基于轉錄組探究外源水楊酸對條銹菌侵染小麥幼苗的緩解效應及差異表達基因分析

齊學禮 李 瑩 李春盈 韓留鵬 趙明忠 張建周,*

研究簡報

基于轉錄組探究外源水楊酸對條銹菌侵染小麥幼苗的緩解效應及差異表達基因分析

齊學禮1,**李 瑩2,**李春盈3韓留鵬1趙明忠1張建周3,*

1河南省作物分子育種研究院, 河南鄭州 450002;2河南農業大學學報編輯部, 河南鄭州 450002;3河南省農業科學院小麥研究所, 河南鄭州 450002

為探究外源水楊酸提高小麥條銹病抗性的作用機制, 本文將周麥18分為未處理的小麥幼苗(對照)、條銹菌侵染的小麥幼苗(SR)和水楊酸處理條銹菌侵染的小麥幼苗(SA-SR), 對處理15 d后的小麥幼苗進行抗病性鑒定、氨基酸含量檢測、轉錄組測序及熒光定量分析鑒定。結果表明: 外源水楊酸能夠顯著降低條銹菌對小麥幼苗的致病力; SR組葉片中氨基酸含量普遍降低, 而經過水楊酸預先處理的SA-SR組與Control無顯著差異, 說明小麥條銹病造成葉片中氨基酸的含量顯著降低; 通過GO富集分析發現, SR和SA-SR組的差異基因在與光合作用相關的生物過程中富集, 涉及的細胞組分包括葉綠體和類囊體等, KEGG通路富集分析顯示, SR和SA-SR兩個分組均在MAPK信號通路和次生代謝物的生物合成中顯著富集, 在植物的抗病或抗逆中發揮重要作用。

小麥條銹病; 水楊酸; 氨基酸; 轉錄組

小麥條銹病是全世界范圍內分布最廣泛且影響最大的小麥病害之一, 在中國的小麥種植區是重要的監測和防治對象。小麥條銹病是由條形柄銹菌(f. sp., Pst)引起的一種低溫氣傳真菌性病害[1], 葉片是主要發病部位, 嚴重時對葉鞘、莖稈、穗部以及芒和穎殼都會造成危害。流行年份會造成20%～30%的減產, 甚至是50%～60%或絕收, 中國是條銹病最大的流行區[2]。小麥條銹病的防治主要是以種植抗病品種為主, 輔以藥劑和栽培防治, 但抗病品種的培育周期較長, 藥劑防治效果雖立竿見影, 但對人畜有害, 且農藥殘留不利于生態環境可持續發展, 還可能會引起病原菌的耐藥性。然而, 誘導抗病則從一個全新的視角出發, 通過刺激、脅迫或外力引發植物的天然防御機制, 進而使植物能夠免受或減輕病原物的危害, 也彌補了抗病育種和藥劑等防治策略的不足。

