BAPN 誘導小鼠胸主動脈夾層合并急性肺損傷模型的建立

買志妍江麗青朱翰朝張溧昀王云?段維勛?

（1. 寧夏醫科大學臨床醫學院，銀川 750004；2. 空軍軍醫大學西京醫院心血管外科，西安 710032；3. 寧夏醫科大學總醫院心臟大血管外科，銀川 750004）

胸主動脈夾層（thoracic aortic dissection，TAD）是心臟大血管外科最兇險的主動脈疾病之一[1]。TAD 是一種由于各種原因致血管壁內膜破裂，腔內的血液順著內膜破裂口進入中膜形成夾層血腫，隨著血液不斷流入中膜并沿主動脈長軸擴展，使主動脈內膜和中膜分開形成真、假兩腔的主動脈疾病[2-4]，其發病率和死亡率在主動脈疾病中都位居前列。 據最近研究表明，每100 萬人中約有5 ～10例發生TAD 且發病率呈逐年上升趨勢[5-7]。 因其特有的發病特點，TAD 形成后會伴隨一種或多種嚴重的并發癥。 據有關文獻報道約34.9% ～53.8%的TAD 患者合并急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[8]，導致患者圍術期的生存質量明顯降低。

近幾年，學者基于TAD 動物模型[9-11]，在TAD相關發病機制研究方面取得了一些突破性的進展[12]，但有關TAD 合并ALI 發病機制或有效藥物作用靶點等研究“望而卻步”。 目前已有多種較為成熟的TAD 造模方式，最常用的造模方法之一是β-氨基丙腈（ β-aminopropionitrile monofumarate，BAPN）藥物誘導法[13-14]。 然而，關于構建一種合理的TAD 合并ALI 的動物模型仍是該領域研究的“軟肋”。 因此，本研究的目的是采用BAPN 誘導小鼠形成TAD 的造模方式，觀察小鼠ALI 的相關指標驗證TAD 合并ALI 動物模型是否構建成功，并以期為研究TAD 合并ALI 發病機制等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

45 只SPF 級雄性C57BL／6J 小鼠，3 周齡，體重約10 g，購自空軍軍醫大學動物實驗中心【SCXK（陜）2019-001】。 所有實驗動物均在空軍軍醫大學實驗動物中心飼養【SYXK（陜）2019-001】，飼料由寧夏醫科大學實驗動物中心提供的標準普通飼料（20-SM230704019）。 飼喂環境： 室內溫度為20 ～24 ℃， 相對濕度45% ～55%，光照／黑暗周期設定為12 h，均予以高壓蒸汽對小鼠飼料和墊料進行滅菌處理。 嚴格遵循“減少、替代、優化”的“3R”原則對小鼠進行飼養。 本實驗已通過空軍軍醫大學實驗動物福利倫理委員會審查批準（20220440）。

1.1.2 主要試劑與儀器

β-氨基丙腈（ Sigma Aldrich 公司， 貨號：ly1002184）；BCA 蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher 公司， 批號： VK314219 ）； IL-6 （ E-ELM2453c）、 IL-1β （E-EL-M0037c）、 TNF-α （E-ELM3063）檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；蘇木素-伊紅試劑盒購自北京索來寶有限公司；4%多聚甲醛、無水乙醇購自天津天大化工廠；二甲苯購自廣東西隴科學公司。

Vevo3100 小動物超聲儀（Visual-Sonics 公司，加拿大）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus 公司，日本）；電子分析天平（瑞士Mettler 公司）；脫色搖床為（Kylin-Bell 有限公司產品）；離心機（無錫瑞江分析儀器有限公司）；高溫高壓滅菌鍋（日本Sanyo 公司）；恒溫水浴鍋（上海博訊醫療生物儀器股份有限公司）；普通冰箱（海爾集團）；組織自動脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機均購自武漢俊杰電子公司；電熱恒溫鼓風干燥箱購自天津市萊玻特瑞儀器設備公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型構建

使用隨機數據表法將45 只3 周齡[15-16]雄性C57BL／6J 小鼠分成兩組。 BAPN 組30 只：喂食正常飼料，BAPN 粉末溶于無菌雙蒸水配制成濃度為1 g／（kg·d） 溶液，并使用棕色飲水瓶（防止BAPN見光分解）飲水給藥4 周；CON 組15 只：給予正常飲食水。 使用小動物超聲儀，分別在小鼠飲水第2、3、4 周測量胸主動脈最大直徑（TAD 診斷標準為：局部主動脈擴張到正常直徑的50%以上）[17-18]，并結合主動脈組織HE 染色結果，確定小鼠TAD 是否形成[19]，再將BAPN 組分為Non-TAD 組和TAD 組，進一步檢測3 組小鼠肺組織HE 病理染色、肺組織W／D 及BALF 中總蛋白和炎癥指標表達水平驗證小鼠TAD 合并ALI 模型[20]。

