海巴戟天對PCOS作用及機制的初步研究

許寶丹 付彥博 彭蕓花

[摘要]?目的?利用超高效液相色譜-串聯質譜技術（ultra-performance?liquid?chromatography-tandem?mass?spectrometry，UPLC-MS/MS）鑒定海巴戟天化學成分，進一步實驗驗證海巴戟天調控miR-223-3p/NLRP3信號通路抑制多囊卵巢綜合征（polycystic?ovary?syndrome，PCOS）大鼠炎癥反應。方法?采用UPLC-MS/MS分析海巴戟天化學成分。動物實驗：SD雌性大鼠采用隨機數字表分為3組：正常對照組（n=5）、PCOS模型組（n=5）和海巴戟天灌胃組（n=5）。HE染色觀察大鼠卵巢組織學形態，ELISA方法測定大鼠睪酮（testosterone，T）、黃體生成素（luteinizing?hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle?stimulating?hormone，FSH）、白細胞介素（interleukin，IL）表達水平，RT-qPCR法檢測大鼠miR-223-3p、NLRP3的mRNA表達，Western?blot法檢測大鼠NLRP3的蛋白表達。結果?UPLC-MS/MS鑒定出海巴戟天化學成分有641種，包括木犀草素、芹菜素、大黃素等多種成分。與正常對照組比較，PCOS模型組卵巢顆粒細胞層數減少，卵泡囊性擴張，閉鎖卵泡增多，T、LH水平升高（P<0.05），FSH水平降低（P<0.05），IL-18、IL-1β水平升高（P<0.05），卵巢組織miR-223-3p?mRNA表達降低（P<0.01），NLRP3?mRNA和蛋白表達升高（P<0.01）；與PCOS模型組相比，海巴戟天灌胃組各級卵泡比例正常，顆粒細胞層數增多，T、LH水平降低（P<0.05），FSH水平升高（P<0.05），IL-18、IL-1β水平降低（P<0.05），卵巢組織miR-223-3p?mRNA表達升高（P<0.05），NLRP3?mRNA和蛋白表達降低（P<0.05）。結論?海巴戟天能夠改善PCOS大鼠卵巢病理狀態，改變異常性激素及降低IL-18、IL-1β水平，其機制可能是通過調控miR-223-3p/NLRP3信號通路抑制PCOS大鼠炎癥反應。

[關鍵詞]?多囊卵巢綜合征；海巴戟天；超高效液相色譜-質譜；miR-223-3p/NLRP3信號通路；模型大鼠

[中圖分類號]?R71???????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.08.016

A?preliminary?study?on?the?effect?and?mechanism?of?PCOS?in?Morinda?citrifolia

XU?Baodan1，?FU?Yanbo1，?PENG?Yunhua2

1.Department?of?Obstetrics?and?Gynecology，?the?Second?Affiliated?to?Hainan?Medical?University，?Haikou?570216，?Hainan，?China;?2.Hainan?Medical?University，?Haikou?571199，?Hainan，?China

[Abstract]?Objective?To?use?the?ultra-performance?liquid?chromatography-tandem?mass?spectrometry?（UPLC-MS/MS）?to?authenticate?the?chemical?composition?of?Morinda?citrifolia，?and?further?experiments?verify?that?Morinda?citrifolia?regulate?miR-223-3p/NLRP3?signaling?pathway?to?inhibit?the?inflammatory?response?in?rats?with?polycystic?ovary?syndrome（PCOS）.?Methods?Use?UPLC-MS/MS?analyze?the?chemical?composition?of?Morinda?citrifolia.?SD?female?rats?were?randomly?divided?into?three?groups：?normal?control?group?（n=5），?PCOS?model?group?（n=5）?and?Morinda?citrifolia?gavage?group?（n=5）.?HE?staining?observe?the?morphology?of?ovarian?histology，?ELISA?method?detect?the?expression?levels?of?testosterone?（T），?luteinizing?hormone?（LH），?follicle?stimulating?hormone?（FSH），?interleukin?（IL）-1βand?IL-18，?RT-qPCR?detect?the?mRNA?expression?of?miR-223-3p?and?NLRP3，?and?Western?blot?detect?the?protein?expression?of?NLRP3.?Results?UPLC-MS/MS?identify?641?chemical?composition?of?Morinda?citrifolia，?including?luteolin，?Apigenin，?emodin?and?other?composition.?Compared?with?the?normal?control?group，?the?number?of?cell?layers?of?ovarian?granule?in?the?PCOS?model?group?is?reduced，and?follicular?cystic?dilation，?atresia?follicles?increased，?T?and?LH?levels?increased?（P<0.05），?FSH?levels?decreased?（P<0.05），?IL-18?and?IL-1β?levels?increased?（P<0.05），?and?ovarian?tissue?miR-223-3p?mRNA?expression?decreased?（P<0.01），?NLRP3?mRNA?and?protein?expression?increased?（P<0.01）?in?PCOS?model?group.?Compared?with?the?PCOS?model?group，?the?proportion?of?follicles?at?all?levels?is?normal，?the?number?of?granule?cell?layers?increased，?T?and?LH?levels?decreased?（P<0.05），?FSH?levels?increased?（P<0.05），?IL-18?and?IL-1β?levels?decreased?（P<0.05），?miR-223-3p?mRNA?expression?in?ovarian?tissue?increased?（（P<0.05），?NLRP3?mRNA?and?protein?expression?decreased?（P<0.05）?in?Morinda?citrifolia?gavage?group.?Conclusion?Morinda?citrifolia?can?improve?the?ovary?pathological?state?of?PCOS?rats，?change?the?abnormal?sex?hormones?and?reduce?the?levels?of?inflammatory?factors?IL-18?and?IL-1β.The?mechanism?maybe?regulate?the?miR-223-3p/NLRP3?signaling?pathway?to?inhibit?the?inflammatory?response?in?PCOS?rats.