水楊酸(salicylic acid, SA)是在高等植物體內合成的一種小分子酚類物質, 在調節植物生長發育的過程中發揮重要作用, 另外還參與植物對病原菌的防御反應[3], 是一種激活抗病性的關鍵信號。過去的報道主要側重于水楊酸在植物抗寒[4]、抗旱[5]、抗鹽堿[6]等方面的作用機理。White等[7]證實用水楊酸、乙酰水楊酸(阿司匹林)或苯甲酸等處理煙草能夠誘導病程相關蛋白的合成從而產生對煙草花葉病毒(TMV)的抗性。在真菌病害方面, 通過采用1.0 mmol L–1水楊酸浸種并施用生物源物質或生防菌劑, 能夠實現黃瓜白粉病65.24%和71.92%的防病率[8]。近年來小麥抗病研究發現, 發現通過啟動水楊酸以及茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號途徑上相關的抗性基因可獲得小麥對赤霉病的抗性[9]; 小麥在與葉銹菌的相互作用中引起了氧化應激反應, 而水楊酸能夠通過減輕病原菌誘導的氧化過程, 減輕小麥葉銹病的侵染[10]; 另外, 在接種條銹菌后, 水楊酸合成的兩個關鍵基因和的相對表達量顯著上調, 從而說明水楊酸參與了小麥對條銹病的抵抗作用[11]; Liu等[12]發現非編碼RNA SABC1能夠招募PRC2復合體, 增加臨近基因NAC3的H3K27me3修飾, 從而抑制NAC3的轉錄, 而NAC3在激活水楊酸合成酶ICS1的表達以及促進SA合成中發揮重要作用, 正調控植物對細菌和病毒的免疫, 植物SABC1在被細菌或病毒侵染時積累降低, 其對NAC3的抑制作用降低, 從而激活NAC3和ICS1的表達, 增加植物抗性; 劉佳慧等[13]發現水楊酸信號通路在抑制蕪菁花葉病毒(TuMV)的侵染中具有重要的作用, 而TuMV的NIb蛋白能夠靶向水楊酸受體NPR1, 阻止NPR1與SUMO3的相互作用及修飾, 并導致后續蘇木化修飾依賴的磷酸化過程不能進行, 從而抑制水楊酸介導的植物抗病毒信號通路, 以促進病毒的侵染。然而, 對外源水楊酸提高小麥抗條銹病在分子水平上的系統性報道較少。

本研究以半冬性小麥品種周麥18為試驗材料, 結合氨基酸含量、轉錄組測序等數據, 對小麥幼苗接種條銹病菌和外源水楊酸誘導小麥的抗病性進行了系統性分析, 從而解析水楊酸提高小麥對條銹菌抗性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為周麥18, 供試小麥周麥18是我國黃淮冬麥區南片的主栽品種之一, 代表性強, 且苗期中感條銹病, 成株期中抗條銹病, 由河南省作物分子育種研究院小麥分子育種室提供; 小麥條銹菌為我國小麥條銹菌流行小種CYR32, 由河南省作物分子育種研究院小麥分子育種室提供; 水楊酸(天津化學試劑六廠, 分析純), 先用少量 95%的酒精進行溶解, 再用濃度為1 mol L–1的NaOH將溶液的pH值調至6.8左右, 隨后可用蒸餾水將其配制成50 mmol L–1的母液, 待試驗時再用蒸餾水稀釋至1 mmol L–1。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗的培養和處理 挑選籽粒發育良好、顏色形狀一致的周麥18種子16粒, 催芽后播種在7 cm × 7 cm的小花盆內。待小麥幼苗長至二葉一心期, 即第1葉完全展開時, 分為兩組進行噴霧(噴霧時加0.05%的Tween 20): (1) 水楊酸處理預接種條銹菌幼苗(SA-SR): 用1 mmol L–1的SA對葉面進行噴霧, 直至葉面上布滿均勻微小霧點; (2) 預接種條銹菌的小麥幼苗(SR): 用蒸餾水進行噴霧。每個處理3盆, 重復3次。3 d后, 采用抖粉法[14]接種SA-SR組和SR組小麥幼苗, 后置于10℃黑暗保濕24 h, 于溫室(平均溫度12～20℃, 光照10～12 h d–1, 光強100～160mmol m?2s?1(換算成國際單位))誘導發病, 培養15～18 d后, 待SR組充分發病時調查反應型[15], 0～6級為抗病, 7～9級為感病(圖1)。同時調查小麥發病病情指數。

圖1 小麥苗期條銹病反應型鑒定標準(0～9級)

1.2.2 氨基酸含量測定[16]稱取2.0 g小麥葉片于水解管中, 加入6 mol L–1鹽酸溶液10～15 mL以及苯酚3～4滴。將水解管放入冷凍劑3～5 min后抽真空, 充入氮氣, 重復3次后, 進行封口操作(充氮氣狀態下)。

