甘露糖結合凝集素（MBL）基因遺傳多態(tài)性及與奶牛乳腺炎抗病相關性研究

肖龍菲，王相國

（北京農學院動物科學技術學院，北京 102206）

乳腺炎是乳腺的一種炎癥性疾病，是奶牛的主要疾病之一，它通常是由乳房內細菌感染和化學、熱或機械損傷引起，金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性微生物）和大腸桿菌（革蘭氏陰性微生物）是主要的乳腺炎病原體，其次是酵母菌和真菌。乳腺炎的發(fā)生不僅導致牛奶質量和數量的下降，還可引起泌乳持續(xù)性降低和奶牛過早淘汰，嚴重制約畜牧業(yè)的發(fā)展，造成巨大經濟損失。一直以來主要依靠免疫接種或藥物治療等方法防治乳腺炎，但這沒有從根本上消滅和控制疾病的發(fā)生和流行，且易引發(fā)耐藥菌株和抗生素殘留等公共衛(wèi)生問題。先天免疫系統(tǒng)被認為是保護宿主免受生物體入侵的第一道防線[1]。其中牛補體系統(tǒng)在乳腺的防御機制中發(fā)揮著重要作用，有助于溶解入侵的病原體并調節(jié)炎癥。乳頭浸泡、干奶療法和疫苗接種可用于控制牛乳腺炎，但仍存在一定困難。研究證實，家畜對許多感染性疾病的抗性是由遺傳調控的[2]。從長遠來看，采用遺傳學方法從遺傳本質上提高牛對病原的抗性，開展抗病育種具有治本的功效。因此應用現代分子生物學技術分析抗性和易感群體中候選基因的標記等位基因頻率差異，結合遺傳育種技術，從根本上提高家畜的抗病性與健康水平已成為當今家畜抗病育種研究的熱點。

1 甘露糖結合凝集素與凝集素途徑

補體系統(tǒng)是體液免疫的效應機制，包括30多種可溶性和膜結合蛋白，是動物先天免疫的重要組成部分[3]。補體系統(tǒng)中的許多蛋白質是由絲氨酸蛋白酶作為循環(huán)中的酶原，隨著時間的推移，一旦補體系統(tǒng)被激活，就會發(fā)生一系列涉及蛋白水解和組裝的反應，導致第三個補體成分C3裂解，從而誘導補體的活化。目前發(fā)現補體的激活主要有3 種途徑：①經典途徑；②替代途徑；③凝集素途徑。凝集素途徑由甘露糖結合凝集素（Mannose-binding lectin,MBL）激活，其一般是在與抗原抗體發(fā)生特異反應之前，凝集素與細菌細胞表面的甘露糖相互作用，激活機體的免疫反應而發(fā)揮作用[4]。MBL 是一種鈣依賴性膠原C 型凝集素，參與對各種微生物病原體的先天免疫反應。血漿MBL 與其他膠原凝集素相同，由多個三聚體組成，每個三聚體包含4 個不同的結構域：一個富含半胱氨酸的N 端結構域、一個膠原蛋白樣結構域、一個頸部區(qū)域和一個C 端碳水化合物識別結構域[5]。它們通過二硫鍵和膠原蛋白樣結構域的三螺旋締合朝向N 末端結合在一起。MBL 的識別結構域通過與細胞表面上的甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖殘基結合，并隨后與3 種稱為甘露糖結合相關蛋白酶的絲氨酸蛋白酶（MBL associated serine protease，MASP）形成復合物。MASP2 位于16 號染色體上，包含11 個外顯子，是裂解C4 和C2 以組裝C3 轉化酶（C4b2a）的關鍵蛋白酶。MASP2 與經典補體途徑轉化酶共同作用，進而激活補體級聯(lián)[6]，從而誘導吞噬和炎癥反應[7]，發(fā)揮調理作用和中和作用，實現抗菌功能。而MASP-1 和MASP-3 似乎參與了凝集素和旁路途徑的激活。

MASP2 基因在先天免疫中發(fā)揮重要作用，并產生對乳腺感染的抵抗力。MASP2 中的多態(tài)性與奶牛較低的牛奶SCC 和乳腺炎抵抗力具有顯著相關性。此外，MBL 利用巨噬細胞上的C1q 受體調理細菌，而不涉及補體，調節(jié)吞噬細胞釋放的炎癥細胞因子，并抑制病毒感染性。

