胎盤ABCB4表達與妊娠期肝內膽汁淤積癥血液指標及妊娠結局相關性分析*

熊艷敏，周琳娜

（河南科技大學第二附屬醫院 產科，河南 洛陽 471000）

妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）為一種妊娠期常見并發癥，此類患者臨床多伴有皮膚瘙癢、黃疸等典型癥狀，經實驗室檢查可見其血清膽汁酸水平異常升高［1］。目前臨床尚未明確ICP 的具體發病原因，但考慮與家族遺傳、既往病史、孕期體內激素水平紊亂等因素密切相關，同時，若孕婦自身年齡≥35 歲或伴人工受精等輔助生殖技術治療史、慢性肝膽性疾病時，發病ICP 的風險也相對較高［2］。ICP 患者的臨床癥狀及體征一般可在分娩結束后自行恢復，但也有部分患者可因血清膽汁酸水平控制不佳而出現羊水污染、早產、圍產兒窒息等多種不良妊娠結局，可對母體本身及新生兒生命安全造成嚴重威脅［3-4］。目前針對此病臨床尚未提出絕對理想的治療方法，一般以對癥治療、緩解臨床癥狀為主要治療原則［5］。近年國外有研究指出［6］，轉運編碼基因ABCB4突變可參與ICP 疾病的發生，且ABCB4 蛋白高表達可增加新生兒不良預后發生風險。為進一步明確ICP 發病機制并指導臨床治療，本研究旨在分析分析胎盤組織中ABCB4基因表達情況與ICP 患者血液指標及妊娠結局的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文為回顧性研究，病例納入時間為2021 年1 月至2022 年12 月，研究對象為河南科技大學第二附屬醫院112 例ICP 患者，根據臨床妊娠結局不同，將入組患者分為預后不良組（60 例）和預后良好組（52 例）。預后不良組中患者年齡23～35 歲，平均（28.44±5.17）歲；孕周36～40 周，平均（38.25±5.18）周；孕期體重指數（BMI）23.00～28.00 kg/m2，平均（25.58±5.13）kg/m2；產次：40 例為初產婦，20 例為經產婦。預后良好組中患者年齡24～34 歲，平均（29.22±5.33）歲；孕周37～39 周，平均（38.23±5.21）周；孕期BMI 23.50～27.00 kg/m2，平 均（25.62±5.25）kg/m2；產次：35 例為初產婦，17 例為經產婦。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本次研究已獲得河南科技大學第二附屬醫院倫理委員批準（33929）。

納入標準：①入組患者均符合ICP 診斷要點［7］；②均為單胎、足月妊娠；③年齡均≤35 歲；④均知悉此次亞努就試驗目的及內容，同意獲取并公開既往臨床資料。

排除標準：①伴妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病等［8-9］合并癥者；②伴有其他心肺、肝腎功能異常者；③惡性腫瘤者；④伴免疫功能障礙或其他感染性疾病者；⑤臨床資料缺失者。

1.2 方法

胎盤ABCB4 檢測方法：①檢測樣本：于剖宮產術胎盤娩出后15 min 內，在母體面中央區域剪取1 cm3大小胎盤組織，加入濃度為10%的甲醛溶液（上海溶劑廠，H31020858，規格：500 g）進行固定后備用。②ABCB4 陽性表達率檢測：經免疫組化法觀察ABCB4 的陽性表達率，對胎盤組織進行常規石蠟切片進行脫蠟處理，后加入0.01 mmol/L 的檸檬酸鈉緩沖溶液修復切片組織中抗原；加入濃度為3%的過氧化氫溶液（海德潤制藥，H11021382，規格：3%）后于室溫下孵育10 min，并將內源性過氧化氫酶進行封閉；應用磷酸鹽緩沖液對樣本進行反復沖洗，后加入1∶10 的ABCB4 單抗稀釋后孵育120 min；再次應用磷酸鹽緩沖液（北京生物制品研究所，S10850002）反復沖洗并加入ABCB4 單抗后再孵育30 min；經磷酸鹽緩沖液進行第三次反復沖洗后加入二氨基聯苯胺［北京沃凱生物科技有限公司，滬食藥監械（準）字2013 第1401615 號］進行原位雜交顯色反應并依次采用蘇木素復染，經脫水、透明并應用中性樹膠予以封片后，于顯微鏡下隨機觀察3 個400 倍視野，評估陽性細胞比例及染色強度。③ABCB4 mRNA 相對表達量檢測：經逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測ABCB4 mRNA 的相對表達量，于冷凍的胎盤組織樣本中加入生理鹽水洗滌至無血色后，將其剪碎并置于勻漿器中；通過Trizol 法提取ABCB4 蛋白的RNA，于260 nm 條件下測定并記錄吸光度，以此計算ABCB4 蛋白的RNA 純度及含量；取2 μg總RNA 實施逆轉錄擴增，獲取PCR 產物后在95℃下予以5 min 預變性，后予以3 s 變性并在58℃下進行40 s 退火，在72℃下進行30 s 延伸，以此重復40 次；測定ABCB4 蛋白灰度，并參考β-actin 灰度記錄ABCB4 mRNA 的相對表達量。

1.3 觀察指標

①記錄并對比兩組患者的胎盤ABCB4 陽性表達率、ABCB4 mRNA 相對表達量；②檢測并對比兩組患者的血液指標，統一采集外周靜脈血作抗凝處理，后按轉速3 000 r/min，半徑10 cm 離心5 min 后將血清樣本送入AU5800 全自動生化分析儀［美國，貝克曼庫爾特公司，國食藥監械（進）字2010 第2402510 號］中分別檢測兩組患者的膽汁酸水平、谷草轉氨酶（AST）水平及谷丙轉氨酶（ALT）水平，其中膽汁酸檢測方法為酶聯免疫吸附試驗法，AST、ALT 檢測方法為放射免疫法。③經Spearman 相關性系數檢驗ABCB4 陽性表達率及mRNA 相對表達量的相關性［10］。④通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析外泌體ABCB4 陽性表達率及mRNA 相對表達量與不良妊娠結局的相關性，當曲線下面積（AUC）＞0.85 時認為二者顯著相關［11］。

