微小RNA-451在小細胞性貧血及慢性感染貧血兒童血清中的表達及臨床意義

徐金梅, 張利兵, 郁多男

(1. 揚州大學附屬醫院 兒科, 江蘇 揚州, 225009;2. 揚州大學醫學院 江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室, 江蘇 揚州, 225009)

小細胞性貧血主要是指缺鐵性貧血,多發于6～12月齡的嬰兒。輕度小細胞性貧血患兒表現為皮膚、黏膜蒼白或蒼黃,嚴重者可見頭暈、全身乏力、煩躁不安、食欲不振等,且患兒往往伴有營養不良,貧血過久可導致生長發育障礙[1]。慢性感染貧血是慢性病貧血的一種,患者感染、炎癥狀態持續1個月以上,常伴有輕至中度貧血[2]。兒童貧血的原因具有多樣性和復雜性,實施有效的科學干預是臨床治療該病的重要舉措[3-5]。微小RNA(miRNAs)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA[6], 可通過其種子序列與下游靶基因mRNA 3′非翻譯區特定位點結合,從而抑制下游靶基因的mRNA翻譯成蛋白質[7]。研究[8]表明,微小RNA-451(miR-451)會有效破壞小鼠紅細胞系的穩態性,而紅細胞數量是貧血的診斷指標之一。研究[9-10]顯示,敲除miR-451后,小鼠會發生小細胞低色素性貧血,且miR-451對小鼠缺鐵性貧血和β-地中海貧血也存在一定影響。由此可見, miR-451或可成為臨床診斷和治療紅細胞疾病的一種生物學指標。本研究探討miR-451在小細胞性貧血和慢性感染貧血兒童血清中的表達及診斷價值,以期為臨床針對性治療兒童貧血提供一定的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年12月—2022年12月揚州大學附屬醫院收治的確診小細胞性貧血、慢性感染貧血的兒童各80例,分別納入小細胞性貧血組、慢性感染貧血組,不同類型貧血的診斷標準參照《血液病診斷及療效標準》[11]。納入標準: ① 根據血常規等實驗室檢查結果和臨床表現確診貧血者; ② 臨床資料完整者; ③ 依從性好者; ④ 對本研究知情且簽署知情同意書者。排除標準: ① 合并惡性腫瘤者; ② 存在肝、腎等重要臟器功能不全者; ③ 合并多種血液系統疾病和免疫源性疾病者; ④ 合并原發性高血壓、凝血功能障礙者; ⑤合并經血液傳播疾病者; ⑥ 存在精神異常、意識功能障礙者。另選取同期健康兒童80例,納入健康對照組。本研究獲得醫院倫理委員會審核批準,所有兒童及家屬對本研究知情且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血常規檢測: 采集各組兒童空腹靜脈血3.5 mL, 抽血過程中確保穿刺部位皮膚無感染及皮疹,常規消毒后,于肘正中行靜脈穿刺處理, 60 s內完成靜脈血采集,置于EDTA抗凝血管內充分顛倒混勻。使用日本SySMEX XN-100全自動血液分析儀及其相應配套試劑檢測血常規指標,包括紅細胞分布寬度(RDW)、紅細胞(RBC)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血紅蛋白(Hb)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞體積(MCV)等。確認各參數的正常參考值范圍, RBC為(3.50～5.80)×1012/L, Hb為110～172 g/L, MCH為27～34 pg, MCV為82～100 fL, MCHC為321～362 g/L, RDW為11.6%～16.0%。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血清miR-451表達: 首先通過Trizol法提取總RNA, 檢測RNA濃度和OD260 nm/OD280 nm, 然后進行cDNA的反轉錄合成,其反應體系為總RNA 1 μg+mRQ Buffer(2×)5 μL+mRQ Enzyme 1.25 μL+無酶水補至10 μL, 再用PCR擴增儀擴增獲得cDNA產物。qRT-PCR通過Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行操作,反應體系為SYBR預混料Ex Taq Ⅱ 10.0 μL+ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL+上游引物(10 μmol/L)0.4 μL+下游引物(10 μmol/L)0.4 μL+ CDNA模板1.6 μL+DEPC水7.2 μL, 合計20 μL。反應條件為94 ℃ 5 min, 1個循環; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 40個循環; 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 30 s, 95 ℃ 30 s, 1個循環。miR-451上游引物5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT -3′, 下游引物qRT-PCR試劑盒通用引物[12];GAPDH上游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGACT-3′, 下游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGGAT-3′。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 3組兒童一般資料比較