1.2.2 小鼠一般情況及肺組織、主動脈大體觀察

造模期間，觀察小鼠活動狀況，定期記錄小鼠飲水量和體重，直至小鼠因夾層破裂死亡或實驗結束，期間若發現小鼠死亡，立即解剖，探查死亡原因。 實驗結束后，將實驗小鼠麻醉并固定于小動物手術臺，充分暴露胸腔，觀察小鼠左右肺組織顏色、形態、表面有無壞死及滲出等，并留取兩側肺備用；分離主動脈周圍組織，暴露主動脈，用PBS 充分沖洗2 ～3 次，觀察主動脈是否有局部膨大及血管壁破裂，留取主動脈組織備用，并統計TAD 破裂及成瘤率。

1.2.3 小鼠主動脈蘇木素-伊紅（HE）染色病理學觀察

用4%多聚甲醛固定好的主動脈組織依次置于濃度由低到高的乙醇溶液中脫水，二甲苯透明及石蠟包埋，切成5 μm 厚度切片。 再烤片、脫蠟、脫苯，進行蘇木素染色細胞核5 min，返藍，伊紅染色細胞質5 min，沖洗、乙醇脫水、二甲苯2 min 透明后，中性樹脂封片。 制備好的切片置于顯微鏡下觀察。

1.2.4 小鼠肺組織HE 染色病理學觀察

取小鼠左肺組織， HE 染色操作步驟同“1.2.3”。 將制備好的肺組織切片置于顯微鏡下觀察并采集圖像。 肺損傷程度評估采用2011 年于美國胸科學會研討會[20]提出的肺損傷評分表，見表1。

表1 肺損傷評分表Table 1 Lung injury scoring scale

1.2.5 小鼠肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中總蛋白水平檢測

將小鼠適度麻醉并固定于手術臺上，切開小鼠頸部皮膚，充分暴露并分離左右主支氣管，縫合線結扎右側主支氣管。 使用靜脈留置針向肺內注入1 mL 預冷無菌PBS 液，反復灌洗3 次，可回收75%～80%的灌洗液。 收集到的BALF 離心后吸取上清液，按照BCA 試劑盒操作說明測定上清液中總蛋白濃度。

1.2.6 酶聯免疫吸附劑 （ enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測小鼠BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平

收集小鼠肺泡灌洗液中上清液的方法同“1.2.5”。 按照ELISA 試劑盒的實驗說明書逐步操作，在450 nm 波長處測定各孔的OD 值，并分別計算BALF 中IL-1β、IL-6、TNF-α 濃度。

1.2.7 小鼠肺組織濕干重比（dry／wet weight ratio，W／D）測定

取出右肺并清潔表面水漬后，置于電子分析天平上稱重即肺濕重（wet weight，W）。 再將肺組織放于鋁箔紙上，于60 ℃恒溫干燥箱中烘干48 h 至恒重，取出肺組織再次稱重即肺干重（dry weight，D）。計算濕／干重比值（W／D）評估小鼠肺水腫程度。

1.3 統計學分析

所有實驗數據采用SPSS 23.0 統計學軟件進行分析，計量資料先進行正態性及方差齊性檢驗，以平均值± 標準差（±s）表示符合正態性分布，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；若不符合正態性分布，采用秩和檢驗分析。 分類變量采用χ2檢驗分析。 用GraphPad Prism 9.5.0 軟件作圖并分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況

隨著給藥時間的增加，BAPN 組小鼠整體飲水量較CON 組呈現減少的趨勢（圖1A）。 兩組小鼠體重隨日齡增加雖都有增長，但相較于CON 組，BAPN組整體體重的增長趨于緩慢（圖1B）。

圖1 兩組小鼠飲水量和體重的比較Note. A. Daily water intake of mice. B. Changes in body weight of mice. Compared with CON group， ?P ＜0.05， ???P ＜0.001.（The same in the following figures）Figure 1 Comparison of water intake and body weight of mice in two groups

2.2 小鼠胸主動脈夾層成瘤及破裂情況

至實驗結束，CON 組小鼠無主動脈夾層形成或死亡。 BAPN 組，5 只小鼠死亡，其存活小鼠有17 只形成TAD、8 只小鼠未形成，小鼠TAD 形成率為73%、破裂率為17%。 死亡小鼠當即予以解剖，觀察到胸腔大量血凝塊，主動脈壁存在破裂口，判定為夾層破裂致死（圖2）。

