MicroRNA與慢性腎臟病并發動脈粥樣硬化相關性與中醫藥干預研究進展

劉庚鑫, 張格第, 郭敏, 羅富里, 晏子友*

(1.江西中醫藥大學臨床醫學院, 南昌 330004; 2.江西中醫藥大學附屬醫院腎病科, 南昌 330000)

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一種以腎臟損傷為特征的疾病,導致腎功能下降和血液中代謝廢物的積累,心血管疾病是 CKD患者最常見的并發癥和主要死亡原因[1]。CKD誘導的動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是CKD患者心血管并發癥發生的主要病理基礎,增加了心血管和全因死亡的風險。調查顯示,CKD患者As病變風險比健康同齡人高10～20倍[2]。microRNA(miRNA或miR)是小的非編碼RNA分子,研究表明microRNA在CKD的發病及As并發癥中發揮作用[3]。中醫藥是傳統文化的瑰寶,其對CKD及其并發癥的治療具有獨特優勢。

因此,現探討miRNA和CKD As發病之間的聯系,闡述本病中miRNA的現代研究潛力,并總結近年來有關中醫藥調控miRNA干預CKD As的研究進展,探索中醫藥微觀層面辨證與靶向治療CKD As的研究方向與意義。

1 MicroRNA與CKD As相關性及現代研究方向

1.1 CKD As發病機制概述

CKD患者普遍存在的代謝廢物累積、鈣磷代謝失調、微炎癥狀態、氧化應激、脂代謝紊亂、凝血與纖溶系統失衡等皆是促進As的危險因素[4-5],通過造成血管內皮細胞結構功能與保護機制障礙,中膜平滑肌細胞遷移和增殖,泡沫細胞、粥樣斑塊形成等病理機制,促進As的發生發展。

由于腎臟對代謝廢物的濾過能力減退,肌酐、尿酸與尿毒癥毒素包括硫酸吲哚酚、硫酸對甲酯和同型半胱氨酸等在體內大量累積,引發氧化應激和晚期糖基化終產物(AGEs)的形成[6],導致免疫細胞的激活如巨噬細胞和T細胞與促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)等釋放和免疫復合物的形成,造成血管內皮細胞損傷、中膜增厚和泡沫細胞、纖維帽的形成,加劇心血管疾病和As的進展。CKD微炎癥狀態由氧化應激、內皮功能障礙、RAAS系統激活等多因素導致[7],在微炎癥狀態下,內皮細胞暴露于高水平的氧化應激和促炎細胞因子,導致一氧化氮(NO)的產生減少,引起氧化應激、黏附分子表達和免疫細胞活化增加,這些都助于As的發展。腎臟在調節鈣和磷水平方面起至關重要的作用,CKD中腎功能的下降導致血清鈣和磷水平升高,導致血管中磷酸鈣沉積物的形成。這些沉積物積累引發動脈壁鈣化[8],從而導致動脈硬化。脂質代謝紊亂可出現在CKD不同階段[3-4],血液內脂質水平改變可影響血流動力學和內皮細胞功能,并促進脂質過氧化反應,氧化的低密度脂蛋白被單核/巨噬細胞和平滑肌細胞攝取,導致泡沫細胞和纖維斑塊的形成。另一個導致CKD As的病理機制是凝血與纖溶系統失衡[9],在CKD中凝血酶、纖維蛋白原和血管性血友病因子等參與凝血過程的因子水平增加,抗凝血劑水平如蛋白C和抗凝血酶III則往往降低,加劇促凝狀態。并且CKD患者纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)水平升高[10],這可能導致纖維蛋白溶解減少,導致血栓溶解率降低。高凝狀態與低纖溶狀態增加血栓形成和其他心血管事件的風險,加劇As進展。

