印記基因在孤雌生殖方面的研究進展

彭晟坤，張子敬，張格陽,3，張志浩,3，閔 佳,3，李欣淼,，王香南，施巧婷，祁興山，黃永震，李惠俠，王二耀*

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所/河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南鄭州 450002；2.南京農業大學動物科技學院，江蘇南京 210095；3.河南農業大學動物科技學院，河南鄭州 450002；4.西北農林科技大學動物科技學院，陜西西安 712199；5.泌陽縣夏南?？萍奸_發有限公司，河南駐馬店 463700）

孤雌生殖中涉及到印記基因的表達調控和遺傳機制，目前，印記基因的研究主要集中在DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA（lncRNA）等表觀遺傳學特征上，而在孤雌生殖領域的研究相對較少。由于缺乏父方參與，在印記基因的調控中，需要對父母方特異性地基因組進行表觀遺傳修飾，而孤雌生殖過程中無法通過雄性個體提供的基因組印記來調節基因表達，就會導致不同時期胚胎發育異常或者早期死亡[1]。在胚胎發育過程中，通過表觀遺傳調控，可以使某些印記基因在雌性個體中失活或沉默，從而實現孤雌生殖。在抗病育種方面，孤雌生殖作為一種具有極大潛力的應用方案，目前在畜牧業中應用還較少。本文介紹了孤雌激活的方式，孤雌胚胎獲取方式和印記基因在孤雌生殖中的應用，以期為未來孤雌生殖的相關應用提供思路，從而提高畜牧業的生產力和可持續發展。

1 孤雌生殖技術

1.1 孤雌生殖技術意義

孤雌生殖僅涉及到雌性個體的基因，后代繼承母體的所有基因，利用孤雌生殖的遺傳學機制，可以使攜帶特定基因突變或缺失的卵子發育成具有相應遺傳特征的后代，同時，孤雌生殖技術可通過孤雌激活等方法實現對母體基因的保留，可用于特定動物品種和瀕危動物品種的繁殖和保護，有助于保持物種的基因多樣性。孤雌生殖可以與多種生物技術結合，可以為疾病治療、干細胞多能性、胚胎學研究、基因突變和遺傳病篩查等領域提供新的可能性和解決方案，具有極高的應用價值。

1.2 孤雌生殖技術優勢

通過孤雌生殖技術繁殖的后代具有較高的基因穩定性，利于進行基因改良和基因編輯，同時通過選擇具有優良基因的個體進行孤雌生殖，可以保證部分優良性狀的穩定維持。孤雌生殖可以使雌性個體獨立地繁殖后代，無需等待或依賴雄性個體的參與，利于短時間內快速擴繁，提高了繁殖效率。孤雌生殖只涉及母方的基因組，可以降低疾病傳播的風險，減少病原體傳播的機會，尤其是在疾病高發地區或疫情暴發時期具有重要意義。

1.3 孤雌生殖技術劣勢

孤雌生殖技術的也可能存在一些限制和挑戰：孤雌生殖后代僅繼承母體的所有或者部分基因，這可能會降低后代之間的基因多樣性。此外，哺乳動物孤雌生殖技術的操作相對復雜，成功率相對較低，需要較高的實驗技術和專業的實驗室條件，可能導致孤雌生殖成本較高。

2 孤雌胚胎激活方法

孤雌激活是指人工誘導未受精的卵母細胞繼續生長發育的過程，通過對卵母細胞進行特定的實驗處理可以產生單倍體或雙倍體孤雌胚胎。同時，激活效果還受使用化學物質種類和濃度、處理時間、動物種類和胚齡等影響[2,3]。

2.1 物理激活法

物理激活法包括機械刺激、溫度刺激以及電刺激處理等，其中最常用的是電刺激法處理卵母細胞。電刺激法通過將電脈沖或電流施加到卵母細胞周圍的培養液中來以改變細胞膜的電位，進而引發細胞內的離子流動和信號傳導，最終激活卵母細胞的發育能力。

2.2 化學激活法

化學激活法是利用滲透壓刺激、離子處理、酶刺激、麻醉刺激以及蛋白質合成抑制劑處理等方法來刺激卵母細胞，觸發細胞內的信號傳導路徑，從而激活其發育能力[4]。常用化學激活法可以通過促進細胞內鈣離子濃度升高、抑制成熟促進因子（MPF）、調節細胞周期、改變細胞內環境等方法來激活卵母細胞發育能力，通常促進細胞內鈣離子濃度升高的化學物質有鈣離子載體、離子霉素、氯化鍶（SrCl2）、聚乙二醇（PEG）和鈣離子載體A23187 等[5,6]。

