基于穩定同位素的水生生物食物鏈結構特征分析

張耀方，李添雨，李卓軒,2，葉芝菡，薛萬來，黃炳彬，李 壘*，張天嬌,3，董 瀾,3

1. 北京市水科學技術研究院，流域水環境與生態技術北京市重點實驗室，北京 100048

2. 北京交通大學，北京 100044

3. 北京林業大學，北京 100091

北京河湖水系受自然地理特征、生態補水、人為活動等不同程度的影響，水生生物食物鏈結構差異較大，明晰其差異性、識別存在的問題對未來水生態系統保護修復至關重要[1]. 但目前對水生生物的分析重點圍繞多樣性方面[2]，評價結果無法進一步反映水生生物食物鏈的組成、結構和功能，難以反映水生態系統的物質循環和能量傳遞過程. 有研究[3-9]表明，水生生物攝食過程中碳、氮穩定同位素比率會因新陳代謝富集產生變化，δ13C、δ15N 在食物鏈上每傳遞一級分別富集0～1‰、3‰～4‰，常用這兩種同位素比率變化追溯水生生物攝食食源組成、貢獻、營養水平.有學者利用水生生物碳、氮同位素差異，并結合經驗和數理統計方式，開展水生生物營養譜構建、攝食關系定量[8-11]；此外，不少學者利用δ13C-δ15N 散點圖探討水生生物的生態位寬和重疊程度，反映水生生物攝食關系[3,12-13]. 基于此，本研究選取北京市潮白河流域、永定河流域、北運河流域三大不同人為影響、不同水源條件的流域[14-16]，山區、平原不同地理條件河段作為研究區域，食物鏈不同營養級水生生物為研究對象，依托碳、氮穩定同位素結果并耦合貝葉斯模型，定量分析評價不同流域水生生物碳、氮穩定同位素的差異、攝食關系、食物網結構，以期為后續水生態系統狀況綜合評價、增殖放流、生物操控等水生態保護修復對策提供科學指導.

1 材料與方法

1.1 研究區域

樣品采集于北京北運河流域的清河、涼水河等水體〔以再生水為主，水深1～2 m，流速＜0.3 m/s，水質總體穩定在Ⅳ～Ⅴ類(GB 3838-2002《地表水環境質量標準》)〕，潮白河流域的潮河、白河等水體(以天然徑流為主，水深0.2～1 m，流速0.3～0.8 m/s，水質總體穩定在Ⅱ～Ⅲ類)，以及永定河流域的永定河(以天然徑流及外調黃河水為主，水深0.5～2 m，流速0.3～1.2 m/s，水質總體穩定在Ⅲ～Ⅳ類)，采樣時間為2022 年8 月(夏季)，共布設30 個采樣點(見圖1).

圖1 北京地區不同流域河道采樣點分布Fig.1 River sampling sites in different watersheds in Beijing

1.2 樣品采集

采集水樣測定主要水質指標，并采集水生植物、浮游植物、浮游動物、底棲動物、魚類等水生生物樣品，水生生物樣品采集方法參照《水生生物調查技術規范》(DB11/T 1721-2020)[17]. 有機碎屑采用直徑為25 mm 的Whatman GF/F 玻璃纖維濾膜對水樣進行預處理，將濾膜放入鋁盒，于馬弗爐中450 ℃灼燒3 h，以去除有機物，濾膜冷卻后放入1 mol/L 的濃鹽酸中酸化24 h，然后在烘箱中60 ℃下恒溫烘干48 h；水生植物取組織樣品，用剪子剪碎后冷干24 h 后取出搗碎密封；浮游植物用100 μm 篩絹過濾取其濾液，浮游動物取其留在篩絹上的組織樣品，蒸餾水清養3 h，分別抽濾至兩張GF/C 濾膜上，置于60 ℃下低溫烘干(36～48 h)，刮下其組織樣品；底棲動物按照攝食類型捕食者、鉆食者、刮食者、牧食者、濾食者[5]分類取其組織樣品、魚類按照種分別取其組織樣品，冷干24 h 后取出搗碎密封[18-21]. 前處理后用于測定穩定同位素.