3組兒童年齡、性別比較,差異無統計學意義(P>0.05); 小細胞性貧血組、慢性感染貧血組兒童體質量指數(BMI)均低于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05); 小細胞性貧血組兒童的BMI、病程、臨床表現與慢性感染貧血組比較,差異無統計學意義(P>0.05), 見表1。

表1 3組兒童一般資料比較

2.2 3組兒童紅細胞相關參數比較

小細胞性貧血組、慢性感染貧血組兒童RDW均高于健康對照組, RBC、MCHC、Hb、MCH、MCV均低于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05); 小細胞性貧血組兒童Hb、RBC均低于慢性感染貧血組,差異有統計學意義(P<0.05), 見表2。

表2 3組兒童紅細胞相關參數比較

2.3 3組兒童血清miR-451表達水平比較

qRT-PCR檢測結果顯示,與健康對照組相比,小細胞性貧血組、慢性感染貧血組兒童血清miR-451表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05); 小細胞性貧血組血清miR-451表達水平與慢性感染貧血組比較,差異無統計學意義(P>0.05), 見圖1。

2組比較, *P<0.05; NS表示2組差異無統計學意義。

2.4 血清miR-451與紅細胞相關參數的相關性

Pearson相關分析結果顯示, miR-451與RDW呈負相關(r=-0.388,P<0.05), miR-451與Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV分別呈正相關(r=0.402、0.393、0.391、0.360、0.323,P<0.05), 見表3。

表3 血清miR-451表達與紅細胞相關參數的相關性分析

2.5 miR-451、紅細胞相關參數對小細胞性貧血的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示, RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451診斷小細胞性貧血的曲線下面積(AUC)分別為0.602、0.633、0.645、0.621、0.633、0.610、0.718, 靈敏度、特異度均較高,其中miR-451的診斷價值高于6項紅細胞相關參數,差異有統計學意義(P<0.05), 見表4、圖2。

圖2 miR-451、紅細胞相關參數診斷小細胞性貧血的ROC曲線

表4 miR-451、紅細胞相關參數對小細胞性貧血的診斷效能

2.6 miR-451、紅細胞相關參數對慢性感染貧血的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示, RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451診斷慢性感染貧血的AUC分別為0.600、0.612、0.633、0.602、0.614、0.618、0.735, 靈敏度、特異度均較高,其中miR-451的診斷價值高于6項紅細胞相關參數,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖3、表5。

圖3 miR-451、紅細胞相關參數診斷慢性感染貧血的ROC曲線

表5 miR-451、紅細胞相關參數對慢性感染貧血的診斷效能

2.7 小細胞性貧血影響因素的多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結果顯示,年齡、性別不是兒童發生小細胞性貧血的影響因素(P>0.05), BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均為兒童發生小細胞性貧血的影響因素(P<0.05), 見表6。

表6 小細胞性貧血影響因素的多因素Logisitic回歸分析

2.8 慢性感染貧血影響因素的多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結果顯示,年齡、性別不是兒童發生慢性感染貧血的影響因素(P>0.05), BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均為兒童發生慢性感染貧血的影響因素(P<0.05), 見表7。

表7 慢性感染貧血影響因素的多因素Logisitic回歸分析

2.9 血清miR-451表達對貧血嚴重程度的診斷價值

根據Hb水平的不同將160例貧血兒童劃分為輕度組(Hb>90～120 g/L,n=45, 占28.12%)、中度組(Hb>60～90 g/L,n=68, 占42.50%)和重度組(Hb為30～60 g/L,n=47, 占29.38%)。qRT-PCR檢測結果顯示,中度組、重度組血清miR-451表達水平均低于輕度組,且重度組低于中度組,差異有統計學意義(P<0.05), 表明隨著兒童貧血程度的加重,血清miR-451表達水平逐漸降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖4。ROC曲線分析結果顯示,隨著貧血程度的加重, miR-451的AUC、特異度逐漸增加(P<0.05), 表明血清miR-451水平對兒童貧血嚴重程度具有較高的診斷價值,見表8。