2.3 物理與化學聯合激活

物理與化學聯合激活法是將物理激活法和化學激活法結合起來使用，通常可以增強激活效果，物理激活可以改變細胞膜的通透性，加速化學物質進入細胞，而化學激活可以調節細胞內信號通路，促進或抑制特定基因的表達。如在體外受精技術中，可以先使用電刺激激活卵母細胞，然后再添加化學物質來進一步促進發育。如Kragh 等[7]使用電刺激脈沖激活體外成熟的無透明帶豬卵母細胞，在放線菌酮（CHX）和細胞松弛素B（CB）中培養后，激活效果較好并得到較高的囊胚率。

3 單倍體和雙倍體孤雌胚胎獲取

激活卵母細胞使其進入MII 期后，形成第二極體過程中，卵子通常會排出第二極體，形成單倍體孤雌胚胎。但研究人員可以使用物理和化學方法等去除或禁止第二極體的排出，或者讓第二極體再次融合，就有可能形成雙倍體孤雌胚胎。

3.1 單倍體孤雌胚胎獲取

單倍體孤雌胚胎只有一套染色體，可以用于遺傳學、基因功能與性狀作用機制中的研究。為獲單倍體孤雌胚胎，Leeb 等[8,9]用氯化鍶（SrCl2）激活未受精卵細胞，從活化卵母細胞中培養出胚胎干細胞（ESC），對ESC 進行擴增后可用流式細胞儀分離出二倍體細胞或富集單倍體細胞，最終得到可穩定傳代超過35 次的孤雌單倍體胚胎干細胞系（PG-haESCs）。Zhong 等[10]利用離子霉素和環己亞胺（CHX）處理卵母細胞，使其排出第二極體，產生單倍體細胞，可以將獲得的單倍體細胞進一步培養和衍生出ESC 株系。然而，在該ESC 株系的第4～8 代中，使用Hoechst 33342染色的熒光激活細胞分選（FACS）無法富集到單倍體細胞。盡管如此，他們通過從受精卵細胞中去除雄性前核的方式獲得了孤雌單倍體細胞，通過定期進行熒光激活細胞分選（FACS）來有效地維持單倍體細胞水平，并成功獲得兩種衍生出的PG-haESCs，這些PG-haESCs 可以在標準的人類ESC 培養條件下穩定傳代達到30 次，并且這些細胞在衍生和傳代過程中都保持了基因組的完整性。。張曼玲等[11]采用電激活、9%乙醇、電激活結合Thimerosal、DTT 和電激活結合MG-132 處理獲得單倍體囊胚的總效率分別為7.3%、4.1%、5.0%和1.7%，發現電脈沖處理的激活方法獲得豬單倍體孤雌胚胎的效果較好。

單倍體孤雌胚胎在研究基因功能、基因印記和復雜發育生物學方面具有顯著優勢，但仍存在自發二倍體化、注入單倍體細胞后胚胎發育效率低、Y 染色體缺失、無法建立大型動物單倍體孤雌胚胎干細胞系等缺陷[12]。

3.2 雙倍體孤雌胚胎獲取

二倍體孤雌胚胎獲取過程與單倍體孤雌胚胎獲取過程類似。研究表明，通過控制激活過程，不同化學組合會對激活卵母細胞后的倍性產生影響，Qiu 等[13]使用乙醇、SrCl2、6-DMAP 和CB來激活MII 卵母細胞，發現二倍孤雌胚胎發育率明顯高于單倍體型，而SrCl2與CB 聯合處理4 小時可產生最高的二倍孤雌胚胎發育率。Loi 等[14]發現，CB 和6-DMAP 培養可產生高比例的二倍體孤雌胚胎。此外，有研究發現細胞融合或核內復制可能導致單倍體孤雌胚胎出現自發的二倍體化[8]。

4 印記基因在孤雌生殖中的作用機制

印記基因是一類參與胚胎發育、生長和成熟過程中的表觀遺傳調控的基因，它們在孤雌生殖中起著重要的調控作用。印記基因通過DNA 甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳調控機制來影響參與發育和分化基因的表達，控制胚胎發育并通過各種促進或抑制生長的途徑來發揮作用，可以影響個體生殖細胞的發育和功能，從而對孤雌生殖的成功率產生影響[15-17]。有研究表明印記基因可以影響孤雌生殖后代的性狀，父方印記基因主要加速胚胎的發育，傾向于保證胎兒生長，而母方印記基因主要限制胚胎發育速度，傾向于保證胎兒的順利分娩[18]。另有研究表明，印記基因的異常表達或突變可能與孤雌生殖相關，同時可能導致印記紊亂為特征的一些相關疾病，如Beckwith-Wiedemann 綜合征和Angelman 綜合征等[19]。此外，印記基因的異常表達還可能對個體的生存產生影響，導致胚胎在發育過程中死亡[20]。