1.3 分析方法

1.3.1 穩定同位素測試

將制備好的樣品放入穩定同位素比質譜儀(MAT253，賽默飛世爾科技公司，美國)進行碳、氮同位素(δ13C、δ15N)的測定，分析所采用的參照物質分別是V-PDB(Pee Dee Belemnite)和空氣中的氮氣，標準物質分別為國際通用的IAEA-CH-6 和IAEA-N-1. 為保證實驗結果的精確度和準確性，每10 個樣品進行重復測定，碳、氮穩定同位素比值的分析精度均為0.2‰. 結果采用三點校正，即用USGS62(δ13CPDB=-14.79‰，δ15Nair=20.17 ‰)、USGS40(δ13CPDB=- 26.389 ‰，δ15Nair=-4.52 ‰)和UREA(δ13CPDB=- 37.02 ‰，δ15Nair=-2.91‰)對碳氮同位素測定結果進行校正. δ13C 或δ15N 比值計算公式如下：

式中，R代表δ13C 或δ15N 比值， Xsample、Xstandard分別代表樣品和標準物質中的δ13C 或δ15N[6].

1.3.2 環境因子測定

在實驗室參照HJ 636-2012《水質 總氮的測定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》、GB/T 11893-1989《水質 總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》、HJ 535-2009《水質 氨氮的測定 納氏試劑分光光度法》、HJ 828-2017《水質 化學需氧量的測定 重鉻酸鹽法》、HJ 897-2017《水質 葉綠素a 的測定 分光光度法》國家/行業標準分別測定總氮(TN)、總磷(TP)、氨氮(NH3-N)、化學需氧量(CODCr)、葉綠素a(Chla)濃度.

1.4 數據分析

1.4.1 碳、氮同位素重疊分析

采用Python 編寫代碼，以δ13C 作為橫坐標、δ15N作為縱坐標，按照水生生物類型分類繪制散點圖，將散點分布范圍以矩形方式進行連接，并計算不同類型水生生物之間的重疊區域.

1.4.2 營養級計算

營養級計算公式如下：

式中：以浮游動物作為基本線，δ15Nsample代表樣品的氮同位素比值；δ15Nbaseline代表基準生物氮同位素比值；Δδ15N代表氮富集因子，該研究取3.4‰[6,22].

1.4.3 攝食比例分析

通過文獻查閱、經驗以及碳、氮同位素營養級分析，確定水生生物可能的攝食餌料，而后使用R 語言中的“MixSIAR”工具包，以攝食餌料作為解釋變量，以δ13C、δ15N 值作為響應變量，輸入消費者和潛在攝食餌料的碳、氮同位素比值，構建貝葉斯模型，推算攝食餌料中各種餌料的貢獻比值[18-20,23-27]. 對于消費者M的同位素特征δM如下：

式中：n為消費者M對應的餌料種類數；fi為第i個食物源對混合物的貢獻比例；δi為第i個食物源的穩定同位素與特征；γi為第i個食物源的同位素特異性分餾值，其中氮同位素取3.4‰，碳同位素取1.3‰[27].

1.4.4 環境因子影響分析

利用Origin 軟件進行不同類型河道TN、TP、NH3-N、CODCr、Chla 與水生生物碳、氮穩定同位素之間的Pearson 相關性分析.

2 結果與分析

2.1 不同流域河道碳、氮同位素特征

潮白河流域山區河道、永定河流域山區河道、永定河流域平原河道和北運河流域平原河道水生生物種群組成差異較大，其水生生物優勢種以狐尾藻、菹草和金魚藻為主，蓋度分別為50%、60%、30%和80%；浮游植物優勢類群以硅藻和藍藻為主，總密度依次為173×104、39×104、1 238×104和6 714×104cells/L；浮游動物優勢類群以輪蟲、橈足類為主，總密度依次為8、2.9、144、10 μg/L；底棲動物優勢類群分別依次為清潔種、清潔種、清潔種-中污種、耐污種；魚類均以雜食性為主.

