非肌層浸潤性膀胱癌患者外周血單核細胞及尿沉渣中NLRP3的表達及意義

李慎謨 單中杰

鄭州人民醫院泌尿外科,河南省鄭州市 450000

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一,近年來其發病率呈逐年上升趨勢。在我國膀胱癌發病率居泌尿系統腫瘤首位,其中非肌層浸潤性膀胱癌(Non muscle invasive bladder cancer, NMIBC)患者約占初發膀胱癌的75%[1-2]。目前,臨床上關于膀胱癌的診斷主要采用膀胱鏡和尿脫落細胞學檢查,但具有微創或靈敏度不高等特點,導致其在臨床應用均具有一定的局限性[3]。因此,尋找早期診斷和判斷預后的新指標對于膀胱癌的早期診斷和復發的監測具有重要意義。

NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(nucleotide binding oligomerization like receptor family pyrin domain containing3, NLRP3)是近年來發現的先天性免疫受體NLRs家族的重要成員,主要分布于細胞間質和細胞膜中[4]。NLRP3與凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated apeck-like protein containing a CARD domain, ASC)、半胱天冬氨酸酶-1等蛋白質分子組裝形成多聚復合物——炎癥小體,在免疫和炎癥反應中發揮重要作用[5]。研究表明,NLRP3炎癥小體的異?；罨c多種惡性腫瘤的發生發展密切相關[6-7]。本研究主要是對膀胱癌患者外周血細胞及尿沉渣中NLRP3基因的表達水平進行檢測,以探討其對膀胱癌的早期診斷和復發的監測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月—2017年12月我院收治的初發膀胱癌患者68例為膀胱癌組。納入標準：均為初發膀胱癌;行經尿道膀胱腫瘤電切術;術后病理證實為非肌層浸潤性膀胱癌。其中男48例,女20例,平均年齡(59.44±7.69)歲,根據2004 WHO分類進行腫瘤分級,中低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤16例,低級別乳頭狀尿路上皮癌23例,高級別乳頭狀尿路上皮癌29例,按照2009 TNM分期系統確定腫瘤分期分為Ta期30例,T1期38例。選取同期來我院治療的泌尿系統良性病變(膀胱炎、膀胱結石、前列腺增生等)患者60例為良性病變組,其中男39例,女21例,平均年齡(57.63±7.67)歲。選取同期來我院健康體檢的健康人60例為對照組,即血常規、尿常規檢查無異常,無其他泌尿系統及免疫性疾病。其中男42例,女18例,平均年齡(58.93±7.83)歲。三組一般資料比較無統計學差異(P>0.05),具有可比性。所有受試者均對本研究知情同意并簽署知情同意書,且本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集及隨訪。收集所有受試者的臨床資料,包括年齡、性別、膀胱癌的分級及TNM分期等。同時對膀胱癌患者進行術后隨訪：術后采用電話或門診定期進行隨訪,術后1年內每個月1次,此后每3個月1次,隨訪截止至2019年12月。無進展生存時間為手術日至膀胱癌復發、死亡或隨訪截止日。

1.2.2 樣本采集。所有受試者留取尿液前1周內均未接受膀胱鏡檢查或導尿術等刺激性操作。采集膀胱癌患者手術當日空腹靜脈血和晨起中段尿各5～10mL,良性病變和健康者檢查或體檢當日空腹靜脈血和晨起中段尿5～10mL。

1.2.3 血細胞和尿沉渣總RNA的提取。采用Ficoll-Hypaque密度分離法提取外周血單核細胞。將尿液標本在4℃下3 000r/min離心10min,收集沉淀。將分離得到的單核細胞及尿沉渣采用PBS洗滌后,加入300μL裂解緩沖液,采用BIOG細胞RNA提取試劑盒提取外周血單核細胞及尿沉渣中總RNA,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以總RNA為模板,按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA,-20℃凍存備用。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應法(RT-qPCR)檢測NLRP3 mRNA的表達。采用Primer5.0設計引物,序列如下：NLRP3 上游引物：5’-CGGGGCCTCTTTTCAGTTCT-3’,下游引物：5’-CCCCAACCACAATCTCCGAA-3’;β-actin 上游引物：5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’;下游引物：5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’,由上海生工生物工程公司合成。以β-actin為內參,采用SYBR Green ER qPCR SuperMix(Applied Biosystems,USA)試劑盒進行qRT-PCR檢測NLRP3 mRNA的表達。反應條件為：95℃ 5min,95℃ 30s,55℃ 30s,40個循環;最后72℃延伸5min。采用2-ΔΔCt計算NLRP3 mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 外周血單核細胞和尿沉渣NLRP3 mRNA的表達 如表1所示,三組受試者外周血單核細胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達量具有統計學差異。組間兩兩比較,膀胱癌組和良性病變組患者外周血單核細胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達量明顯高于對照組;膀胱癌組尿沉渣NLRP3 mRNA的表達水平明顯高于良性病變組,而外周血單核細胞NLRP3 mRNA的表達水平在兩組之間無統計學差異。

表1 三組患者血細胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達水平

2.2 NLRP3對膀胱癌的診斷效能 采用ROC曲線分析外周血單核細胞及尿沉渣中NLRP3的表達水平對膀胱癌的診斷效能。外周血單核細胞及尿沉渣中NLRP3診斷膀胱癌的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.754和0.922,外周血單核細胞NLRP3診斷的敏感性高于尿沉渣NLRP3,而特異性顯著低于尿沉渣NLRP3。見圖1和表2。