2.3 小動物超聲儀測量小鼠主動脈直徑結果

采用小動物超聲儀分別于給藥第2、3、4 周測量CON 組和BAPN 組小鼠主動脈直徑，根據胸主動脈最大直徑是否擴張及主動脈HE 染色結果，將BAPN組分為Non-TAD 組和TAD 組。 如圖3 所示，CON組和Non-TAD 組小鼠主動脈直徑無明顯差異，而與TAD 組相比，形成夾層小鼠的主動脈直徑明顯擴張，差異具有顯著性（P＜0.001）。

圖3 三組小鼠主動脈擴張情況比較Note. A. Ultrasonic representation of aorta vessels of mice in each group. B. Statistical diagram of the maximum aortic diameter of mice in each group. Compared with non-TAD group， ＃＃＃P ＜0.001.（The same in the following figures）Figure 3 Comparison of aortic dilation in three groups of mice

2.4 各組小鼠主動脈病理變化

在光學顯微鏡下觀察3 組小鼠主動脈HE 病理染色，發現CON 組和Non-TAD 組小鼠主動脈壁結構均完整，未見明顯增厚及炎性細胞浸潤。 而TAD組小鼠主動脈中層可見明顯增厚，并可見主動脈壁結構破壞、紊亂（圖4）。

圖4 三組小鼠主動脈HE 染色代表圖Figure 4 HE staining diagram of aortas of mice in three group

2.5 各組小鼠BALF 中總蛋白水平及肺組織W／D比較

分別測量各組小鼠肺組織W／D、BALF 中總蛋白水平。 如圖5 所示，CON 組和Non-TAD 組無顯著性差異；TAD 組小鼠肺組織水腫程度以及BALF 中總蛋白水平明顯高于另外兩組（P＜0.05）。

圖5 三組小鼠BALF 中總蛋白水平及肺組織濕干重比的比較Note. A. Statistical chart of lung tissue wet-dry weight ratio of mice in each group. B. Statistical map of BALF total protein content in each group. Compared with non-TAD group， ＃P ＜0.05.Figure 5 Comparison of total protein level in BALF and the wet-dry weight ratio of lung tissue in three groups of mice

2.6 各組小鼠BALF 中炎癥指標表達水平的比較

TAD 組小鼠BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量均明顯高于CON 組和Non-TAD 組（P＜0.05），而CON組和Non-TAD 組炎癥指標未見明顯差異（圖6）。

圖6 三組小鼠BALF 中炎癥因子表達水平比較Note. A. Statistical diagram of IL-6 content. B. Statistical diagram of IL-1β content. C. Statistical diagram of TNF-α content. Compared with non-TAD group， ＃＃P ＜0.01.Figure 6 Comparison of the expression levels of inflammatory factors in BALF in three groups of mice

2.7 各組小鼠肺組織病理切片結果

CON 組小鼠肺組織未見明顯病理改變；Non-TAD 組小鼠表現為肺組織結構完整，肺間質及肺泡腔內未見明顯滲液，偶見肺泡壁疏松、肺泡腔輕度擴大；與CON 組和Non-TAD 組比較，TAD 組小鼠肺組織可見肺間質明顯水腫增厚（橙色箭頭），伴炎性細胞浸潤（黑色箭頭），肺泡上皮脫落及透明膜形成（藍色箭頭），肺泡腔內也可見炎性細胞浸潤（圖7A）。 根據肺損傷病理評分標準的結果分析，與CON 組和Non-TAD 組相比，TAD 組肺損傷病理評分顯著增高，差異具有顯著性（P＜0.001），見圖7B。

圖7 三組小鼠肺組織病理染色和肺損傷評分Note. A. HE staining diagram of lung tissue of mice in each group. B. Statistical chart of lung tissue injury score of mice in each group.Figure 7 Pathological staining of lung and lung injury score in three groups of mice

3 討論

TAD 是最常見的一種心血管急重癥。 患者通常以劇烈胸痛為首要就診癥狀，若診斷或治療不及時，可引起一系列嚴重的并發癥或夾層破裂等威脅患者生命的不良事件發生。 ALI 是TAD 患者在臨床上最為常見的合并癥之一，臨床研究報道TAD 患者術前合并ALI 是導致術后發生急性呼吸窘迫綜合征等不良反應事件的重要原因[21]。 而有關TAD 合并ALI 發病機制的研究卻甚少。 因此，探究TAD 合并ALI 具體發病機制或有效治療方式是研究人員目前迫切需要攻破的一大難題。 構建合理的TAD 合并ALI 動物模型是研究疾病發病機制、藥物作用分子靶點或評估藥物療效不可或缺的實驗工具。