[Key?words]?Polycystic?ovary?syndrome;?Morinda?citrifolia;?UPLC-MS/MS;?miR-223-3p/NLRP3?pathway;?Model?rat

多囊卵巢綜合征（polycystic?ovary?syndrome，PCOS）是影響育齡期女性不孕的生殖內分泌疾病之一，表現為異常排卵、高雄激素血癥、糖脂代謝紊亂等，還會引起子宮內膜病變、心血管病變等遠期并發癥[1]。PCOS病因不清，發病機制多樣。Kelly等[2]首次提出慢性低度炎癥可能介導PCOS的發生。PCOS的“炎癥學說”逐漸成為研究熱點。海巴戟天是茜草科巴戟天屬植物，近些年越來越多的研究報道海巴戟天具有抗炎、抗氧化應激、抑菌等現代藥理作用[3-4]。有研究表明海巴戟天能夠抑制結腸炎的發展，還有研究表明海巴戟天的活性成分可以防治炎癥性疾病[5-6]。海巴戟天具有廣泛的抑炎作用，但目前在PCOS的相關研究不多。研究表明，miR-223-3p/NLRP3信號通路介導類風濕性關節炎、子癇前期等多種炎性疾病，但目前未發現有關miR-223-3p/NLRP3信號通路在PCOS炎癥反應的研究[7-8]。本課題組前期細胞實驗發現miR-223-3p與NLRP3存在結合位點，同時發現海巴戟天作用在PCOS顆粒細胞，能夠上調miR-223-3p表達、下調NLRP3表達。基于前期研究基礎，本次研究利用UPLC-MS/MS技術鑒定海巴戟天化學成分，通過動物實驗驗證海巴戟天調控miR-223-?3p/NLRP3信號通路對PCOS大鼠炎癥反應的抑制作用。

1??材料與方法

1.1??實驗動物

SPF級SD雌性大鼠，體質量（120±20）g，21日齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（粵）2022-0063。根據國家標準嚙齒類實驗動物要求進行喂養，實驗動物自由進食飲水，適應性喂養。所有實驗動物獲得海南醫學院倫理委員會的批準（倫理審批號：HYLL-?2021-127號）。15只SPF級SD雌性大鼠采用隨機數字表法分為3組，即正常對照組、PCOS模型組和海巴戟天灌胃組，每組各5只。PCOS模型組和海巴戟天灌胃組大鼠，皮下注射DHEA0.06mg/g?+?0.2ml甘油建立PCOS模型。正常對照組大鼠皮下注射等量生理鹽水。在造模第21天時，連續進行7天陰道涂片，觀察大鼠動情周期，當大鼠失去規律動情周期，睪酮（testosterone，T）、黃體生成素（luteinizing?hormone，LH）水平升高，卵泡刺激素（follicle?stimulating?hormone，FSH）水平降低視為造模成功。造模成功后，海巴戟天灌胃組大鼠予2.7g/kg的給藥劑量灌胃，正常對照組與PCOS模型組大鼠予同等量的生理鹽水灌胃，每天一次，連續灌胃21d。頸椎脫臼法處死大鼠后，解剖分離出大鼠卵巢，用4%多聚甲醛固定一側卵巢組織，常規脫水、石蠟包埋，切片，顯微鏡下觀察大鼠卵巢病理變化。