由圖2 可知，水生生物δ15N 總體呈現魚類＞底棲動物＞浮游動物、浮游植物及水生植物＞有機碎屑的特征，同一流域內魚類、底棲動物與低營養級水生生物之間δ15N 差異顯著，一般較之分別增加了73%～223%、49%～158%，低營養級水生生物之間δ15N 差異不顯著. 不同流域不同水生生物δ15N 差異顯著，其中永定河流域、潮白河流域河道魚類δ15N 總體穩定在8‰～18‰之間，顯著大于北運河流域δ15N(5‰～15‰)；底棲動物δ15N 呈現出相反的趨勢，總體上北運河流域在8‰～15‰之間，大于永定河流域、潮白河流域(8‰～13‰)；浮游動物、浮游植物δ15N 呈現永定河流域、北運河流域總體大于潮白河流域的特征；水生植物δ15N 呈現永定河流域、潮白河流域山區河道大于北運河流域、永定河流域平原段的特征；有機碎屑δ15N 呈現永定河流域總體大于北運河流域、潮白河流域的特征.

圖2 不同流域河道碳、氮同位素特征Fig.2 Carbon and nitrogen isotope characteristics of river channels in different watersheds

由水生生物δ13C 分布可知：δ13C 總體呈現有機碎屑＞浮游動物、浮游植物＞魚類、底棲動物的特征，同一流域內除有機碎屑和水生植物外，水生生物δ13C總體差異不顯著，均表現出較大程度的重合性，穩定在-27‰～-20‰之間. 不同流域之間水生生物δ13C 存在一定差異，永定河流域、潮白河流域有機碎屑與其余水生生物δ13C 差異極大，總體不存在重疊交叉區域，北運河流域則反之.

由δ15N、δ13C 區間分布矩形可知：不同流域δ15N、δ13C 呈現不同上升趨勢，永定河流域、潮白河流域山區河道均總體呈現“L”型階梯上升趨勢，永定河流域平原河道呈現“ ”型上升趨勢，北運河流域呈現“│”型上升趨勢. 不同流域不同水生生物δ15N、δ13C 矩陣分布重疊情況也呈現顯著差異性，永定河流域山區河道、永定河流域平原河道、潮白河流域山區河道和北運河流域平原河道中魚與底棲動物重疊部分占比分別為51.18%、39.32%、25.76% 和47.96%，與浮游動物、浮游植物、水生植物重疊比例分別為9.26%、10.15%、0%和53.73%，北運河流域中魚類與其他水生生物δ15N、δ13C 分布區間呈現大范圍重疊.

2.2 不同流域水生生物營養級及攝食特征

由圖3 可知，永定河流域山區河道、永定河流域平原河道、北運河流域平原河道和潮白河流域山區河道魚類營養級平均值分別為2.57、2.79、2.38 和3.22；底棲動物營養級平均值分別為2.03、2.22、2.77和2.44；浮游動物營養級平均值分別為1.14、1.29、1.96 和0.95. 不同水生生物營養級總體呈現肉食性魚類＞雜食性魚類＞底棲捕食者＞底棲刮食者、濾食者、牧食者、鉆石者＞浮游動物、浮游植物、水生植物的特征. 在空間尺度上，不同流域呈現出顯著差異性，肉食性魚類營養級呈現永定河流域、潮白河流域＞北運河流域的特征，雜食性魚類呈現潮白河流域＞永定河流域＞北運河流域的特征，底棲動物及浮游動物、浮游植物營養級總體呈現北運河流域＞潮白河流域、永定河流域的特征，北運河流域出現營養級“倒掛”現象.