1.2 microRNA參與CKD As病理過程

microRNAs是一種小的非編碼RNA分子,普遍存在于動植物基因組,通過與靶mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)結合并誘導其降解或抑制翻譯來調節基因表達,一些研究證實miRNAs在細胞增殖、分化、凋亡和免疫應答等多種生物過程和許多疾病(如心血管疾病、癌癥、衰老)中發揮重要作用[11,16]。近年來研究表明,以循環細胞外囊泡(EVs)和外泌體為載體的microRNA介導CKD及其相關心血管并發癥如As病理進程[4],部分miRNA的異常表達影響內皮功能障礙、氧化應激、炎癥和血管鈣化等病理機制,被確定為CKD As的潛在病理相關因子。

Zawada等[12]對血液透析(hemodialysis,HD)患者和健康對照的外周血單核細胞進行了高通量miRNA測序和全基因組基因表達譜分析,得到182種異常表達的miRNA,包括miR-21、miR-146b、miR-155等與80個差異表達的基因,研究發現部分miRNA可能通過Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路和趨化因子信號通路等途徑促As形成。Cunha等[6]研究表明,尿毒癥毒素可上調miRNA-92a以及miR-142-3p、miRNA-92a-3p和miRNA-489-3p,抑制內皮穩態關鍵基因的表達,從而導致其功能障礙,也可引起miRNA下調,如miRNA-214水平降低,從而促進細胞凋亡。Li等[28]研究發現,硫酸吲哚醇(indole sulfate,IS)促As的機制是通過Notch1信號和miR-34a相關蛋白上調miR-34a,從而抑制HUVEC和HAVSMCs的增殖、遷移并促進其凋亡。Shang等[13]研究表明,CKD中積累的尿毒癥毒素可以上調EC中的miR-92a并抑制其靶標(包括關鍵的內皮保護分子)的表達,從而損害EC功能并使患者易患心血管并發癥,用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(antioxidant N-acetylcysteine,NAC)預處理HUVEC后,血清miR-92a顯著降低,證明CKD氧化應激反應可能是miR-92a上調的誘因。MiRNA126在內皮細胞系特異性表達,參與調節血管生長發育、炎性反應和血管再生等病理生理過程,Ta?bi等[14]研究發現,miRNA126在Apoe基因敲除小鼠CKD模型主動脈組織中早期表達上調,在尿毒癥晚期表達下調,并靶向影響VCAM-1和SDF-1表達。同時Li等[15]研究表明miR-126過表達靶向促進SIRT1/Nrf2信號通路,一些炎癥因子如TNF-α、IL-6等表達下降,從而抑制HUVEC氧化應激和炎癥反應。炎癥是CKD As關鍵病理過程,有研究發現[14,16]CKD進展過程中炎癥相關miRNA如miR223、miR155等過調節促炎因子(如IL-1β、TNF-α和NF-κB)的表達,促進CKD As發展,此外,有研究表明[16]這兩種miRNA失調,還可引發鈣和磷酸鹽在血管中的病理沉積而影響血管系統。MiR-146a是另一種血管炎癥的調節因子,研究表明,在CKD患者中miR-146a表達下調[17],靶向toll樣受體4(TLR4)的表達,導致炎癥和As增加。此外,一些中外研究表明CKD中其他異常表達的miRNA也可通過不同途徑導致As的發生,具體機制如表1所示。

綜上可知,miRNAs和CKD As之間的病理相關性是復雜和多因素的,涉及內皮功能障礙、炎癥、氧化應激和纖維化等多方面,需要進一步的研究來充分闡明miRNA在這些疾病發病機制中的作用,并確定治療CKD和動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。此外,miRNA作為CKD As診斷和預后的生物標志物的潛力是巨大的,從現在至未來將具有重大臨床意義。