大多數哺乳動物物種中都有2 種類型的MBL，即MBL-A 和MBL-C，分別由MBL1 和MBL2 基因編碼。MBL1 和MBL2 突變已被證明會改變動物對各種感染的易感性[5]。豬和牛中的MBL1 可被視為乳腺炎抗性和補體活性的功能和位置候選基因[8]。有研究表明MBL1 基因可能有助于提高針對細菌感染的抵抗力，并且可以作為產奶性狀的分子標記來控制乳腺炎[9]。近年來，一種通過分子標記選擇性育種提高宿主對乳腺炎遺傳抵抗力的方法已被廣泛接受。對疾病的抵抗力通常受宿主遺傳特性影響，因此識別所涉及的靶基因，并通過遺傳標記輔助來增加所需基因的頻率，可有效控制病原體的感染傳播。

2 MBL 基因多態(tài)性與奶牛乳腺炎的關系

2.1 單核苷酸多態(tài)性選擇技術

近年來，隨著遺傳學、分子生物學技術和統(tǒng)計分析方法的不斷進步，動物學家們提出了一種新的育種策略，即動物分子育種。傳統(tǒng)的育種技術主要依靠對表型性狀的遺傳參數估計和育種值評估，以選擇出優(yōu)秀的種畜。而在奶牛分子育種方面，研究內容主要包括以下3 個方面：一是數量性狀基因座育種，即通過定位數量性狀位點（Quantitative trait locus，QTL）中的主效基因進行品種改良，或是與其緊密關聯(lián)的DNA 標記來進行標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）；二是轉基因育種，該方法是通過基因轉移技術將外源性基因導入奶牛基因組中，以改良奶牛的重要生產性狀或非常規(guī)性育種性狀；三是單核苷酸多態(tài)性選擇技術（Single-nucleotide polymorphism，SNP），這是利用與性狀緊密相關的SNP 位點進行選擇。通過這些方法，研究人員逐漸從操縱數量性狀的表型過渡到操縱數量性狀的基因型，從依賴表型選擇轉變?yōu)镸AS，最終實現目標的分子育種。

目前，關于調節(jié)乳腺先天免疫基因中SNP 的檢測，已在乳腺炎的防控中得到廣泛關注[9-13]。已有多種免疫和炎癥相關基因及其多態(tài)性研究已被發(fā)現與奶牛乳腺炎的易感性/ 耐藥性密切相關[14]。研究顯示，在中國荷斯坦奶牛MBL2 外顯子1 中發(fā)現了4 個新的SNP，分別位于牛MBL-C 的膠原蛋白樣結構域的富含半胱氨酸結構域和Gly-X-Y 重復結構域的N 末端，可能通過影響蛋白質功能的編碼區(qū)的非同義核苷酸多態(tài)性引發(fā)疾病[15]。該假設得到以下論證的支持：首先，哺乳動物中MBL-C 的基本結構是3 個相同單體的三聚體。N 末端的一個富含半胱氨酸的小結構域在3 個單體之間形成二硫鍵，從而穩(wěn)定三聚體。這些半胱氨酰殘基對于高階寡聚體的形成和穩(wěn)定中發(fā)揮關鍵作用。其次，MBL-C 蛋白缺陷主要是由氨基酸取代引起，即MBL2 外顯子1 中精氨酸被谷氨酰胺取代，導致二硫鍵排列異常，引發(fā)配體結合活性和補體激活降低[16]。最后，與N 末端結構域相鄰的是一個大的膠原蛋白樣結構域，該區(qū)域由大量Gly-X-Y 重復序列組成，形成卷曲螺旋，為三級結構提供穩(wěn)定性，同時與凝集素補體途徑的激活和調理免疫有關。膠原蛋白樣結構域的N 末端與調控細胞吞噬作用有關，包括與C1q受體相互作用的保守GEKGEP 基序。同時，在C末端內有幾個保守的氨基酸殘基，這些殘基形成的MASP 結合基序[17]和MBL 三聚體的結合[16]，因此膠原結構域中氨基酸的各種SNP 可能會導致MBL2 功能異常。

甘露糖結合凝集素是屬于集合素蛋白家族的關鍵參與者，它與多種微生物結合并調節(jié)先天免疫凝集素補體途徑[18]，有研究表明MBL 有助于清除體內凋亡細胞[6]。牛MBL1 已被映射到BTA28。在這個區(qū)域，它包含影響體細胞評分（Somatic cell score，SCS）的數量性狀基因座。此外，其他研究也報道了MBL 中的SNP 與牛奶SCS 的顯著關聯(lián)[19]。

