。來自花生二倍體野生種B基因組的2個基因中araip.Araip.SF6BV則是缺失motif 6, araip.Araip. DQI4G.1則具有所有基序。

圖3 GA3ox基因家族的系統發育分析

淺藍色背景區域為四倍體野生種花生(), 綠色區域為栽培種大豆(), 藍色區域為水稻(), 淺灰色區域為擬南芥(), 黃色區域為A基因組二倍體野生種花生(), 褐色區域為B基因組二倍體野生花生(), 紫色區域為野生種大豆(), 紅色區域為四倍體栽培種花生(L.)。花生、擬南芥、水稻、大豆、野生豆系統發育分析將71個GA3ox蛋白分為4類。利用MEGA-X軟件以GA3ox蛋白的氨基酸序列為基礎, 采用最大似然法構建系統發育樹。Bootstrap=1000。

The light blue background was tetraploid wild peanut (), the green area was cultivated soybean (), the blue area was rice (), the light gray area was(), the yellow area was A genomic diploid wild peanut (), the brown area was wild peanut with B genome diploid (), the purple area was wild soybean (), the red area was tetraploid cultivated peanut (L.). Phylogenetic relationships among 71 GA3ox proteins in peanut, arabidopsis, rice, soybean and wild soybean. GA3ox proteins were divided into 4 classes. The phylogenetic tree is built on the basis of the complete amino acid sequences of GA3ox proteins by MEGA-X with maximum likelihood method. Bootstrap=1000.

(圖4)

Motif分析通過MEME在線分析完成, 不同氨基酸的高度代表可重復性, 底部的比例尺表示基序長度。左側為蛋白系列名稱, 右側不同顏色分別對應不同的保守基序在系列上的位置。

Phantom analysis is performed by MEME program. The height of different amino acid represents repeatability. The scale bar at the bottom indicates the length of the motif protein sequence. On the left are the names of the protein series. The different colors on the right correspond to the positions of different conserved motifs on the series, respectively.

2.3 花生AhGA3ox順式元件分析

啟動子活性在基因功能調控中起著至關重要的作用。為了解花生的遺傳功能、代謝網絡和調控機制, 對其啟動子區的順式元件進行了分析。以的2000 bp上游序列作為假設的啟動子, 利用PlantCARE對啟動子區域潛在的順式元件進行分析。結果顯示, 這些基因啟動子區包含多個順式元件, 主要有ABA (ABRE)、auxin (TGA-box)、MeJA (TGACG-motif, CGTCA-motif)、GA (GARE-motif, TATC-box, P-box)和SA (TCA-element) 5種植物激素的順式元件, 以及多個光響應(GATA-motif, TCT-motif, G-Box等)順式作用元件(圖5)。其中, 多個光響應元件在所有基因的啟動子中都發現, 表明可能會受到光調控。僅Ahy_A08g040809、Ahy_ B06g085507、Ahy_B08g089553、Ahy_B09g094759的啟動子中有GA響應元件, 表明這4個基因可能會由GA誘導產生。

2.4 AhGA3ox家族基因在花生各組織及果殼發育過程中的表達模式

為了進一步分析家族基因在花生發育過程中的表達情況及作用, 本研究選取了2個莢果大小不同的花生品系(農藝性狀見表3), 并采用qRT-PCR技術分析了7個基因在花生植株不同組織器官中的表達量(圖6)。結果表明,家族基因在2個莢果大小不同的花生品系中表達模式基本相同, 但在不同組織間表達水平不同。除Ahy_ A08g040809外(針對此基因在序列的前、中、后區段各嘗試設計引物, 但均擴增失敗), 其余6個基因在花生各個組織中均有表達, 其中Ahy_B08g089553在花中的表達量最高, Ahy_A09g046613、Ahy_ B09g094759在莖中的表達量最高, Ahy_ A06g030353、Ahy_B06g085507在果針中表達量最高, Ahy_ A07g037374則在根中的表達量最高。

圖5 AhGA3ox家族基因啟動子中的順式作用元件預測分析

不同顏色方框分別代表不同順式元件, 底部的比例尺表示啟動子序列的長度。

Different colored boxes represent different-elements, and the scale at the bottom represents the length of the promoter sequence.

表3 2個花生品系農藝性狀比較

*和**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

*and**mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

對不同發育階段的果殼中家族基因的表達量進行分析(圖7)發現, 該家族基因不僅在不同時期的表達量不同, 在2個品系相同發育時期的表達量也不同, 例如Ahy_B08g089553和Ahy_B06g085507在發育S1期表達量最高, 且在大果品系P92-1的5個發育時期的表達量均大于小果品系P92, 其中Ahy_B08g089553在發育前4期差異顯著, Ahy_ B06g085507則在發育S1、S2、S4、S5期差異顯著; 其余4個家族基因則在發育S5期的表達量最高, 其中Ahy_B08g089553的表達量在大果品系P92-1的S2、S4、S5期顯著大于小果P92, Ahy_B06g085507的表達量在大果品系P92-1的S1、S4、S5期顯著大于小果P92; Ahy_B09g094759的表達量在大果品系P92-1的S2、S5期顯著大于小果P92, Ahy_A07g037374的表達量在大果品系P92-1的S4、S5期顯著大于小果P92。

圖6 6個AhGA3ox家族基因在花生品系P92及P92-1各組織中表達模式分析

不同小寫字母表示不同花生組織在0.05概率水平差異顯著。

Different lowercase letters means significant difference at the 0.05 probability level in peanut tissue.