圖1 ROC曲線分析血細胞及尿沉渣中NLRP3表達水平對膀胱癌的診斷價值

表2 ROC曲線分析結果

2.3 NLRP3與膀胱癌患者臨床資料的相關性 根據ROC曲線分析結果,以外周血單核細胞NLRP3的表達水平1.20為最佳界限值,將膀胱癌患者分為高表達組和低表達組,比較兩亞組間膀胱癌患者的臨床特征資料,見表3。結果發現,兩組患者在年齡、性別方面無統計學差異(P>0.05),但在膀胱癌分級及TNM分期方面具有統計學差異(P<0.05)。同樣以尿沉渣NLRP3的表達水平1.23為最佳界限值將膀胱癌患者分為高表達組和低表達組,結果同樣發現,尿沉渣NLRP3的表達水平與膀胱癌的分級及TNM分期具有明顯的相關性(P<0.05)。

表3 NLRP3與膀胱癌患者臨床資料的相關性[n(%)]

2.4 NLRP3與膀胱癌患者預后的相關性 所有膀胱癌患者術后進行隨訪,隨訪時間為12～48個月,中位隨訪時間為33.5個月。隨訪期間共有18例膀胱癌患者復發或死亡,無進展生存率為73.5%。進一步采用Kaplan-Maier方法分析NLRP3的表達與預后的關系,見圖2。結果發現,外周血單核細胞NLRP3低表達組患者的無進展生存率為85.7%,而高表達組的無進展生存率為70.4%,兩組間無明顯差異(χ2=2.127,P=0.145)。而尿沉渣NLRP3低表達組患者的無進展生存率為90.5%,高表達組的無進展生存率為66.0%,組間具有顯著差異(χ2=4.239,P=0.040)。

圖2 各組生存曲線的比較

3 討論

研究表明,炎癥反應在腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用,而NLRP3炎癥小體作為目前研究最為廣泛的炎癥蛋白,一方面能夠促進IL-1β、IL-18等炎性因子的分泌及細胞凋亡的發生,另一方面也可以介導抗腫瘤的免疫應答反應,在多種疾病的發生發展及預后中具有重要作用[5,8-9]。國內學者鄭娟紅等[10]發現在重癥潰瘍性結腸炎患者血清中NLRP3 mRNA表達水平顯著升高,參與其臨床病理過程。在結直腸癌組織中,NLRP3的表達上調,與TNM分期、遠期轉移、淋巴結陽性及預后有關,是結直腸癌預后的生物標志物也是其潛在治療靶點[11]。何登等[12]研究發現,NLRP3炎癥小體在宮頸癌組織中表達量異常增高,與腫瘤增殖、侵襲基因的表達有關,過表達NLRP3可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲,影響宮頸癌病程的進展。國內學者張惟等[13]研究也發現膀胱癌組織和細胞系中NLRP3的表達升高,其表達水平與膀胱癌患者的病理分期、淋巴結轉移及腫瘤分級相關。國外研究也指出在膀胱癌患者尿沉渣中炎癥小體表達升高[14]。目前國內外的研究大多集中于研究NLRP3炎癥小體的激活與腫瘤發生發展的關系及其可能的機制,但關于NLRP3在膀胱癌中表達的相關研究較少,其臨床意義仍不夠明確。

本研究結果顯示,膀胱癌組和良性病變組患者外周血單核細胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達量明顯高于對照組,且膀胱癌組尿沉渣NLRP3 mRNA的表達水平明顯高于良性病變組,提示尿沉渣NLRP3可能在慢性炎癥發展為腫瘤的過程中發揮了一定的作用。ROC曲線分析發現,外周血單核細胞及尿沉渣NLRP3診斷膀胱癌的AUC分別為0.754和0.922,且尿沉渣NLRP3的診斷特異性顯著高于外周血單核細胞NLRP3,提示NLRP3可能是膀胱癌臨床診斷的新的腫瘤標記物,與汪曉巍等[15]的研究結果較為一致。但聯合檢測外周血單核細胞和尿沉渣中NLRP3的表達,能夠進一步提高膀胱癌臨床診斷的靈敏度。同時本研究結果還發現,外周血單核細胞及尿沉渣NLRP3的表達水平與膀胱癌的分級及TNM分期具有明顯的相關性,提示NLRP3的表達水平與膀胱癌的進展有關,與現有研究結果較為一致[13]。進一步的Kaplan-Meier生存分析發現,外周血單核細胞NLRP3低表達組和高表達組的無進展生存率分別為87.5%和70.4%,無明顯差異(P>0.05),而尿沉渣NLRP3 mRNA低表達組的無進展生存率為90.5%,顯著高于高表達組的66.0%(P<0.05),提示尿沉渣NLRP3對膀胱癌的預后具有一定的預測價值。

綜上所述,NLRP3在膀胱癌患者的外周血細胞及尿沉渣中高表達,與膀胱癌的發生發展及預后均具有一定的相關性,提示NLRP3可能是一個潛在的膀胱癌臨床診斷的候選腫瘤標記物,并且對膀胱癌的預后均具有一定的預測作用。但仍需要大樣本、多中心的研究及進一步明確NLRP3的診斷價值,為膀胱癌的診斷及復發監測提供新的方法。