2.2 突變位點基因型鑒定

在研究MBL1 基因位點片段時，可以通過以長片段PCR 產物為模板進行短片段的擴增即巢式PCR 技術進行檢測。巢式PCR 也稱套式PCR，是指利用兩套PCR 引物對進行兩輪PCR 擴增反應。巢式PCR 技術，克服了單次擴增“平臺期效應”的限制，使擴增倍數提高，從而極大的提高了PCR 的敏感性；由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應連續(xù)放大進行的可能性，保證了反應的特異性，從而確保整個反應的準確性及可行性。創(chuàng)造酶切位點技術（CRS-PCR）是根據引物堿基錯配技術設計的檢測單堿基突變的簡單易行的方法，其原理是：根據單堿基突變位點的堿基替代情況設計PCR 引物，其中一條引物包含錯配堿基，使得引物3'端和單堿基突變的一種突變型在PCR 擴增后形成一個酶切位點，其PCR 產物可用類似PCR-RFLP 方法進行分析。若無天然酶切位點，則可利用CRS-PCR 提高SNP 檢測的效率，降低試驗成本，是一種良好的單堿基突變位點基因型鑒定方法。

2.3 MBL1 與牛奶SCS 的相關性分析

奶牛MBL1 基因SNP 與多種乳成分性狀密切相關。研究發(fā)現，牛奶中低SCS 的GG 基因型有利于抵抗乳腺炎的發(fā)生，而高SCS 的AA 基因型則導致乳腺炎易感。增加MBL1 p.24Val 的頻率可反映奶牛乳腺炎的抵抗能力，因此研究MBL1 多態(tài)性似乎是改善奶牛乳腺炎抵抗性狀的重要的間接標記[20]。

有研究發(fā)現，MBL1 基因中的SNP g.2651G＞A 與乳汁SCS 有強相關性，表明其可能在乳腺炎抵抗中發(fā)揮作用[21]。g.2651G＞A 位點的AA 基因型個體與SCS 有顯著相關性，說明g.2651G＞A 位點當DNA 兩條鏈上的G 都突變?yōu)锳的時候，血清MBL-A 水平過低可造成機體調理功能缺陷而易患多種感染性疾病，也可能是MBL1 突變體介導體內某些細胞攝取某些胞內微生物如金黃色葡萄球菌，從而使機體易患此類感染，奶牛的乳腺炎抗性顯著減弱。因而在乳腺炎抗性牛群選育計劃中應有意識地增加g.2651G＞A位點的G 等位基因頻率[22]。在分析的中國荷斯坦牛群體中，3 個SNP 與產奶性狀（脂肪含量、蛋白質含量和305d 產奶量）之間未觀察到顯著相關性。然而，有趣的是，三個SNP 的組合基因型與產奶性狀之間發(fā)現了顯著差異，表明一種SNP的基因型效應可能受到其他SNP 的影響并且這種效應是多個SNP 相互作用的反映[21]。Liu 等[23]研究發(fā)現，MBL1 基因與中國荷斯坦、魯西黃、渤海黑的牛奶SCS 呈正相關，可能在宿主對乳腺炎的反應中發(fā)揮關鍵作用，并且g.2651G＞A 和g.-1330G＞A 可用于奶牛乳腺炎抗性育種。除此之外，Liu 等[23]認為與SNP 相比，單倍型組合的分析可能對性狀產生更大的影響，標記輔助選擇比單個SNP 的研究更有價值。在荷斯坦奶牛中的單倍型組合中，應選擇H8H22、H5H1、H16H22、H15H1 和H5H1 作為單倍型組合的標記，以分別獲得更高的產奶量、脂肪率、蛋白質率以及乳腺炎抗性和CH50 值。此外，g.2651G＞A SNP 與血清MBL-A 水平呈顯著正相關，表明高MBL 血清水平和低MBL 血清水平之間的比率取決于MBL編碼變體[24]。因此，血清溶血活性可以被認為是抗病性的遺傳標記和可以選擇用于近交計劃的性狀。此外，-1330 G＞A 和g.2651 G＞A 同樣與CH50 呈顯著正相關，證實MBL1 可被視為補充CH50 活性的功能和位置候選基因。抗菌實驗進一步證實，與來自易感奶牛的血清相比，抗病奶牛血清對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抗菌活性顯著升高[24]，該發(fā)現為H15H1 基因型對主要牛乳腺炎病原體感染的保護作用以及H16H8 基因型對此類感染的誘發(fā)作用提供了生物學意義。

