牛結(jié)節(jié)性皮膚病的診斷防控研究

胡小慧，鄧瑞雪，潘玉平，賈懷杰，安芳蘭，劉學(xué)榮

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）在臨床上引起牛結(jié)節(jié)性皮膚病（Lumpy skin disease，LSD），該病主要侵害牛科動(dòng)物，以消瘦、皮膚水腫、淋巴結(jié)腫大、皮膚形成結(jié)節(jié)或潰瘍、發(fā)熱等癥狀為主[1]。LSD 潛伏期為28d，發(fā)病率2%～45%，感染牛死亡率可達(dá)20%[2]。健康牛群皮膚黏膜若有破損，在直接接觸病牛破潰的皮膚后感染，LSD 也可通過(guò)媒介如被污染的飼養(yǎng)場(chǎng)所、節(jié)肢動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)，甚至飼養(yǎng)人員等進(jìn)行機(jī)械傳播[3]。目前研究顯示LSDV 不感染人，但除牛科動(dòng)物外，研究人員在長(zhǎng)頸鹿、大羚羊等野生反芻動(dòng)物體內(nèi)也檢出了LSDV 抗體，但并未進(jìn)一步確診它們是否感染[4]。發(fā)病動(dòng)物出現(xiàn)的皮膚破損、母畜流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降等情況會(huì)給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)重大損失，已有研究表明，感染LSD 后造成的經(jīng)濟(jì)損失奶牛約為886.34 美元/頭，而肉牛則更多，為1066.61 美元/ 頭[5]。近年來(lái)，除LSD 的原始暴發(fā)地非洲大陸之外，LSD 在歐洲和亞洲也呈流行趨勢(shì)，發(fā)病具有明顯的季節(jié)性。2019 年8 月，第一例LSD 在我國(guó)新疆伊犁哈薩克自治州確診，此后疫情迅速蔓延至國(guó)內(nèi)其他多個(gè)省份。LSD 是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health，OIE）法定報(bào)告的動(dòng)物疫病之一，也是我國(guó) 《一、二、三類(lèi)動(dòng)物疫病病種名錄》 中的二類(lèi)傳染病，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)特效藥物進(jìn)行治療，因此快速準(zhǔn)確的診斷方法和疫苗免疫是防控LSD 的關(guān)鍵，本文對(duì)現(xiàn)有LSD 應(yīng)用較為廣泛的診斷方法及防控措施的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，為L(zhǎng)SD 疫情的防控提供理論參考。

1 臨床綜合診斷

2019 年8 月我國(guó)首例LSD 病例在新疆確診后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部工作組在當(dāng)?shù)亻_(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷和病理解剖等工作。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)和問(wèn)卷調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2019 年6 月至8 月，中哈邊境牧民發(fā)現(xiàn)部分牛體型消瘦、皮膚出現(xiàn)疙瘩等類(lèi)似LSD的癥狀。現(xiàn)場(chǎng)檢查疑似病例，除LSD 特征癥狀外，病牛出現(xiàn)口鼻潰瘍、食欲減退、不善活動(dòng)等現(xiàn)象。剖檢發(fā)現(xiàn)病牛內(nèi)臟（心肝脾肺腎小腸等）及淋巴結(jié)普遍腫大、出血及膠凍樣浸潤(rùn)[6]。臨床綜合診斷可初步確診為L(zhǎng)SD 疑似病例，王圖雅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)熒光PCR 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法檢測(cè)1 例表現(xiàn)臨床癥狀的牛，但2 種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，因此不能將臨床癥狀作為撲殺的唯一依據(jù)，應(yīng)同時(shí)綜合考慮其他檢測(cè)結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病毒分離鑒定