圖3 不同流域同類型水生生物營養級特征Fig.3 Trophic level characteristics of homogeneous aquatic organisms in different watersheds

由圖4 可知，同一種魚類在不同流域攝食偏好上總體表現出一致性，但具體的攝食比例上表現出顯著差異性：肉食性魚類紅鰭原鲌在不同流域對水生生物的攝食比例不同，但均以攝食魚類為主，攝食比例為60%～82%，其次為底棲動物，攝食比例為15%～32%；馬口魚也呈現出相同的趨勢. 棒花魚、麥穗魚等雜食性魚類在不同流域對底棲動物、浮游動物、浮游植物、水生植物等攝食偏好上總體體現出一致性. 除北運河流域以外，其余流域河道雜食性魚類對底棲動物攝食比例總體在50%以上（尤其以捕食者及牧食者為主），而對水生植物、浮游植物的攝食比例遠小于北運河流域. 底棲動物在不同流域其偏好性總體保持一致，但是攝食比例上有一定差異，刮食、濾食、牧食類底棲動物以水生植物、浮游植物、浮游動物為主，攝食比例在80%左右；底棲捕食者以底棲牧食者為主要餌料，為30%～70%；底棲捕食者以底棲刮食者為主要餌料，攝食比例在40%左右.

圖4 不同流域水生生物攝食比例Fig.4 Feeding ratios of aquatic organisms in different watersheds

2.3 水生生物穩定同位素與環境因子相關關系

對TN、TP、NH3-N、CODCr、Chla 濃度與不同水生生物δ13C、δ15N 進行Pearson 相關性分析，由表1可知，魚類、底棲動物δ13C 與TN 濃度呈極顯著負相關，與CODCr濃度呈極顯著正相關，Pearson 相關系數絕對值在0.4～0.5；水生植物δ13C 與Chla 濃度呈極顯著正相關，且Pearson 相關系數達到0.7. 由表2 可知，魚類、有機碎屑δ15N 與TN 濃度呈極顯著負相關，Pearson 相關系數絕對值約0.6；魚類δ15N 與TP 濃度呈極顯著負相關，Pearson 相關系數絕對值小于0.5；魚類、浮游動物、浮游植物、有機碎屑δ15N 與CODCr濃度呈極顯著負相關，其中有機碎屑δ15N 與CODCr濃度Pearson 相關系數絕對值達到0.73，其余Pearson相關系數均小于0.5.

表1 各環境因子與δ13C 的相關性分析Table 1 Correlation analysis of each environmental factor with δ13C

表2 各環境因子與δ15N 的相關性分析Table 2 Correlation analysis of each environmental factor with δ15N

3 討論

3.1 不同營養級水生生物碳、氮同位素特征

不同類型水生生物化學元素總體穩態分布，該研究結果表明，在永定河流域、潮白河流域和北運河流域，不同空間緯度、較大地理和生態梯度的水體中，營養級總體均在0～4 級之間，δ13C 總體均分布在-30‰～-10‰之間，δ15N 總體均分布在0～18‰之間，這與大量研究認為消費者碳、氮同位素不易受溫度等環境變化的影響，其自身化學成分含量及比例在自然界中總體具有化學計量穩態機制的結論[7]一致. 不同營養級水生生物總體呈現出δ15N 隨著水生生物營養級增加而上升的趨勢，δ13C 隨著水生生物營養級增加而降低趨勢，但δ13C 的變化顯著小于δ15N 的變化，這與氮同位素特異性分餾值(3.4‰)大于碳同位素特異性分餾值(1.3‰)[27]表現出一致性.