1.4 統計學方法

數據均采用軟件SPSS 22.0 處理，計數資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（）表 示，用t檢 驗；經Spearman 相關性系數檢驗ABCB4 陽性表達率及mRNA 相對表達量的相關性；通過繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析外泌體ABCB4 陽性表達率及mRNA 相對表達量與不良妊娠結局的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的ABCB4 表達情況比較

經檢測，預后不良組的ABCB4 陽性表達率高于預后良好組，ABCB4 mRNA 相對表達量低于預后良好組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者的ABCB4 表達情況比較

2.2 兩組患者的血液指標比較

經檢測，預后不良組患者的膽汁酸水平、AST、ALT 均高于預后良好組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者的血液指標比較（）

表2 兩組患者的血液指標比較（）

2.3 ABCB4 表達與血液指標的相關性

經Spearman 相關性系數檢驗，胎盤ABCB4 陽性表達率與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平正相關，ABCB4 mRNA 相對表達量與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平負相關（P＜0.05），見表3。

表3 ABCB4 表達與血液指標的相關性

2.4 ABCB4 表達對不良妊娠結局的預測效能

經ROC 曲線驗證，ICP 患者不良妊娠結局發生風險會隨ABCB4 陽性表達率升高、ABCB4 mRNA 相對表達量降低而不斷上升（AUC均＞0.85），見表4、圖1。

圖1 ABCB4 表達對不良妊娠結局預測ROC 圖

表4 ABCB4 表達對不良妊娠結局的預測效能

3 討論

ICP 為一種好發于妊娠中晚期的常見疾病，為一種可導致多種不良妊娠結局并嚴重威脅母嬰生命安全的妊娠期并發癥，目前認為，此病多見于自身合并非酒精性肝硬化、胰腺炎、膽囊炎、膽結石等多種慢性肝膽系統疾病患者，其發病考慮與孕期體內激素水平紊亂或個人遺傳、環境因素等密切相關［12］。因其發病機制復雜，現階段臨床仍缺乏治療ICP 的特殊方法，將膽汁酸水平下調至40 mmol/L 及以下并緩解臨床癥狀為ICP 患者的主要治療原則［13］。近年隨遺傳基因和分子生物學研究的不斷深入，人們逐步認識到可參與膽汁酸轉運及分泌的多種基因載體在ICP 發病機制中產生的重要作用，也有研究證實［14］，ABCB4基因突變可導致DME3 蛋白缺乏并抑制膽汁磷脂分泌或促使膽堿游離，隨膽管細胞凋亡或壞死，孕婦膽道系統內可有大量膽汁預計并聚集為高濃度膽汁酸。

若胎盤組織中膽汁酸水平過高則會導致胎盤內血流因絨毛膜血管收縮不足而減少，進而影響胎盤的合成及轉運［15］。高水平膽汁酸不僅會增加羊水污染風險，還可直接損傷胎兒細胞及組織，導致胎兒宮內窘迫或新生兒窒息［16］。研究表明［17］，ABCB4 為染色7q21.1 的重要載體，為肝臟毛細膽管膜磷脂的主要輸出泵，可有效保護膽管細胞免于膽汁鹽損傷。本研究中，伴不良妊娠結局的預后不良組內患者的ABCB4 陽性表達率高于預后良好組，ABCB4 mRNA 相對表達量低于預后良好組，提示ABCB4 表達情況與ICP 患者預后情況有緊密聯系。趙臨瀟等［18］研究表明，ICP 孕婦的ABCB4基因表達水平下降可增加不良妊娠結局發生風險，該研究中，ICP 組內患者的陽性表達率明顯高于對照組，ABCB4 mRNA 相對表達量明顯低于對照組，與本研究結果一致。國外相關研究指出［19］，ABCB4 與膽汁淤積有密切關聯。ABCB4基因突變可導致DMR3 蛋白匱乏、磷脂分泌減少，膽石癥、AST 活性增強所致肝膽疾病均可導致膽汁淤積，上述患者的ABCB4基因突變率為26.8%～44.4%不等。而本研究中，預后不良組患者的膽汁酸水平、AST、ALT 均高于預后良好組，提示膽汁淤積程度越嚴重，ICP 患者的膽汁酸水平及肝功能損傷程度更高。經Spearman 相關性系數驗證得知，胎盤ABCB4 陽性表達率與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平正相關，ABCB4 mRNA 相對表達量與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平負相關。且經ROC 曲線驗證后得知，ICP 患者不良妊娠結局發生風險會隨ABCB4 陽性表達率升高、ABCB4 mRNA 相對表達量降低而不斷上升，提示通過檢測ABCB4 陽性表達率及mRNA 相對表達量或可實現對ICP 患者不良妊娠結局的有效預測。宇海燕等［20］也表示，ABCB4 表達水平越低，ICP 患者不良妊娠結局的發生率越高，ABCB4 表達或可成為預測患者妊娠結局的重要指標。與本研究結論具有一致性。

綜上所述，ABCB4 陽性表達率會隨ICP 膽汁酸水平、AST、ALT 水平升高而上升，但ICP 不良妊娠結局發生風險與ABCB4 mRNA 相對表達量負相關。