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒分離鑒定可以采用細(xì)胞株或雞胚進(jìn)行，OIE 推薦使用羔羊睪丸細(xì)胞（lamb testis，LT）或羔羊腎細(xì)胞（lamb kidney，LK）進(jìn)行病毒分離。除此之外，目前報(bào)道的能夠增殖LSDV 的細(xì)胞主要有牛腎細(xì)胞（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）、非洲綠猴腎細(xì)胞（African green monkey kidney，Vero）、原代綿羊睪丸細(xì)胞（Primary sheep testis cells，Primary ST）、綿羊睪丸細(xì)胞（Ovine testis cells，OA3.Ts）、綿羊胚胎皮膚細(xì)胞（Embryonic Skin of Sheep，Esh-l）等[8]。張敏敏等[9]采集了新疆伊犁地區(qū)發(fā)病牛的病變皮膚組織，通過(guò)組織研磨、PBS 洗滌、離心沉淀等操作后，取上清液接種LT細(xì)胞，對(duì)典型病變細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，透射電鏡觀察到大于200nm 的磚型粒子，與Moss 等[10]鑒定的LSDV 粒子大小（約290nm×240nm）基本一致。電鏡觀察病毒粒子大小只能初步判斷為羊痘病毒屬病毒，若想要確診還需結(jié)合臨床癥狀和其他檢測(cè)方法進(jìn)行。使用雞胚接種病毒時(shí)，可采集絨毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane，CAM）上的痘樣病變組織進(jìn)行PCR 檢測(cè)[11]。

通過(guò)動(dòng)物接種試驗(yàn)也可確定臨床疫病是否由LSDV 引起，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，一般為4～7d，將病牛的新鮮結(jié)節(jié)制成乳劑[12,13]，皮下或皮內(nèi)接種易感牛，待接種部位出現(xiàn)堅(jiān)硬的疼痛性腫脹后，采集腫塊和下層肌肉組織、脾臟、血液或唾液等進(jìn)行病毒分離或核酸檢測(cè)試驗(yàn)，若結(jié)果為陽(yáng)性即可確診。

生物安全是進(jìn)行LSDV 病原分離試驗(yàn)和動(dòng)物接種試驗(yàn)的前提，病毒分離必須在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（Animal Biosafety Level -3，ABSL-3）中進(jìn)行，因此限制了該方法在臨床中的應(yīng)用推廣。目前確診大多采用免疫學(xué)或分子生物學(xué)診斷方法對(duì)抗體或病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)

常規(guī)血清學(xué)方法主要用于檢測(cè)患病動(dòng)物體內(nèi)的特異性抗體和感染性抗原，因此可用于檢測(cè)LSD 流行地區(qū)的樣品。

2.2.1 病毒中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)（Virus neutralization test，VNT）是OIE 推薦的LSDV 檢測(cè)方法之一。Samojlovic[14]開(kāi)發(fā)的VNT 方法包含疫苗免疫后的血清抗體和MDBK 細(xì)胞培養(yǎng)的LSDV 毒株兩部分，使用該方法和ELISA 方法同時(shí)檢測(cè)200 份臨床采集的奶牛血清和125 份已知的LSDV 陰性牛血清，結(jié)果顯示：臨床血清中VNT 法抗體陽(yáng)性率為34%（68/200），ELISA 法抗體陽(yáng)性率為30%（60/200）；已知血清中VNT 法抗體陽(yáng)性率為0%（0/125），ELISA 法抗體陽(yáng)性率為0.8%（1/125），說(shuō)明該方法可用于臨床血清樣品LSDV抗體檢測(cè)。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Carn 等[15]建立的捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，包被綿羊痘KS-1 株P(guān)32 重組抗原與LSDV 抗體反應(yīng)后能夠檢測(cè)到患病動(dòng)物活組織中以及組織培養(yǎng)上清液中的山羊痘病毒（Capripoxvirus，CaPV），活組織抗原最早測(cè)得時(shí)間為感染后7d。Bowden 等[16]以羊痘病毒屬的核心蛋白ORF095 和ORF103 為重組抗原構(gòu)建的間接ELISA 方法能夠檢測(cè)到CaPV 感染后的血清抗體，人工感染條件下該方法敏感性和特異性分別為95%、97%，但疫苗免疫后敏感性?xún)H為30%。Babiuk 等[17]共檢測(cè)231 份山羊、綿羊和牛血清中的CaPV 抗體，發(fā)現(xiàn)間接ELISA 方法特異性和敏感性分別為95%和96%。Heine 等[18]基于痘苗病毒H3L 基因的同源基因P32 構(gòu)建的間接ELISA 方法雖然有較高的特異性，但全長(zhǎng)P32 基因的表達(dá)量較低，限制了該方法的使用。