1.3 MicroRNA于CKD As現代研究的雙重身份:生物標志物與潛在治療靶點

1.3.1 生物標志物

應用microRNA作為疾病生物標志物是現代快速發展的領域,其優勢在于它們在人血漿、血清和尿液等體液中的穩定性,這與它們包含在EVs與外泌體中有關,此外miRNA表達的敏感性、組織特異性和檢查的非侵入性也讓其更受青睞[16,21]。miRNA作為CKD相關心血管并發癥中涉及信號通路的重要調節因子,可以作為細胞和EVs中有價值的病理和治療生物標志物。有研究[13]表明部分循環miRNA的水平與CKD As密切相關,可反映疾病的發生發展狀態。Fourdinier等[38]檢查了601名CKD患者血清中循環miR-126和miR-223的表達,研究發現與健康對照相比,這兩種miRNA水平降低,高水平的循環miR-126被認為與血管功能的維持和較低的 CKD 風險有關。Fujii等[39]也證明了miR-223和CKD患者eGFR之間的負相關性。Koide等[31]研究表明,CKD小鼠循環sEV中miR-16-5p、miR-17-5p、miR-20a-5p和miR-106b-5p表達下調,4種miRNA是促進CKD血管鈣化的潛在生物標志物。Fat?ha等[14]研究表明CKD血管損傷導致miRNA異常表達,在CKD As小鼠模型中,平滑肌特異性miR-143和miR-145均下調,炎癥性miR-223上調,幾種miRNA水平與CKD As的經典生物標志物如總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)以及反映腎功能的尿素水平相關。目前普遍認同miRNA在CKD As中是較理想的生物標志物,但精確具體miRNA在疾病中的診斷意義與標準化測量技術還需要更多的研究,在未來結合miRNA檢測與其他生物標志物以提高診斷價值是可預見的。

1.3.2 潛在治療靶點

近幾年的研究表明,靶向microRNA可能成為預防或逆轉CKD As發展的潛在治療策略。目前已經開發了多種方法以靶向miRNA來治療CKD患者的動脈粥樣硬化如miRNA抑制劑、miRNA模擬物和調控miRNA藥物等。Wiese等[40]研究表明CKD小鼠中,觀察到促As型miR-92a-3p水平升高,靶向抑制內皮miR-92a-3p水平可調控TGFβ途徑與STAT3水平,顯著減少As斑塊面積。同時研究發現腎損傷顯著增加了Apoe-小鼠的內皮miR-92a-3p水平,在CKD As小鼠模型中應用miR-92a-3p和miR-489-3p雙重抑制劑可顯著減少As病變面積[26]。此外,Ulrich等[27]研究表明miR29抑制劑(LNA-miR-29)可增強斑塊細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)和靶基因col1A、col3A表達,促進有益的斑塊重塑,穩定易損As病變。miR-142-3p與人類頸動脈-股動脈脈搏波速度呈負相關,作為血管硬度的指標,在ESRD患者中顯著降低,Kétszeri等[32]證明可通過靜脈注射合成miR-142-3p模擬物來恢復CKD小鼠主動脈miR-142-3p體內生物利用度,成為預防ESRD內皮功能障礙和動脈硬度增加的潛在藥物。司維拉姆是一種磷酸鹽黏合劑和尿毒癥毒素的調節劑,具有抗氧化和抗炎作用,已被證明[14]可以防止CKD中血管鈣化的進展,并使尿毒癥毒素誘導的內皮功能障礙正常化。Ta?bi等[14]研究結果表明,該藥物還可以減弱目前CKD As模型中miRNA如miRNA126、miRNA223等表達的變化。

雖然基于miRNA的治療CKDAs的潛力巨大,但目前相關研究仍面臨許多挑戰。其一是精確CKD As治療中最相關的miRNA及其特定靶點,盡管一些miRNA與CKD As的發病機制有關,但其具體靶點和作用機制仍不清楚,因此,需要更多的研究來確定CKD As相關度高的miRNA及其特定靶點。其二是miRNA可以調節多個靶基因的表達,單個miRNA的抑制或過度表達可能會對其他生物過程產生意料之外的影響。因此,在臨床和實驗研究中仔細評估基于miRNA的治療的安全性和有效性非常重要。