3 討論

3.1 AhGA3ox家族全基因組鑒定及表達分析

赤霉素是植物生長的重要激素, 在整個生長周期中發揮重要作用, 包括種子的萌發、下胚軸和莖的伸長、葉片擴張、毛狀體發育、花粉成熟、果實發育等[19]。GAs包括有生物活性的GA1、GA3、GA4、GA7, 以及非生物活性分子GA9、GA19、GA20、GA29和GA51。GA生物合成分為3個階段, 第1步是由牦牛兒基焦磷酸(GGPP)經古巴焦磷酸合成酶(CPS)以及內根-貝殼杉烯合成酶(KS)催化生成內根-貝殼杉烯來完成的[1,20]。第2步反應首先由內根-貝殼杉烯經內根-貝殼杉烯氧化酶(KO)催化生成內根-貝殼杉烯酸。隨后內根-貝殼杉烯酸于內質網中經過內根-貝殼杉烯酸氧化酶(KAO)催化生成GA12[1,21]。最后由GA12作為前體物質, 經GA20ox以及GA3ox的催化生成有生物活性的GA1、GA3、GA4和GA7[5,19]。GA3ox是一類依賴于2-楊戊二酸的雙加氧酶, 在赤霉素合成的第3個階段參與催化GA20生成GA1以及催化GA9生物合成GA4, 直接決定植物體內生物活性GAs的水平[6,13]。在許多植物中,為多基因家族, 但各物種有多少個成員基因還不是很清楚。目前, 已在水稻[6]、擬南芥[14]、小麥[22]、紫花苜蓿[15]和西瓜[23]等物種中克隆了部分基因。

S1～S5分別表示果針進入土壤后第10、17、24、31和38天。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

S1–S5 represents the 10th, 17th, 24th, 31st, and 38th day after the gynophore enters the soil, respectively. *, ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

本次研究在花生栽培種中共鑒定到7個基因。通過生物信息學方法對物理化學性質、染色體分布、進化關系、啟動子順勢作用元件以及花生各植物組織表達模式進行分析發現, 這7個基因分別位于A06、B06、A07、A08、B08、A09、B09染色體上, 7個基因均包含2個外顯子, 且基因進化關系相近的基因結構相似, 其中4個基因包含所有保守基序, 另外3個基因分別缺失1個基序。與擬南芥、水稻、大豆、野生大豆和野生花生5個物種的遺傳進化分析發現, 與花生四倍體野生種距離較近。啟動子順勢作用元件分析結果顯示, 這些基因啟動子區都具有多個順式元件, 包括ABA (ABRE)、auxin (TGA-box)、MeJA (TGACG-motif、CGTCA-motif)、GA (GARE-motif、TATC-box、P-box)以及SA (TCA-element) 5種植物激素的順式元件, 以及多個光響應(GATA-motif、TCT-motif、G-Box等)的順式作用元件, 表明這些基因除受GA調控外, 也受ABA、IAA、MeJA、光信號調控。另外, 分析發現這些基因雖屬于赤霉素氧化酶基因, 但部分基因如Ahy_A06g030353、Ahy_ A07g037374、Ahy_A09g046613啟動子上并不含赤霉素相關作用元件, 原因可能是選取的啟動子序列長度(上游2000 bp)較短, 或者是通過GA信號通路上的其他作用因子調控其響應內源GA含量變化, 從而調節植物體內GA水平[24]。

3.2 AhGA3ox基因在調節莢果長度方面具有一定作用

有關GA3ox家族基因的研究已有很多。其中擬南芥的赤霉素3-氧化酶由至少4個成員組成的多基因家族編碼, 命名為到。擬南芥和在營養生長期負責具有生物活性的GA合成, 能打破種子休眠和萌發、促進莖尖伸長和類囊體合成,和則在生殖階段中表達, 促進花、果莢等部位的形成[25], 而小麥能加快營養器官生長和開花[8]。水稻中,定位于第5染色體短臂, 主要在未開放的花中表達;定位于第1染色體短臂, 在伸長的葉片中高表達, 這2個基因可能影響水稻花藥的發育[6,12]。葡萄中的3個基因分別在根, 花和胚珠中高表達, 表現出顯著的組織特異性[13]。煙草中異源表達蘋果發現過表達煙草在開花時間與對照存在差異, 證明主要在花中表達[26-27]。可見GA3ox基因存在顯著的組織特異性。本次研究的7個基因不僅在花生不同組織部位的表達量不同, 且在不同發育階段果殼中的表達量也不同, 表明不僅具有組織特異性, 還具有發育時期特異性。這可能與其不同的生物學功能有關。