2.2.3 免疫過(guò)氧化物酶單層分析法

Haegeman 等[19]建立的免疫過(guò)氧化物酶單層分析法（Immunoperoxidase monolayer analysis，IPMA）可用于檢測(cè)牛血清中的LSDV 抗體。對(duì)LSDV 實(shí)驗(yàn)感染和自然感染的144 份牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，均檢出陽(yáng)性抗體，檢測(cè)結(jié)果與病毒中和試驗(yàn)和商品化ELISA 試劑盒相一致，并且與BTV 和FMDV 感染的樣品不發(fā)生交叉反應(yīng)，可與稀釋度1∶50 的牛血清發(fā)生反應(yīng)，特異性和敏感性良好。

通過(guò)比較檢測(cè)LSDV 的各種免疫學(xué)方法，主要不足之處如下：①VNT 法需要保證生物安全，對(duì)低抗體水平的動(dòng)物檢出率低，且該方法需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)操作人員和細(xì)胞要求較高。②各種ELISA 法雖然能夠同時(shí)檢出GTPV、SPPV 和LSDV 三種抗體，但無(wú)法進(jìn)行具體細(xì)化鑒別。③蛋白質(zhì)免疫印跡法操作復(fù)雜，不適用于田間推廣應(yīng)用。④間接免疫熒光抗體試驗(yàn)由于操作中對(duì)背景和細(xì)胞質(zhì)的非特異性染色，會(huì)使判定結(jié)果受到主觀性的影響。⑤瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)敏感度較低，與副痘病毒存在交叉反應(yīng)。

2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)診斷方法在調(diào)查群體感染情況時(shí)有一定的優(yōu)勢(shì)，但不能快速準(zhǔn)確地確定個(gè)體是否感染。細(xì)胞免疫是機(jī)體應(yīng)對(duì)痘病毒屬病毒感染的主要形式，在感染或疫苗接種初期等抗體水平較低時(shí)抗體檢測(cè)方法還有一定的局限性，鑒于傳統(tǒng)的血清學(xué)試驗(yàn)敏感性較低、操作繁瑣、耗費(fèi)巨大、不能鑒別診斷CaPV 等各種限制，研究人員開(kāi)發(fā)了具有更高特異性和敏感性的核酸檢測(cè)技術(shù)。常用的基于分子生物學(xué)診斷的核酸檢測(cè)技術(shù)主要有以下3 種。

2.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是OIE 推薦的檢測(cè)LSDV 的方法之一，一般發(fā)病后7～19d 可檢測(cè)到LSDV 核酸片段，最長(zhǎng)161d[20]。張敏敏等[9]對(duì)病變細(xì)胞液中提取的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)PCR 擴(kuò)增所得的毒株LSDV/China/Xinjiang/2019與NCBI 中LSDV 相應(yīng)片段的相似度為99.98%。羊痘病毒屬病毒基因同源性高，可基于高保守核酸序列設(shè)計(jì)引物，建立CaPV 的通用檢測(cè)方法。如Ireland 等[21]、Kitching 等[22]建立的通用型方法特異型好，與羊口瘡和牛痘病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

除可以檢測(cè)CaPV 的不同病毒外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的優(yōu)勢(shì)主要在于更早更快地檢出拷貝數(shù)更低的核酸，并且可以鑒別診斷LSDV 野毒株和疫苗株，這對(duì)疫情防控有幫助。qPCR 包含染料法和探針?lè)āＴt等[23]建立了基于染料法的qPCR，在檢測(cè)重組質(zhì)粒pMD19T-LSDV 時(shí)其敏感性比普通PCR 高100 倍，最低檢測(cè)濃度為7.11x102copies/μL。與染料法相比探針?lè)ㄐ枰铣商结槪^為昂貴，但特異性高于前者。孔玉方等[24]選取LSDV 的保守基因ORF71，設(shè)計(jì)的探針?lè)╭PCR 檢出限為1.16 copies/μL，而聶福平等[25]、Eirini 等[26]、Das 等[27]基于不同的序列設(shè)計(jì)的探針?lè)ㄗ畹蜋z出限分別為1.48、8 和10copies/μL。