與輕度組比較, *P<0.05; 與中度組比較, #P<0.05。

表8 miR-451對貧血嚴重程度的診斷效能

3 討 論

小細胞性貧血是指機體紅細胞因缺乏某些必要的營養物質(如鐵等)而不能正常合成引起的貧血現象[13-14], 臨床發病率較高,但經合理治療后,患者一般預后良好[15-16]。慢性感染貧血是慢性病貧血的一種類型,其發病原因之一是微生物入侵直接造成骨髓造血組織被破壞,另一原因是細菌產生的內外毒素引起間接性作用[17-18], 最終導致感染患者血細胞減少及骨髓再生功能障礙,臨床表現為網織紅細胞增多,紅細胞壽命縮短,機體存在不同程度溶血現象[19]。盡管臨床醫師可以鑒別小細胞性貧血和慢性感染貧血,但目前關于小細胞性貧血、慢性感染貧血臨床特征的比較研究仍較少。本研究結果顯示, 3組兒童年齡、性別無顯著差異,但2組貧血兒童的BMI顯著低于健康對照組兒童,此外小細胞性貧血組、慢性感染貧血組的BMI、病程、臨床表現(乏力、食欲不振、頭暈)無顯著差異,與既往研究[20-21]結果相近。目前貧血類型的臨床診斷大多通過溶血篩查,血常規指標中具有代表意義的紅細胞相關參數包括RBC、RDW、Hb和MCV, 檢驗過程相對簡單,可為貧血診斷提供可靠依據[22-24]。本研究結果顯示,與健康對照組相比, 2組貧血患兒的RDW顯著升高, RBC、MCHC、Hb、MCH、MCV則顯著降低,且小細胞性貧血組患兒Hb、RBC顯著低于慢性感染貧血組,表明貧血患兒紅細胞相關參數存在明顯異常,與既往研究[23-24]結論一致。

miR-451基因位于第11號染色體上,與miR-144基因來自同一基因簇[25-26]。研究[27-28]表明, miR-451在斑馬魚、小鼠及人類紅細胞中的表達存在顯著差異。血液miR-451、miR-144表達與貧血類型密切相關,例如地中海貧血患者血液miR-451、miR-144表達顯著低于健康對照者,提示miR-451、miR-144表達與此類患者紅細胞生成存在關聯[10-11]。相關研究[29]在斑馬魚的紅細胞內發現一些造血相關轉錄因子,其可以激活miR-451、miR-144的表達,從而調控紅細胞的分化和生成。小鼠模型中,慢性病毒載體可抑制miR-451的表達,使紅細胞氧化應激能力增強,導致貧血程度加重,提示miR-451在原始紅細胞的分化過程中起著關鍵作用[13, 30-32]。

本研究發現,與健康對照組相比,小細胞性貧血組和慢性感染貧血組患兒外周血中miR-451表達顯著降低,提示miR-451與貧血的病理進程存在關聯。Pearson相關分析顯示,貧血兒童miR-451與RDW呈負相關,與Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV分別呈正相關,即隨著血清miR-451表達水平的升高, RDW水平逐漸降低, Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV水平逐漸升高。由此提示, miR-451表達水平可在一定程度上預測機體紅細胞相關參數,進而預測貧血的發生。本研究中, ROC曲線分析結果顯示, miR-451診斷小細胞性貧血、慢性感染貧血的AUC均顯著大于RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV, 多因素Logistic回歸分析結果顯示, BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均為兒童發生小細胞性貧血、慢性感染貧血的影響因素,即較低的BMI、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451水平和較高的RDW水平均會增加兒童發生小細胞性貧血、慢性感染貧血的概率。本研究結果還顯示,隨著兒童貧血程度的加重,血清miR-451表達水平顯著降低,進一步行ROC曲線分析發現,血清miR-451水平對兒童貧血嚴重程度具有較高的診斷價值。

綜上所述, miR-451在小細胞性貧血、慢性感染貧血兒童血清中表達降低,且其表達水平與紅細胞相關參數具有相關性,血清miR-451對小細胞性貧血、慢性感染貧血和貧血嚴重程度均具有較高的診斷價值,建議在臨床推廣應用。