2 中醫藥調控microRNA干預CKD As的意義探討

2.1 CKD As中醫認識與基本病機

在古中醫籍中,并無“慢性腎臟病并發動脈粥樣硬化”病名或病癥的記載。但根據其臨床主要表現為水腫、心悸、胸悶、怔忡等癥狀,可歸屬于中醫學之“腎風”“水氣”“脈痹”“心悸”“胸痹”等病證范疇。古代醫家已認識到腎病可傳為脈病,提出腎虛是痰瘀積阻于脈的始因。如《醫林改錯》言: “元氣既虛,必不能達于血管,血管無氣必停留而為瘀”,腎中元氣虛衰則無以通達暢進血脈運行,氣虛則血滯成瘀。國醫大師皮持衡[41]教授認為,腎臟疾病無論急性慢性,其病一發即有“瘀著”存在(所謂“高凝狀態”),慢性腎病日久,可致使三焦氣化失司, 水谷精微化生輸布失常,瘀滯經脈,經久不去,釀生濁毒、瘀血。胡力丹等[42]認為心腎等臟氣不足,脾氣虧虛,脈道不利是As形成的始動因素。

CKD As病位發于腎而傳于脈,兼涉其他臟腑,屬于虛實夾雜、本虛標實之病,濕濁、瘀血、毒邪是其重要病理因素。痰濕阻于血脈之中,凝結日久,可郁生濕熱、濁毒之邪,更易壅塞脈絡,損傷津血、臟腑,如陳果然等[43]認為血瘀痰濁阻塞血脈是As的產生機理。瘀血是CKD As的最主要病理因素,因營血皆行于脈中,因此無論何種病因致脈病均可影響血液運行,形成“脈中癥積”。現代研究認為,As發展過程中動脈壁內皮細胞損傷,血小板黏附聚集,彈性纖維破壞和管腔狹窄均歸“血瘀”范疇[44]。毒邪是CKD As發展過程中最嚴重的致病因素,《金匱要略心典》言:“毒,邪氣蘊結不解之謂”。概因脾腎虧虛日久,氣化不利,不能降泄消散痰、熱、瘀、濁等病理產物,引起諸邪積聚不去,化為毒邪。

因此,CKD As病機脾腎兩虛為本虛,濕濁毒邪、瘀血為標實,“虛、濕、瘀、毒”膠結聯合、因果相繼、漸進加重是CKD As的病機關鍵。

2.2 中醫藥干預microRNA治療CKD As的意義

從中醫視角解讀干預miRNA對治療CKD As的調控意義,有兩個方面值得探討:一是中醫病因病機理論;二是中醫學的整體觀念。從中醫病因病機理論來看,CKD As的發病實質是正邪相爭,陰陽失衡的過程,最終形成虛實夾雜的病機,邪勝正負,腎虛氣化失常是腎病傳脈的內在基礎。現代有學者認為[45-46],miRNA與中醫學“腎精氣化”“正氣”等概念相關。腎精是元氣與臟腑之氣的物質基礎,“精化氣”并通過氣化作用促成人體各形體臟腑的生理功能,這類似于現代生物學“中心法則”即遺傳物質轉錄翻譯為蛋白質并實現人體各項生物功能的過程[47]。miRNA與生俱來,是遺傳信息表達的重要調控因子,接近中醫“先天之精”的涵義,并且在“精化氣”階段發揮作用,如劉倩菁等[46]認為腎精化為腎陰陽二氣相似于供能miRNA與其表達的過程。正氣代表人體氣血臟腑陰陽的平衡穩定與抗邪、康復能力,若人體陰陽協調、氣血精津充足的狀態被打破則可導致疾病的發生,正常的miRNA調控作用是人體正氣的微觀化體現[51]。因此調控miRNA的穩定水平實際符合中醫學“扶正祛邪、調和陰陽”的治療原則,這也是從中醫學視角解讀調控miRNA取得疾病療效的重要原因。