2.3.3 其他方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）可以在60～65℃下擴(kuò)增病毒核酸，關(guān)于它在臨床上的使用有兩種看法。一種認(rèn)為L(zhǎng)AMP 的試驗(yàn)結(jié)果由是否觀察到染料顏色變化來(lái)確定，具有一定的主觀性[28]，另一種認(rèn)為正是目測(cè)的便捷性使得該方法可以在基層推廣使用[29]。重組酶聚合酶擴(kuò)增法（RPA）可在45℃時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行等溫快速擴(kuò)增，已用于臨床檢測(cè)SPPV 和GTPV[30]。高分辨率熔解曲線分析法依據(jù)4 種熔解曲線峰來(lái)鑒別診斷LSDV、GTPV以及SPPV 的野毒株和疫苗株[31]。

3 防控難點(diǎn)與建議

3.1 防控現(xiàn)狀

依據(jù)相關(guān)規(guī)定，我國(guó)對(duì)LSD 疫情實(shí)行快報(bào)制度，相關(guān)單位接到疑似癥狀報(bào)告后，按照“可疑疫情—疑似疫情—確診疫情”的程序，最終由省級(jí)人民政府畜牧獸醫(yī)主管部門(mén)或農(nóng)業(yè)農(nóng)村部按照確診結(jié)果和流行病學(xué)調(diào)查信息認(rèn)定疫情。防控傳染性疾病的三大有效措施為控制傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感動(dòng)物。目前發(fā)生LSD 疫情后采取的主要措施如下：首先，對(duì)疫點(diǎn)內(nèi)所有病牛、病原學(xué)陽(yáng)性牛及其產(chǎn)品進(jìn)行撲殺銷(xiāo)毀并無(wú)害化處理，在疫區(qū)和受威脅區(qū)禁止牛只出入，并禁止未經(jīng)檢疫合格的牛皮張、精液等產(chǎn)品調(diào)出。其次，滅殺飼養(yǎng)場(chǎng)所內(nèi)的蟲(chóng)媒等生物，清除滋生環(huán)境，對(duì)牛只排泄物、被病原污染的飼料和墊料、污水等物品進(jìn)行無(wú)害化處理，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)所、出入人員、車(chē)輛等設(shè)施設(shè)備進(jìn)行消毒。最后可以使用山羊痘疫苗對(duì)疫情所在縣和相鄰縣的全部牛只進(jìn)行緊急免疫接種。由于LSD 主要發(fā)生于吸血蟲(chóng)媒活躍季節(jié)，給疫病的防控和凈化增加了難度，鑒于LSD 疫情已經(jīng)在我國(guó)多個(gè)省份發(fā)生，在繼續(xù)維持邊境防控和出入境檢疫的基礎(chǔ)上，需同時(shí)加強(qiáng)國(guó)內(nèi)動(dòng)物跨省調(diào)運(yùn)監(jiān)管。