將水解管放在的水解爐內(110±1)℃, 水解22 h后, 取出冷卻至室溫。水解液過濾至50 mL容量瓶內, 用水少量多次對水解管進行沖洗, 隨后移入50 mL容量瓶內, 定容。吸取1.0 mL濾液至15 mL試管內, 用試管濃縮儀進行減壓干燥(40～50℃), 殘留物用1～2 mL水溶解, 減壓干燥。在干燥后的試管內加入檸檬酸鈉緩沖液(pH 2.2)進行溶解, 振蕩混勻,采用0.22 μm濾膜進行過濾, 轉移至進樣瓶, 高效液相色譜儀測定。

1.2.3 RNA提取、文庫構建及測序 采用TRIzol法提取總RNA, 提取后利用1%瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop分光光度計和Bioanalyzer 2100 system等儀器完成RNA純度和完整性檢測。樣品檢測合格后, 由北京中科華章生物科技有限公司進行后續建庫和測序。

1.2.4 數據獲取及差異分析 測序獲得fastq格式的原始數據(raw data)。為提高數據分析可靠性,使用軟件Trimmomatic v0.33[17]過濾帶接頭以及含 N 比例超過10%的低質量reads, 獲得clean data 128.34 Gb。利用STAR v2.5.2b[18]軟件將clean data定位到小麥的參考基因組Triticum aestivum genome assembly iwgsc_refseqv1.0Submitted by IWGSC (August 2018) GenBank: GCA_900519105.1上。使用HTSeq[19]軟件計算基因read counts數后, 使用軟件DESeq2對其進行分析, 按照-value < 0.05 & |log2FC|≥1的閾值進行差異mRNA篩選。使用R軟件進行聚類熱圖、PCA分析、樣本間pearson相關系數計算。

1.2.5 基因的GO與KEGG富集分析及轉錄因子分析 對篩選出的差異基因進行GO和KEGG功能注釋富集分析。富集分析使用R包進行應用超幾何檢驗, GO富集分析使用GOseq包, KEGG使用KOBAS 3.0富集分析, 找出在差異表達基因中顯著富集的pathway或者term。

1.2.6 差異基因的qRT-PCR驗證 為驗證轉錄組測序數據的可靠性, 以小麥GAPDH基因作為內參, 選擇10個差異表達基因進行qRT-PCR驗證, 所選基因功能涉及葉綠體、類囊體以及光合作用, 特異性引物序列見表1。采用SYBR法進行熒光定量分析, 重復3次, 采用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量[16], 并采用R包ggplot2_3.4.2進行RNA-seq和qRT-PCR的spearman相關性分析, 相關性越高(> 0.8,<0.05), 說明PCR與RNAseq的一致性越高。

表1 實時熒光定量PCR所用引物

1.2.7 數據處理 采用Microsoft Excel 2010對試驗數據進行統和與整理, 方差分析等則采用SPSS 22.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同處理小麥苗期抗病性鑒定

周麥18小麥幼苗接種條銹病菌的SR組和經過水楊酸處理的SA-SR組對CYR32的反應型見圖2, SR組對CYR32表現感病, SA-SR組對CYR32表現抗病。

病情指數SA-SR在6.5～9.0之間, 而SR則在27～45之間。因此, 從小麥條銹病的病情指數來看, SR組發病率較重, 而經過水楊酸處理的SA-SR組發病輕, 差異極顯著(<0.01), 說明水楊酸能夠緩解條銹菌對小麥的侵染程度。

2.2 氨基酸含量統計分析

根據氨基酸含量統計箱線圖可以發現(圖3), SR與對照組相比, 多種水解氨基酸的含量均有不同程度的下降, 其中絲氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸的含量下降顯著(<0.05); 而SA-SR組小麥葉片中氨基酸含量與對照無顯著差異。由此可見, 小麥條銹病顯著降低了植株氨基酸的含量, 而外源噴施水楊酸后可緩解氨基酸的降低程度, 從而在一定程度上提高對小麥條銹病的抵御能力。

圖2 SR組和SA-SR組對CYR32的反應情況

表2 3個分組中小麥葉片水解氨基酸含量

*represents the essential amino acids.