1.2??儀器與試劑

1.2.1??儀器??超高效液相（型號1290?UPHLC，美國Agilent公司）；高分辨質譜（型號Q?Exactive?Focus，美國Thermo?Fisher?Scientific公司）；離心機（型號Heraeus?Fresco17，美國Thermo?Fisher?Scientific公司）；天平（型號BSA124S-CW，德國Sartorius公司）；研磨儀（型號JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）；純水儀（型號明澈?D24?UV，美國Merck?Millipore公司）；超聲儀（型號YM-080S，深圳市方奧微電子有限公司）；色譜柱（美國Waters公司）。

1.2.2??試劑??純度LC-MS級甲醇、乙腈（CNW?Technologies公司）；純度LC-MS級甲酸（美國Sigma公司）；L-2-氯苯丙氨酸，純度≥98%（上海恒柏生物科技有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。DHEA（美國Invivo?Chem公司）；大鼠睪酮ELISA試劑盒、大鼠促卵泡素ELISA試劑盒、大鼠黃體生成素ELISA試劑盒、大鼠白細胞介素1β?ELISA試劑盒、大鼠白細胞介素18?ELISA試劑盒（凡科維公司）；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒（上海吉至生化科技公司）；qRT-PCR引物（北京擎科生物科技有限公司）；EastepSuper總RNA提取試劑盒[普洛麥格（北京）生物技術有限公司]；SuperMix?for?qPCR（gDNA?digester?plus）、qPCRGreen?Master?Mix（翌圣生物科技股份有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、PVDF膜、BeyoECL?Moon（碧云天生物技術有限公司）；NLRP3、內參GAPDH（英國Abcam公司）。實驗用藥海巴戟天干；生理鹽水（四藥公司，貨號H13023200）。

1.3??UPLC-MS/MS

1.3.1??提取樣品??稱取100mg的樣本，加入500μl提取液，通過冰水浴超聲、乙腈渦旋、甲醇復溶、離心等步驟后取得上清液，備予上機檢測。

1.3.2??色譜和質譜條件??色譜柱為UPLC?BEH?C18色譜柱（1.7μm×2.1μm，100mm）；進樣體積為5μl。質譜條件：采用正/負離子模式，掃描范圍為100～1500m/z；鞘氣流速：45Arb；輔助氣流速：15Arb；毛細管溫度：400℃；全毫秒分辨率：70000；MS/MS分辨率：17500；噴霧電壓：4.0kv（正極）或3.6kv（負極）。

1.4??檢測miR-223-3p、NLRP3的mRNA與蛋白的表達

使用EastepSuper總RNA提取試劑盒從卵巢組織中提取總RNA，并將RNA反轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR檢測，按照T、LH、FSH試劑盒說明書步驟進行大鼠性激素檢測，按照IL-18、IL-1β試劑盒說明書步驟進行大鼠炎性因子水平檢測。取凍存的卵巢組織于研缽中，加入PMSF，于液氮中凍融、研磨，重復多次進行，離心后取上清液行蛋白定量（BCA法）檢測蛋白濃度，在剩余蛋白樣品中轉移到SDS-PAGE緩沖膠上，然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜，并與一抗在4℃的溫度下搖床孵育過夜。所有斑點用化學發光ECL試劑盒顯示。

1.5??統計學方法

采用Graph?Pad?Prism9.5.0進行統計分析，計量數據以均數±標準差（）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??UPLC-MS/MS檢測結果

UPLC-MS/MS鑒定海巴戟天主要化學成分，共分析鑒定出641種化學成分，包括木犀草素、芹菜素、大黃素等多種化合物，涉及黃酮類、萜類、苯丙素類等多種來源。

2.2??大鼠卵巢組織病理變化

對照組大鼠卵巢可見各級發育階段中的卵泡，顆粒細胞層大多為8～9層，見結構正常的黃體；PCOS模型組大鼠卵巢卵泡囊樣擴張及出現閉鎖卵泡，亦可見顆粒細胞層數減少。與PCOS模型組相比，海巴戟天灌胃組大鼠各級卵泡比例趨于正常，顆粒細胞層數增加。見圖1。

2.3??性激素與炎性因子水平變化

與對照組比較，PCOS模型組大鼠T水平升高（P<0.01），LH水平升高（P<0.05），FSH水平降低（P<0.05）；與PCOS模型組比較，海巴戟天灌胃組大鼠T、LH水平降低（P<0.05），FSH水平升高（P<0.05）。見圖2。

與正常對照組比較，PCOS模型組大鼠IL-18水平升高（P<0.05），IL-1β水平升高（P<0.01）；與PCOS模型組比較，海巴戟天灌胃組大鼠IL-18、IL-1β水平降低（P<0.05）。見圖3。