中醫學整體觀念來源于古代唯物論與辯證法思想,包括人體內部各組成部分生理病理的相互關聯和人體與環境社會的協調統一性。MiRNA的研究思路與中醫整體觀有一定趨同性,現代研究表明[4],miRNA可以細胞外囊泡和外泌體為載體存在于人體各種體液中,并通過對靶基因的調控作為各組織器官間的病理橋梁如心腎疾病間的相互影響。此外,目前已證實一類miRNA可調控多個靶基因,單一靶基因又可受多種miRNA調控[45],這即體現人體微觀層面的復雜生理聯系,也符合中醫藥治療多成分、多靶點、整體綜合效應的特點。

2.3 MicroRNA與中醫學微觀辨證及CKD As證候探討

辨證是中醫診斷與論治疾病的核心,中醫學微觀辨證[48]即以微觀指標作為辨證依據指導臨床用藥,具有客觀性和精確性的特點,微觀辨證與中醫傳統辨證的有機結合是提高疾病診斷與治愈率的有效手段。現代認為,中醫“證”的即時性與差異性與miRNA的表達的時序特異性與組織特異性類似[49],疾病過程中miRNA表達的動態演變與證候變化密切相關,因此根據疾病不同證型的血清miRNA差異建立對應關系并指導臨床用藥,是現代中醫微觀辨證的主要研究方向之一。

目前對CKD As的證型研究包括脾腎氣虛證、氣陰兩虛證、濕濁證、血瘀證和濁毒證等[50],證候即疾病證型可診察的具有內在聯系的癥狀群反映,可體現某一證型從分子、細胞到器官、系統的綜合動態變化[51]。利用現代分子生物學、基因芯片等技術方法將miRNA引入CKD As證候研究是重要研究方向,其優勢在于可從基因層面進一步闡明CKD As中醫證候的實質,為本病中醫證候研究提供客觀化的物質基礎,更可為中醫藥防治本病提供心得客觀依據和治療靶點。

此外,臨床應用中避免中醫辨證思維的西化是當前微觀辨證的關鍵問題,傳統辨證仍需保持辨證主體地位。而且證的模糊性與抽象性與miRNA等微觀指標的關系復雜性以及對證方藥是否可靶向調節對應miRNA的研究空白仍是中醫微觀辨證研究的幾個難點,對此方面既有良好的研究前景但也是一個任重道遠的過程。

3 中醫藥調控CKD異常microRNA干預As研究進展

中醫藥是中國傳統醫學的精髓,對現代多種疾病的治療具有獨特優勢,中醫藥對miRNA具有多靶點和多層次的調節作用,可通過調控miRNA及相關信號通路的表達以達到預防或逆轉As的效用[52]。通過檢索,目前國內外關于中醫藥調控miRNA直接干預CKD并發As的研究較少,但miRNA作為CKD與As的重要病理“橋梁”,目前研究[52-55]表明多種中藥復方制劑、藥物活性成分及提取物可通過調控CKD異常表達的幾種miRNA如miR126、miR155、miR21、miR223等,繼而從多種途徑影響As病理進展,因此可知應用中醫藥靶向miRNA治療CKD As仍是未來有巨大研究潛力的方向,根據下文的具體綜述可為未來研究思路提供參考。

3.1 中藥復方

中藥復方是現代醫家依據傳統經方法度或自身臨床經驗,針對CKD與As復雜病機,從益氣活血、化濁排毒、補益心腎等多角度,取多藥物協同收效的中藥制劑。現代研究表明,miRNA是多種中藥復方的重要作用靶點,中藥復方可通過調節CKD異常miRNA與相關信號通路表達以干預As進展。如李揚[53]研究表明,益腎排濁方可顯著下調CKD患者血清miRNA21、TGF-β1水平發揮抗纖維化、氧化應激作用,改善CKD預后。秦合偉等[58]通過體內外實驗表明,化痰祛瘀中藥方可上調主動脈miRNA126 mRNA表達,下調其下游信號下調RGS16、CXCL12、CXCR4、VCAM-1 mRNA和蛋白表達,有效減輕As小鼠病變程度,抑制斑塊形成和炎性細胞浸潤,降低VEC凋亡率,提高增殖率。另有研究表明[54],血管軟化丸發揮抗As機制通過下調血清miRNA155表達,調控SOCS1/STAT3/PDCD4信號通路降低炎癥因子水平。中藥復方成分與具體作用機制如表2所示。