圖3 3個分組中小麥葉片17種水解氨基酸含量差異比較

2.3 轉錄組測序數據質量

本研究通過Illumina Novaseq 6000高通量測序獲得原始數據(raw data), 數據量為128.69 Gb, 過濾得到有效數據(clean data), Q20為98.15%～98.53%, GC含量在54.67%～55.72%, 比對率在96.08%～ 96.84%, 表明整體測序質量好, 后續分析有很高的reads利用率(表3)。

2.4 相關性分析

皮爾遜(Pearson)相關性分析顯示3個分組的組內以及組間的生物學重復性較高(圖4-a)。PCA分析發現, 不同分組組間的表達量水平有明顯的差異(圖4-b)。結果表明, 對照、SR以及SA-SR組的RNA-seq數據可靠, 可進行進一步分析。

2.5 差異表達基因分析

SR與對照、SR與SA-SR的差異基因分析結果表明, SR與對照相比, 總共得到18,002個差異表達基因, 10,728個上調, 7274個下調(圖5-a)。SA-SR與SR相比, 總共得到20,089個差異表達基因, 7404個上調, 12,685個下調(圖5-b)。兩個組合間的venn圖(圖6-a)發現有7825個差異表達基因。通過對共有差異基因進行聚類分析(圖6-b), 發現共有基因的轉錄因子主要集中bHLH (427)、WRKY (326)、B3 (238)、FAR1 (222)、ERF (202)等, 上述轉錄因子在植物的抗病性、抗逆性、生長發育以及信號轉導等過程中發揮著重要作用。

表3 轉錄組數據統計表

C: 未處理的小麥幼苗; SR: 條銹病小麥幼苗; SA-SR: 水楊酸處理條銹病幼苗。

C: the untreated wheat seedlings; SR: stripe rust wheat seedlings; SA-SR: salicylic acid treatment of strip rust seedlings.

圖4 不同樣本之間的轉錄組測序數據相關性分析

a: 組內和組間皮爾遜相關性分析; b: 組間基因表達量PCA分析。

a: Pearson correlation analysis within and between groups; b: PCA analysis of gene expression levels between groups.

圖5 差異表達基因火山圖

a: SR與對照; b: SR與SA-SR.

圖6 不同組合中DEGs分析

a: 共有差異基因聚類情況; b: SA-SR和SR、SR和對照比較組之間差異表達基因的韋恩圖。

a: clustering of genes that share differences. b: Venn diagram showed the number of DEGs between SA-SR vs SR and SR vs Control.

2.6 GO與KEGG富集分析

GO富集分析表明, SA-SR與SR分組的差異基因顯著富集的前10個子類集中在細胞組分和生物過程上(表4), 細胞組分中質體(plastid)富集程度最高, 其次為葉綠體(chloroplast)、類囊體(thylakoid)、類囊體膜(thylakoid membrane)等。生物學過程集中在光合作用(photosynthesis), 相關的上下調基因分別有34個和236個(圖7-a); SR與對照分組的差異基因顯著富集的前10個子類集中在生物過程和分子功能上(表5), 生物過程中肉桂酸生物合成過程(cinnamic acid biosynthetic process)和肉桂酸代謝過程(cinnamic acid metabolic process)富集程度最高, 其次為蛋白質磷酸化(protein phosphorylation), 和磷酸化(phosphorylation)。分子功能主要集中在苯丙氨酸解氨酶活性(phenylalanine ammonia-lyase activity)上, 其次是蛋白激酶活性(protein kinase activity)(圖7-b)。

KEGG富集分析表明, 差異表達基因主要參與新陳代謝(Metabolism)這一大類。其中SA-SR與SR分組中, 極其顯著富集的通路包括碳代謝(Carbon metabolism), 次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites), α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism), 泛醌以及MAPK-植物信號通路(MAPK signaling pathway-plant) (圖8-a); 在SR與對照分組中, 極其顯著富集的通路包括植物激素信號轉導(Plant hormone signal transduction), α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism), MAPK信號通路-植物(MAPK signaling pathway- plant), 植物-病原體相互作用(Plant-pathogen interaction) (圖8-b)。