2.4??大鼠卵巢組織miR-223-3p、NLRP3的mRNA與蛋白表達

與對照組比較，PCOS模型組大鼠卵巢組織miR-?223-3p?mRNA表達降低（P<0.01），NLRP3?mRNA表達升高（P<0.01）。與PCOS模型組比較，海巴戟天灌胃組miR-223-3p?mRNA表達升高（P<0.05），NLRP3?mRNA表達降低（P<0.05）。見圖4。

與對照組比較，PCOS模型組大鼠卵巢組織NLRP3蛋白表達升高（P<0.01）；與PCOS模型組比較，海巴戟天灌胃組大鼠卵巢組織NLRP3蛋白表達降低（P<0.01）。見圖5。

3??討論

PCOS是內分泌代謝紊亂與生殖功能受損并存的綜合性疾病[9]。研究表明慢性低度炎癥是PCOS發病基礎，誘導PCOS出現胰島素抵抗、高雄狀態、卵泡發育異常，促進PCOS發生、發展[10-11]。研究發現，海巴戟天具有一定的抗炎作用，其提取物能夠抑制炎性疾病，但在PCOS的作用研究不多。本研究結果顯示海巴戟天化學成分有641種，包括木犀草素、芹菜素、大黃素等成分。研究發現木犀草素能夠改變PCOS大鼠異常的性激素水平，減少多囊卵巢及卵巢黃體的凋亡[12-13]。Peng等[14]還發現芹菜素能夠改善PCOS大鼠的脂代謝紊亂，抑制TNF-α和IL-6水平，同時對PCOS大鼠發揮保護性作用并能改善卵泡異常發育。此外還發現大黃素能夠緩解PCOS大鼠卵巢病變、穩定性激素水平[15]。這提示海巴戟天對PCOS的發展具有抑制作用，但其中作用機制需進一步的實驗研究。

因此從炎癥反應角度出發，本研究通過DHEA方法構造PCOS大鼠模型，結果表明PCOS模型組大鼠卵巢病理形態發生改變，T、LH水平升高，FSH水平降低，以上判定PCOS大鼠造模成功。HE染色結果顯示正常對照組大鼠卵巢顆粒細胞呈多層，各級發育的卵泡多見；PCOS模型組大鼠卵巢顆粒細胞層數減少，卵泡囊性擴張，閉鎖卵泡增多；而海巴戟天灌胃組大鼠卵泡比例正常、顆粒細胞層數增多。ELISA檢測結果顯示海巴戟天能夠降低PCOS大鼠T、LH水平（P<0.05），升高FSH水平（P<0.05），降低IL-18、IL-1β水平（P<0.05）。提示海巴戟天能夠降低炎癥因子表達，改善模型大鼠卵巢病理狀態，改變異常的性激素水平。

NLRP3廣泛參與多種疾病的炎癥反應。研究發現，激活的NLRP3使下游因子IL-18、IL-1β表達增加，從而誘導了PCOS小鼠炎癥反應[16-17]。miRNAs是近年來研究的熱點因子，能夠調節多種生物學過程。miR-223-3p被證實能靶向抑制下游分子NLRP3的表達，介導疾病的炎癥反應過程[18-19]。劉雪瓊等[8]研究了子癇前期胎盤的炎癥反應，發現miR-223-3p通過靶向抑制NLRP3表達，抑制IL-18、IL-1β的釋放，因而緩解子癇前期的炎癥過程。Chen等[20]在對自身性心肌炎的研究中發現，上游信號miR-223-3p通過調控NLRP3的表達，以此能夠改善心肌炎的炎癥發生。miR-223-3p/NLRP3通路參與了多種疾病的炎癥過程，但目前尚未發現miR-223-3p/NLRP3通路在PCOS炎癥反應的作用研究。

本課題組前期細胞實驗研究發現miR-223-3p與NLRP3存在結合位點，海巴戟天能夠上調miR-?223-3p表達，抑制NLRP3表達。海巴戟天能夠升高PCOS大鼠卵巢組織miR-223-3p?mRNA表達（P<0.05），降低NLRP3?mRNA?和蛋白表達（P<0.05）。提示海巴戟天可能通過調控miR-223-3p/NLRP3信號通路介導對PCOS大鼠炎癥反應的抑制作用。

綜上所述，海巴戟天對PCOS模型大鼠具有抑制作用，并可能通過調控miR-223-3p/NLRP3信號通路抑制PCOS大鼠的炎癥反應，從而緩解PCOS的發生發展，為海巴戟天應用于PCOS提供了初步的理論基礎。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–05–05）

（修回日期：2023–11–30）