高營養級水生生物δ15N、δ13C 形成的矩陣與低營養級水生生物δ15N、δ13C 形成的矩陣具有一定的重疊區間，魚類δ15N、δ13C 形成的矩陣與浮游動物、浮游植物、水生植物δ15N、δ13C 形成的矩陣重疊比例呈現潮白河流域＜永定河流域山區河道、永定河流域平原河道＜北運河流域的特征，這反映了北運河流域消費者對浮游動、植物攝食較多. 有研究表明，攝食重疊程度隨著資源可用程度和河流食物網冗余程度的增加而增加，在高度營養過剩的河流食物網中泛化種盛行，水生態系統內部消費者食譜變化可能很微小[23]，這與高營養鹽的北運河流域食物網結構冗余、攝食結構較單一的現狀相一致. 底棲動物、浮游動物δ15N、δ13C 與浮游植物δ15N、δ13C 矩陣之間重疊比例在不同流域間差異較小，低營養級水生生物δ15N、δ13C 總體與營養鹽相關性弱，這與低營養級水生生物除受水環境影響外，同時易受生境、水流等影響有關；高營養級魚類δ15N、δ13C 與TN、TP、CODCr均顯著相關，且經過食物鏈傳遞、同位素的分餾，更能穩定反映不同水環境質量的差異性的研究結論[28-31]一致，采用魚類δ15N、δ13C 矩陣與其余水生生物δ15N、δ13C 矩陣之間的差異能更有效地指示水體水生態系統結構、功能的差異.

3.2 不同流域水生生物食物鏈結構空間異質性

不同流域δ15N 隨食物鏈傳遞呈現不同上升趨勢，δ15N 在不同分布區域表現出較顯著差異，永定河流域、潮白河流域δ15N 總體呈現顯著的階梯上升趨勢，不同營養級之間δ15N 交叉較小，而北運河流域δ15N 呈現大范圍疊加上升趨勢. 不同流域高營養級消費者(魚類)δ15N 呈顯著差異，永定河流域山區河道、永定河流域平原河道、潮白河流域山區河道和北運河流域平原河道不同空間分布的魚類δ15N 范圍分別為7.55‰～17.93‰、10.53‰～16.35‰、7.72‰～15.33‰和5.47‰～15.40‰，平均值分別為13.03‰、13.21‰、11.98‰和9.15‰，潮白河及永定河流域河道魚類δ15N 總體高于北運河流域河道，而底棲動物、浮游動物、浮游植物、水生植物則總體呈現相反趨勢. 不同流域之間水生生物δ13C 存在一定差異，永定河流域、潮白河流域有機碎屑與其余水生生物δ13C 差異極大，北運河流域水生生物δ13C 總體重疊，且局部出現營養級“倒掛”現象.這些均反映了不同流域水生態系統中有機物在水生生物中循環路徑的差異，從而導致水生生物食物鏈結構空間異質性.

分析上述空間異質性的原因：一方面，有學者認為水生生物δ15N 受不同水層氮交換程度的影響[32]，水生生物δ13C 組成與水深呈顯著負相關[22,33]，不同空間緯度水溫、流速、生境等差異也會導致不同流域水生生物物種組成、結構上有很大差異，從而碳、氮同位素差異很大[34]；另一方面，受人類活動影響也是其中一個關鍵要素，北運河流域污染負荷遠大于潮白河流域和永定河流域，有研究表明受不同營養鹽條件的影響，初級生產者無機碳和有機碳來源的差異隨著食物鏈向上傳遞至底棲動物、魚類，從而呈現出魚類、底棲動物δ13C 的時空差異[7,34]，這也和研究結果中魚類、底棲動物δ13C 與TN、CODCr濃度呈極顯著相關相一致，同時人和動物產生的污水尤其是經過二次處理后的污水中δ15N(10‰～20‰)通常比本身生態系統高[35]，抬高了河道中水生植物、浮游動物、浮游植物、底棲動物的δ15N，水生生物種群間因營養位置引起的同位素組成差異，這與該研究中以再生水為主的北運河流域底棲動物、浮游動物、水生植物δ15N 總體大于其他流域表現一致；此外，受食源影響，北運河流域可攝食食物豐富，而潮白河流域、永定河流域食源相對較少，同種水生生物在不同區域攝食關系也表現出極大差異性，該研究中棒花魚、麥穗魚等雜食性魚類在潮白河流域、永定河流域對底棲動物攝食比例遠大于北運河流域，對水生植物、浮游植物的攝食比例遠小于北運河流域，伴隨著從低營養級向高營養級水生生物進行物質循環、能量傳遞過程，導致北運河流域魚類δ15N 小于其他流域、δ13C 總體重疊，且營養級與浮游動物差異不大乃至“倒掛”.