綜上所述, 在SA-SR與SR分組以及SR與對照分組中均顯著富集的信號通路有: MAPK信號通路-植物(MAPK signaling pathway-plant)、α-亞麻酸代謝(alpha- Linolenic acid metabolism)、次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、泛醌和其他萜類化合物-醌生物合成(Ubiquinone and other terpenoid- quinone biosynthesis)等。

2.7 差異表達基因的熒光定量驗證

為對轉錄組測序結果準確性進行驗證, 采用qRT- PCR, 對10個注釋到與葉綠體、類囊體以及光合作用相關的DEGs的表達量進行檢測, 結果表明, 相關基因表達水平與RNA-Seq結果一致, 相關系數達到=0.78 (圖9), qRT-PCR分析的結果證實轉錄組測序結果可靠。

3 討論

本研究通過提前噴施水楊酸后接種小麥條銹菌的方法, 發現噴施水楊酸能夠顯著降低小麥幼苗條銹病的病情指數并提高其抗性, 說明水楊酸在一定程度上誘導小麥產生了抗病性, 與前人研究結果一致, 但生產中實現大規模應用所需濃度和劑量仍需進一步探究。

另外, 本研究通過對氨基酸含量檢測發現, 小麥感染條銹病后葉片中氨基酸的含量普遍下降, 其中絲氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸的含量下降顯著; 而提前噴施水楊酸的小麥葉片在感染后氨基酸含量與健康葉片無顯著差異。已有研究表明, 水楊酸處理人參后接種人參銹腐菌, 脯氨酸的含量與僅接種人參銹腐菌的處理相比呈現升高趨勢, 提高了人參抗銹腐病的能力[20]。由此可見, 條銹病顯著降低了小麥植株氨基酸的含量。

轉錄組測序結果中, GO分析顯示經過水楊酸處理與未處理的小麥條銹病幼苗的差異基因主要富集在與光合作用相關的生物過程中, 涉及的細胞組分包括葉綠體和類囊體, 上述細胞組分在植物的光合作用中發揮重要作用。小麥條銹幼苗(SR組)中與葉綠體和光合作用相關的基因分別上調663和263, 差異極顯著。這可能是因為小麥葉片感染條銹菌后產生“黑洞效應”, 導致有效的光合作用面積減少, 另外氣孔遭到破壞, 蒸騰作用增強, 影響葉綠素合成[21], 而植株為了通過光捕獲實現有效的光合作用, 提高了光系統相關基因的表達, 從而提高葉綠素的含量和葉片的光捕獲效率[22], 導致條銹病小麥幼苗中與光合作用及葉綠體等相關組分的基因顯著上調。

表4 SA-SR vs SR前10個顯著富集的GO term

表5 SR與對照分組前10個顯著富集的GO term

圖7 不同組合中差異表達基因的GO富集分析

a: SA-SR vs SR; b: SR vs Control.

圖8 兩個比較組合差異基因的KEGG通路

a: SA-SR vs SR差異表達基因的KEGG通路富集分析; b: SR與對照分組差異表達基因的KEGG通路富集分析。

a: KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes in SA-SR vs SR. b: KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes in SR vs Control.

圖9 RNA-seq和qRT-PCR的spearman相關性分析

本研究通過KEGG通路分析發現差異基因主要富集在次生代謝物的生物合成通路上。現有研究表明, 植物在生物和非生物脅迫情況下, 能夠通過積累次生代謝物來提高防御能力[23], 而GO富集分析發現, 條銹病幼苗中苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因表達量顯著上調, 該酶是植物體內次生代謝物合成途徑苯丙烷類代謝的限速酶及關鍵酶, 在植物抗病性中發揮著重要作用[24], 在PAL的作用下, 莽草酸途徑中莽草酸的轉化物苯丙氨酸生成具有殺菌作用的反式肉桂酸, 這與GO富集分析中肉桂酸的生物合成與代謝相關的基因顯著上調吻合。由此可見, 感染條銹菌可能影響小麥次生代謝物生物合成過程中PAL的合成從而促進肉桂酸的產生來增強對小麥條銹菌的抗病能力。另有研究證實, 水楊酸處理可提高煙草、辣椒等植物體內PAL、CAT等抗性關鍵酶的活性, 增強植株對病原微生物的抵抗能力[25-26]。