TAD 動物模型大體可分為兩種，即在體模型和離體模型，在體模型又包括藥物誘導法[22]、開放手術或腔內手術誘導[23]和基因工程建模法[10]等。BAPN 是一種通過抑制賴氨酰氧化酶（lysyloxidase，LOX）活性，催化彈性蛋白和膠原蛋白中的賴氨酸殘基交聯形成鎖鏈素，從而誘導實驗動物形成TAD 的藥物[24-25]。 目前，運用最為廣泛的是BAPN 聯合或者不聯合血管緊張素Ⅱ（angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ）的藥物誘導法[26]。 單純BAPN 誘導動物形成TAD 就有多種造模方法[27-29]。 文章報道選取3 周齡雄性C57BL／6J 小鼠給予BAPN 1 g／（kg·d）飲水給藥4周后TAD 形成率約70% ～90%，且該方法簡便、易行且成本較低。 故本課題組用BAPN 1 g／（kg·d）飲水給藥4 周誘導3 周齡C57BL／6J 小鼠形成TAD的造模方案，期間通過小動物超聲儀測量CON 組和BAPN 組小鼠主動脈最大直徑并結合兩組小鼠主動脈組織HE 染色，將BAPN 組小鼠分為Non-TAD 組和TAD 組，為后續證明小鼠ALI 發生的主因是TAD而不是BAPN 藥物干預而形成提供有力依據。 結果顯示，相較于Non-TAD 組和CON 組小鼠，TAD 組小鼠主動脈最大直徑明顯擴張，且主動脈病理染色示血管中層增厚、內膜呈現較明顯的破壞，且BAPN 治療可一定程度延緩小鼠一般生長狀況，這與既往文獻[13-14，27]報道結果一致，表明本研究中TAD 小鼠模型構建成功。

ALI 是一種因各種原因引起肺部廣泛炎癥性病變的呼吸系統疾病[30]。 若病情加重，可發展為危重的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[31-32]。 隨著人們對ALI 疾病的深入探索，已研發出多種符合人類ALI 病理特點的動物模型，并于2011 年美國胸科學會研討會針對動物實驗性ALI 提出較統一的診斷標準[20]：（1）組織損傷的組織學依據；（2）肺泡-毛細血管屏障的改變；（3）炎癥反應；（4）生理功能障礙的依據。 滿足三個及三個以上主要特征指標，可診斷為ALI 動物模型建立成功。 故本課題組通過小鼠肺組織HE 病理染色提供組織學證據；肺組織W／D 及檢測BALF 中總蛋白水平體現肺泡-毛細血管屏障的改變情況；ELISA 檢測小鼠BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平提供炎癥反應依據。 由實驗數據顯示，CON 組和Non-TAD 組小鼠中，CON 組小鼠肺組織病理染色無明顯異常，Non-TAD 組小鼠肺組織病理染色示偶見肺泡壁輕度增厚、肺泡腔擴大或融合，但未觀察到明顯形態學改變，這與既往研究結果一致[33-35]，兩組小鼠肺損傷評分、肺組織W／D 和BALF 中總蛋白水平、TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平均較低且二者無顯著差異；而TAD 組小鼠肺組織病理染色示明顯損傷，肺損傷評分、肺組織W／D 和BALF 中總蛋白水平、炎癥因子表達水平均顯著升高（P＜0.05）。上述結果表明，BAPN 干預雖輕度影響小鼠肺組織病理改變，但對肺組織水腫和炎癥反應的影響均無明顯作用，而形成TAD 小鼠的肺組織病理損傷程度、肺組織水腫程度和炎癥反應均顯著加重，提示小鼠ALI 的發生與形成TAD 密切相關，并驗證BAPN 誘導小鼠TAD 合并ALI 動物模型構建成功。

綜上所述，本課題組通過BAPN 1 g／（kg·d）飲水給藥4 周的建模方法成功誘導C57BL／6J 小鼠TAD 合并ALI 的動物模型。 有望基于該模型為探究TAD 合并ALI 發病機制或藥物有效分子靶點奠定理論基礎。 但需要注意的是，該項研究所采用的BAPN 飲水給藥的造模方式存在一些不可控的因素，如無法控制每只實驗動物的恒定攝藥量以及BAPN 藥物活性的不穩定性等，同時，由于本實驗涉及的樣本量較小，針對該模型的穩定性尚需進一步驗證。