表2 中藥復方調控miRNA干預CKD As作用機制

3.2 中藥活性成分

中藥活性成分是從傳統中藥中提取的單味有效成分,通過進一步分離和純化得到,具有多靶點、高效、低毒等優勢[45]。現代研究表明部分中藥活性成分可以調控CKD異常miRNA的表達,從而調節基因表達水平,通過抑制炎癥反應,降低膽固醇水平,促進血管再生和修復等機制發揮作用,對As的治療更具針對性和個體化[56]。目前已發現可通過調節CKD異常miRNA來治療As的中藥單體化合物有人參皂苷、丹皮酚、二氫楊梅素、黃芪甲苷、異黃酮葛根素、枸杞多糖等[57-66],其他藥物活性成分研究較少需進一步挖掘,其具體機制如表3所示。

表3 中藥活性成分調控miRNA干預CKD As機制

4 結論與展望

綜上所述, microRNA作為重要的基因調控因子與CKD As之間存在復雜而多因素的聯系,其異常表達通過多途徑影響內皮功能障礙、氧化應激、炎癥和血管鈣化等病理機制,被確定為CKD As的潛在病理相關因子。作為一種有前景的生物標志物,microRNA有望用于CKD及其相關心血管并發癥如As的診斷和預測,并且作為潛在治療靶點也為現代臨床干預提供了新的方向。中醫藥調控microRNA干預CKD As是一個有巨大潛力的研究領域,結合中醫學“扶正祛邪”治則與現代中醫微觀辨證理念,闡明具體microRNA在CKD As中的致病機制與中醫藥多靶點、多途徑的調控機制,是現代開發新型制劑與治療手段的重點方向。近年來國內學者已對此展開積極探索,如河北北方學院劉圣君團隊研究顯示高水平miRNA301a是腹膜透析患者發生心血管疾病的獨立危險因素,與患者血清高靈敏度C反應蛋白水平(hs-CRP)呈正相關,可有效預測腎病患者心血管事件風險[67]。深圳市中醫院程紅團隊根據As“腎虛、痰瘀”證型創制補腎通脈方,從體外水平證實可上調miRNA126-3p水平,保護ox-LDL誘導的血管內皮細胞損傷[68]。河南中醫藥大學秦合偉課題組[52,54,58]從動物水平開展血管軟化丸、冠心康湯劑對miRNA155、miRNA126、miRNA17-5p等CKD異常表達miRNA及下游mRNA通路干預研究,初步證實中醫藥對As療效與抗炎、抗凋亡、促血管修復等可能機制。但是目前仍存在CKD As中microRNA與靶基因調控網絡及作用機制研究不足,和中醫藥干預機制與手段研究較少等局限,這是推進miRNA臨床應用和中醫特色治療的難點。

因此,未來研究應注重以下幾個方面。一是深化對miRNA與CKD As之間關系認識,重點關注對血管內皮細胞結構功能、氧化應激、炎癥等關鍵環節有重要調節作用的miRNA,借助單細胞測序和miRNA組學研究等先進技術,系統分析關鍵miRNA在CKD As病程的動態變化。二是深入挖掘miRNA與靶標基因的交互網絡,基于網絡藥理學與多組學研究,明確miRNA對于疾病發展的具體調控路徑,闡明作用機制。三是注重miRNA診斷治療的安全性和有效性,這必須基于更完善的基礎和臨床試驗設計,評估miRNA治療的潛在副作用,以及其在不同個體中的差異性。四是挖掘中醫藥的特色價值,結合中醫傳統理論與現代微觀辨證理念,協同分子生物學與臨床醫學等多學科領域,開展中醫復方、中藥單體、針刺、灸療、氣功導引等多手段的miRNA干預機制研究,以便闡明CKD As證候客觀實質,探索中醫藥新的治療途徑與作用靶標,幫助CKD并發As患者改善生活質量并降低其轉化重癥的風險。