3.3 穩定同位素技術在水生態保護修復中的應用

穩定同位素技術可以在較大尺度上對水生態系統中物質來源及遷移轉化過程進行追蹤分析，對反映水生態系統中物質循環、能量流動有著重要作用[3,7-8,36-37]. 該技術應用前景廣闊：一是采用魚類δ15N指示水生生物營養結構差異，該研究表明，魚類δ15N總體穩定在5‰～18‰之間，與營養鹽變化呈現顯著相關性，能反映不同水環境特征差異，同時魚類作為水生態系統中的高營養級消費者，生長周期長、同一類型水體中波動小，且魚類δ15N 可以反映較長的攝食歷史、完整的攝食過程，相對于初級生產者、低營養級消費者而言，可作為理想水生生物營養結構變化指示因子[3,28,34]；二是不同流域各類生物δ15N、δ13C 分布矩陣重疊度，可以很好地表征河流食物網冗余程度，通過食物網冗余程度分析可以更加直觀反映水生態系統受可用資源的改變，其攝食行為的改變以及系統穩定性變化[23]，也可采用食物網冗余對象為參考指導水生態系統修復的方向；三是科學指導生物操控，結合貝葉斯模型可獲取各類水生生物攝食矩陣，從而定量分析水生生物攝食食物及比例[36,38-39]，該研究結果表明營養級越高的生物攝食關系越復雜，偏好性越不顯著，營養級相對較低的底棲動物、浮游動物偏好性較顯著，在開展生物操控時，可因地制宜結合其本底水生生物特征、目標物種的攝食矩陣，并在此基礎上利用穩定同位素的手段進一步分析不同季節生物攝食的差異性，投放適宜比例的攝食該類型的水生動物、營造其適宜的生境條件.

4 結論

a) 潮白河流域、永定河流域、北運河流域河道低營養級的浮游動植物由于受水動力、水生生境變化影響，波動較大，而高營養級的水生生物δ13C、δ15N能更好地指示水體水生態系統結構功能的變化，建議在進行水生生物食物網結構分析時可采用魚類δ15N、高營養級水生生物與低營養級水生生物δ15N、δ13C分布矩陣重疊度表征水生生物食物網結構狀況.

b) 不同流域河道水生生物碳、氮同位素具有空間異質性，永定河流域、潮白河流域δ15N 總體呈現顯著的階梯上升趨勢，不同營養級之間δ15N 交叉較小，而北運河流域δ15N 呈現出大范圍疊加上升趨勢，此外，北運河流域魚類δ15N 總體小于其他流域，而底棲動物、浮游動物、浮游植物、水生植物則總體呈現相反趨勢. 不同流域魚類δ15N、δ13C 形成的矩陣與浮游動物、浮游植物、水生植物δ15N、δ13C 形成的矩陣重疊比例呈現潮白河流域＜永定河流域山區河道、永定河流域平原河道＜北運河流域的特征，這反映了北運河流域浮游動物、浮游植物、水生植物的冗余程度較高.

c) 同一種魚類在不同流域攝食關系上表現出顯著差異性，肉食性魚類等高營養級水生生物在不同流域均以攝食魚類為主，攝食比例為60%～82%，但具體攝食差異較大，無明顯偏好性；雜食性魚類在不同流域對底棲動物、浮游動物、浮游植物、水生植物等攝食偏好上總體體現出一致性，對底棲動物攝食比例總體在50%以上，其中尤其以捕食者及牧食者為主；底棲動物在不同流域其偏好性總體保持一致，但是攝食比例上有一定差異. 在不同流域進行增殖放流、生物操控時應充分考慮其攝食偏好、調控重點對象、冗余的水生生物種群，以投放對應的底棲動物為主，適當配置魚類.