5 印記基因在孤雌生殖中的研究

Feil 等[21]通過比較羊孤雌生殖胚胎和正常對照胚胎的印記基因保存情況，發現綿羊的孤雌生殖發育與生長遲緩有關，并且不會超過胎兒早期階段，他們認為這些發育異常很可能是由印記基因引起的，而與小鼠相比，印記基因在反芻動物中相對保守，這和Loi 等[14]的研究結果相一致，綿羊孤雌胚胎同樣在植入后不久死亡，他們認為胎兒致死現象可能發生在妊娠第25～26 天，同時也是胎盤形成的階段。Thurston 等[22]對綿羊孤雌胚胎9 個印記基因的表達進行檢測，發現在囊胚期即胚胎植入之前印記基因的表達模式類似于雙親表達，而在胚胎植入之后，這些印記基因開始表現出單等位基因表達的特征。Kono 等[23]首先證實一部分印記基因是哺乳動物孤雌生殖的障礙，但只要適當地調節印記基因的表達，哺乳動物可以通過孤雌激活產生能夠發育到成年并繁殖后代的個體。他們使用一種具有13kb 缺失的H19基因突變小鼠作為非生長期卵母細胞的供體，通過去除非生長期卵母細胞中的紡錘體和第一極體，將其移植到去精核的生長期卵母細胞中，并使用體外激活卵母細胞的方式獲得了能夠發育成年的雙倍體孤雌小鼠，結果小鼠能夠通過體外受精和移植產生正常的后代，但存在繁育率過低，小鼠生長發育存在缺陷的問題。Wang 等[24]研究了豬孤雌胚胎和正常受精胚胎（Con）的18 個印記基因的表達情況，發現在孤雌胚胎和胎盤中，母源基因過度表達，而父源基因表達顯著減少，同時與X 染色體失活相關的甲差異化基化區域（XIST DMRs）呈現低甲基化，表明缺乏父系基因表達和X 染色體失活（XCI）失敗可能是豬孤雌胚胎發育失敗和生長受阻的潛在原因。Li 等[25]發現單倍體胚胎干細胞中的基因組印記相對較少，印記基因對于胚胎發育潛在的影響也更容易消除。他們使用實驗室培養的小鼠精子或卵子培育出單倍體孤雄胚胎干細胞（AG-haESCs）或單倍體孤雌胚胎干細胞（PG-haESCs），通過基因編輯技術刪除了這些細胞中印記基因的部分ICR 區域，培養出與卵巢體細胞類似的胚胎卵巢體細胞樣細胞（FOSLCs），構建了一種具有兩個父親或兩個母親的新型胚胎，實驗結果顯示，有兩個母親的小鼠能夠存活到成年，并具有生育能力。這一結果表明，印記基因可能在調控孤雌生殖中有重要作用。Wei 等[26]證明通過對小鼠卵母細胞的印記控制區（ICR）進行有針對性的DNA 甲基化重寫，可以在哺乳動物中實現孤雌生殖。他們使用CRISPR-dCas9 通過Dnmt3a 甲基化酶來增加兩個父系基因組印記控制區域H19 和Gtl2 的甲基化，并使用CRISPR-dCpf1 通過Tet1 去甲基化酶實現母系基因組印記控制區域Igf2r、Snrpn、Kcnq1ot1、Nespas 和Peg10 的去甲基化，將這些基因編輯后的卵母細胞植入到雌性小鼠的子宮中，最終獲得了可存活足月的后代，成功實現了小鼠單個卵細胞的孤雌生殖。

6 展望

目前，印記基因在孤雌生殖中的研究已經有了顯著成果，但將其應用于畜禽產業的生產實際仍存在一定的距離，印記基因在孤雌生殖中的研究還有很大的應用潛力，未來的研究應進一步探索更多的印記基因與孤雌生殖相關的基因，深入研究印記基因與孤雌生殖的分子機制，并開發相關孤雌生殖模型和在豬、牛、羊等畜禽中應用的方法。在育種方面，需通過表型選擇和分子標記輔助選擇，篩選出具有優良性狀的雌性個體，結合孤雌生殖技術有望加速育種進程并提高品種質量。隨著基因測序技術的不斷發展，高通量測序等手段結合孤雌生殖也有望加快抗病性基因資源的利用。在抗病品種選育方面，結合基因編輯和分子標記等技術，孤雌生殖在特定領域的應用也有巨大潛力。相信隨著孤雌生殖技術不斷取得突破，它將在畜牧業和生物工程領域發揮更大作用，并為畜禽抗病育種提供新的途徑。