目前已經在玉米、水稻、擬南芥、紫花苜蓿和西瓜等植物中鑒定到的基因突變體, 均導致植株矮化[6,13-15,22-23]。而基因的過表達則可以促進植株節間發育, 提高植物纖維素、木質素等的合成。例如, Radi等報道, 在擬南芥中過表達南瓜導致轉基因植株對于野生型植株下胚軸、節間和葉片生長增加, 開花時間提前[28]。Reinecke等[29]在豌豆中過表達轉基因植株節間、卷須和果實更長, 托葉更大, 開花延遲, 頂端分生組織壽命增加, 維管發育改變。但在轉基因雜交白楊中的過表達并沒有導致樹木生長或形態的增加[30]。在本研究中, 通過qRT-PCR分析花生家族基因在2個大小果花生品系不同發育階段的果殼中的表達量, 發現該家族基因不僅在果殼不同發育時期的表達量不同, 在大小果2個不同品系間的表達量也不相同, 但多數發育時期在大果品系中的表達量均顯著大于小果品系,可見該家族基因的表達可能對莢果的形成具有促進作用。此前Reinecke等[29]也發現, 在豌豆中過表達會導致轉基因植株果實更長。

4 結論

利用隱馬可夫模型(HMM)在栽培種花生基因組中鑒定到7個AhGA3ox家族基因, 這些基因在花生7條染色體上呈不均勻分布。花生家族基因在花生根、莖、葉、花和果針5種組織中的表達量存在差異。另外, 花生家族基因在大果和小果花生品系中的表達也存在差異, 在多數發育時期中, 其在大果品系中的表達量均顯著大于小果品系, 推測該家族基因的表達可能對莢果的形成具有促進作用。本研究將為后續解析花生莢果大小形成的分子機制及花生莢果大小的遺傳改良提供理論基礎和基因資源。

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Genome-wide identification and expression analysis of AhGA3ox gene family in peanut (L.)

LI Hai-Fen, LU Qing, LIU Hao, WEN Shi-Jie, WANG Run-Feng, HUANG Lu, CHEN Xiao-Ping, HONG Yan-Bin, and LIANG Xuan-Qiang*

Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / South China Peanut Sub-Center of National Center of Oilseed Crops Improvement / Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong, China

Gibberellin 3-beta-dioxygenase (GA3ox) is one of the key enzymes involved in gibberellin biosynthesis, which can regulate plant growth and development by affecting gibberellin formation. There were no systematic studies in peanut genome. In this study, AhGA3ox family genes were identified from the genome database of cultivated peanut species by bioinformatics, and the distribution, structure, evolutionary characteristics, physical and chemical properties, promoter cis-acting elements were also analyzed. The relative expression pattern ofin different peanut tissues was analyzed by qRT-PCR, and the relative expression level of in shell of two peanut lines with different pod size were also analyzedThe results showed that 7were distributed on 7 chromosomes of peanut, all of which were composed of 1 intron and 2 exons. All the AhGA3ox proteins contained 1 DIOX_N domain and 1 2OG-FeII_Oxy domain. Phylogenetic analysis showed that they were closely related to GA3ox proteins of soybean,. Theshowed obvious tissue expression specificity in root, stem, leaf, flower and peg. The expression levels ofwere not only different in different development stages of the peanut shell, but also different at the same development stage of the two lines. Interestingly, the relative expression levels in large pod lines were significantly higher than those in small pod lines at most development stages. Therefore, we predict that the gene expression of AhGA3oxgene family may promote the formation of large pod.

peanut;; the relative expression analysis; bioinformatics; functional analysis

10.3724/SP.J.1006.2024.34122

本研究由廣東省“十四五”農業科技創新十大重點項目公開競爭計劃(2022SDZG05), 廣東省重點研發計劃-現代種業(2020B020219003, 2022B0202060004), 財政部和農業農村部國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-13), 國家自然科學基金項目(32001442, 32172051), 廣東省基礎與應用基礎研究基金項目(2021A1515010811, 2023A1515010098), 廣東省農業和農村廳科技專項資金項目(2019KJ136-02), 廣東省海外名師計劃項目(207124505346)和廣東省農業科學院農業優勢產業學科團隊建設項目(202104TD)資助。

This study was supported by the Open Competition Program of Top Ten Critical Priorities of Agricultural Science and Technology Innovation for the 14th Five-Year Plan in Guangdong Province (2022SDZG05), the Guangdong Provincial Key Research and Development Program- Modern Seed Industry (2020B020219003, 2022B0202060004), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-13), the National Natural Science Foundation of China (32001442, 32172051), the Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515010811, 2023A1515010098), the Technology Special Fund of Guangdong Province Agriculture and Rural Affairs Department (2019KJ136-02), the Guangdong Province Overseas Master Teacher Program (207124505346), and the Agricultural Competitive Industry Discipline Team Building Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences (202104TD).

梁炫強, E-mail: Liangxuanqiang@gdaas.cn

E-mail: lihaifen@gdaas.cn

2023-07-14;

2023-10-23;

2023-11-14.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231110.1622.012

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