有研究表明，荷斯坦牛、三河牛和西門塔爾牛MBL 外顯子存在3 種不同的基因型，即AA（(217 bp）型、AG（217、194 和23bp）型和GG（194 和23bp）型[24]。c.2534G ＞A SNP 可能對蛋白質功能產生負面影響，因為編碼區(qū)的突變可能會在很大程度上改變蛋白質結構，或通過破壞殘基間相互作用來破壞活性位點部分的穩(wěn)定性。基因型與臨床型乳腺炎發(fā)病率的關聯(lián)顯示，AA 基因型更易患乳腺炎，其次是AG，而GG 基因型則不易患臨床型乳腺炎。

細菌感染是引起奶牛乳腺炎的最主要因素，因此對奶牛MBL2 基于SNP 分析可能有助于發(fā)現它們與乳腺炎抵抗力的關聯(lián)。Zhao 等[13]研究發(fā)現，g.1164 G＞A-GG 和g.1197 C＞A-CC 基因型奶牛的SCS 顯著降低，表明這些基因型可能與群體乳腺炎抵抗力有關。因此，可選擇GG、CC 基因型牛進行選育。突變位點（g.1198 G＞A 和g.1207 T＞C）的任何標記基因型與產奶性狀或SCS 之間均未觀察到顯著相關性。4 個SNP（g.1164 G＞A、g.1197 C＞A、g.1198 G＞A 和g.1207 T＞C）的組合基因型與產奶性狀（蛋白質率）密切相關。

Wang 等[8]研究表明，中國荷斯坦奶牛MBL2基因在誘導抗原特異性免疫之前激活免疫反應，低表達MBL2 可使奶牛乳腺易感金黃色葡萄球菌。MBL2 基因外顯子1 存在多態(tài)性，單倍型組合H4H5 可用作乳腺炎抗病性單倍型組合的分子標記。Wang 等[8]認為MBL-A 和MBL-C 在牛體內具有不同的糖結合特異性。動物血清中總補體溶血活性的高低與機體的抗感染免疫能力相關，通過牛奶中的溶血活性來評估乳腺的局部免疫力比血清的溶血能力更合適。然而，牛奶的溶血活性較弱，有時會發(fā)現其溶血活性接近檢測下限，因為牛奶中存在的許多抑制劑掩蓋了其低溶血活性，因此使用血清的溶血活性作為代表值。人類MBL2 基因外顯子1 在膠原蛋白樣結構域的點突變被發(fā)現與MBL-C 血漿濃度相關，但奶牛突變位點的任何標記基因型與溶血補體活性CH50 和ACH50 之間均未觀察到顯著相關性。

3 展望

識別遺傳抗性動物的適當方法是研究宿主遺傳學與乳腺炎易感性和抗性的關聯(lián)，因此，遺傳標記選擇被確定為篩選遺傳性乳腺炎抗性牛的最佳方法。免疫和炎癥相關基因中突出的多態(tài)性可以被視為牛乳腺炎控制研究中的潛在生物標志物。現階段對牛主要抗病候選基因的研究取得了一定的進展，但仍然存在具體遺傳機制不明確，各種疾病的分子標記知之甚少的問題[25]。在育種時，通過傳統(tǒng)的表型選擇和分子標記輔助選擇聯(lián)合使用，兩者互補，使其在抗病育種上產生最大的效益同時提高動物的抗病能力。

甘露糖結合凝集素是一類可溶性調理素，能夠識別多種病原體，并在先天免疫反應中發(fā)揮重要作用。此外，MBL 通過其選擇經典轉化酶的能力，也能夠激活補體。因此，結合遺傳學和分子生物學的方法，進一步明確MBL 的SNP 對奶牛乳腺炎的抗病作用，在提高奶牛育種及生產經濟效益等方面都具有重要意義。由于奶牛乳腺炎發(fā)病機制復雜，且致病因素多樣化，針對MBL 與乳腺炎發(fā)病關系的研究，目前采用補充外源性MBL 維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，已成為一種新的研究策略。