3.2 病原方面

由于LSD 潛伏期長(zhǎng)，疫情初期除有明顯臨床癥狀的牛之外，同群動(dòng)物感染后不易被發(fā)現(xiàn)，如若漏診，則存在疫情擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。LSD可以通過(guò)蟲(chóng)媒和非蟲(chóng)媒等多種途徑傳播，使得切斷傳播途徑這一措施難以達(dá)到預(yù)期效果。因此，為提高LSD 防控技術(shù)水平，除常規(guī)的驅(qū)蚊滅蠅措施外，建議完善現(xiàn)有的疫病確診技術(shù)，開(kāi)發(fā)可以早期監(jiān)測(cè)牛群群體水平LSDV 的工具，加快推進(jìn)疫苗和養(yǎng)殖場(chǎng)滅蜱蟲(chóng)藥物的研發(fā)[32]，以此來(lái)提高LSD 防控效率。雖然弱毒活疫苗的免疫保護(hù)效果比滅活疫苗好，但目前對(duì)于LSDV 的致病機(jī)制和疫苗免疫機(jī)制尚不清楚，進(jìn)而導(dǎo)致了疫苗株和野毒株重組病毒的出現(xiàn)，這使得活疫苗免疫在臨床應(yīng)用時(shí)存在隱患。袁歆瑋[33]等提出，應(yīng)加強(qiáng)LSDV 致病機(jī)制和免疫機(jī)制研究，這對(duì)于研發(fā)新的抗病毒疫苗和藥物以及鑒別診斷試劑的靶標(biāo)等工作都有重要意義。

3.3 人員方面

牛結(jié)節(jié)性皮膚病的易感動(dòng)物牛類(lèi)既存在于規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)，也存在于農(nóng)村散養(yǎng)。規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)具有較為完善的養(yǎng)殖模式和生物安全體系，而農(nóng)村散養(yǎng)存在防疫意識(shí)薄弱、專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員欠缺、交易頻繁多樣以及病牛撲殺補(bǔ)償較低等諸多問(wèn)題。鑒于以上情況，一是要提高養(yǎng)殖戶(hù)和基層防疫人員對(duì)LSD 疫情的認(rèn)知，有關(guān)部門(mén)要加大宣傳力度，組織知識(shí)科普和法律法規(guī)培訓(xùn)，提升從業(yè)人員的群防群控意識(shí)和法律意識(shí)，嚴(yán)厲打擊販賣(mài)病死牛等行為[34]，對(duì)病牛要嚴(yán)格實(shí)行無(wú)害化處理措施。二是要加強(qiáng)對(duì)各動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)工作人員的技術(shù)培訓(xùn)，使其能夠快速準(zhǔn)確處置臨床病例，提升工作效率。三是要加強(qiáng)活牛的調(diào)運(yùn)管理，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后進(jìn)行引種或購(gòu)入新牛，定期排查疫情隱患，做好疫情監(jiān)測(cè)工作。四是明確病牛無(wú)害化處理補(bǔ)償標(biāo)準(zhǔn)，為在疫情最早期撲殺動(dòng)物的養(yǎng)殖戶(hù)適當(dāng)提高補(bǔ)償金額，強(qiáng)化疫情報(bào)告制度，讓養(yǎng)殖戶(hù)在發(fā)現(xiàn)疫病后按真實(shí)情況及時(shí)上報(bào)，在一定程度上降低防控難度[35]。

4 小結(jié)

疫情發(fā)展初期，牛對(duì)LSDV 敏感，可采用特征性臨床癥狀進(jìn)行初步診斷，同時(shí)結(jié)合各種PCR技術(shù)檢測(cè)核酸進(jìn)行確診。疫情發(fā)展中期，可采用多種免疫學(xué)方法檢測(cè)LSDV 抗體進(jìn)行診斷。疫情發(fā)展后期，可能存在隱性感染或感染免疫情況，病牛體表皮膚癥狀不明顯，且由于抗體存在，機(jī)體病原含量下降，此時(shí)PCR 技術(shù)有可能無(wú)法擴(kuò)增出LSDV 核酸片段，為避免漏診造成疫情擴(kuò)散等情況，應(yīng)聯(lián)合使用血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，并開(kāi)發(fā)新的診斷技術(shù)。對(duì)于LSD，應(yīng)遵循預(yù)防為主，防治結(jié)合原則，在準(zhǔn)確診斷、防止疫區(qū)動(dòng)物轉(zhuǎn)移的同時(shí)，應(yīng)積極開(kāi)發(fā)殺蜱藥物，切斷傳播途徑，同時(shí)加強(qiáng)易感動(dòng)物疫苗接種，積極預(yù)防，保障人和動(dòng)物健康。