除上述通路外, MAPK信號通路-植物同樣顯著富集。該信號通路主要參與植物的生長發育、生物和非生物脅迫反應、激素信號轉導等過程[27]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是蛋白激酶的一種, 在所有真核生物中均可表達。當外源信號刺激植物后, 種機制被激活從而可促分裂原活化蛋白的激酶[28]。被磷酸化的MAPK可繼續激活下游蛋白激酶和轉錄因子等底物, 如WRKY等。本研究發現小麥條銹病幼苗與對照組相比, 激酶活性及蛋白磷酸化相關基因的表達量顯著上調, 并通過對共有差異基因進行植物轉錄因子分析, 發現主要集中在bHLH (427)、WRKY (326)等轉錄因子上, 上述激酶或轉錄因子調控相應功能基因的表達, 使植物細胞對外源信號產生特定的生理生化反應來應對環境變化[29]。關于小麥的MAPK信號通路研究較為滯后, 已有研究表明, TaMAPK4在經過水楊酸處理以及寄主植物感染小麥條銹菌之后顯著增加, 可以提高小麥對條銹病的抗性[30]。另外MAPK信號通路的激活需要天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸的參與, 本實驗中氨基酸含量在不同分組中的變化可能也參與該通路的代謝調控過程。

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Alleviative effect of salicylic acid on wheat seedlings with stripe rust based on transcriptome and differentially expressed genes

QI Xue-Li1,**, LI Ying2,**, LI Chun-Ying3, HAN Liu-Peng1, ZHAO Ming-Zhong1, and ZHANG Jian-Zhou3,*

1Crops Molecular Breeding Academy of Henan, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Editorial Department of, Zhengzhou 450002, Henan, China;3Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China

In order to explore the mechanism of exogenous salicylic acid in improving the resistance of wheat stripe rust, using, the untreated wheat seedlings (control), stripe rust wheat seedlings (SR), and salicylic acid treated stripe rust wheat seedlings (SA-SR) as the experimental materials were investigated using Zhoumai 18. After 15 days of treatment, the wheat seedlings were identified for disease resistance, amino acid detection, transcriptome sequencing, and fluorescence quantification. The results indicated that the exogenous salicylic acid could significantly reduce the pathogenicity of stripe rust in wheat seedlings. The content of amino acids in leaves in the SR group was generally reduced, while there was no significant difference between the SA-SR group and the control group pretreated with salicylic acid, indicating that the content of amino acids in leaves was significantly reduced due to wheat stripe rust. GO enrichment indicated that the differentially expressed genes of SR and SA-SR groups were enriched in biological processes related to photosynthesis involving cell components such as chloroplasts and thylakoids. KEGG pathway enrichment showed that both SR and SA-SR subgroups were significantly enriched in the MAPK signaling pathway and the biosynthesis of secondary metabolites played an important role in plant disease resistance or stress resistance.

wheat stripe rust; salicylic acid; amino acid; transcriptom

10.3724/SP.J.1006.2024.31053

本研究由財政部和農業農村部國家現代農業產業技術體系建設專項(小麥, CARS-3-7)和河南省農業科學院自主創新項目(2022ZC03)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System of MOF and MARA (Wheat, CARS-3-7) and Independent Innovation Project of HAAS (2022ZC03).

張建周, E-mail: zhangjianzhou00@163.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

齊學禮, E-mail: xueliqi888@163.com; 李瑩, E-mail: liying1233@163.com

2023-09-17;

2024-01-12;

2024-02-23.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240222.1514.002

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