芩薊涼血合劑對痔病相近動(dòng)物模型的影響

周蒙恩，李鵬，金文琪，王若琳，郭修田

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，上海 200071）

痔是臨床最常見的肛門直腸疾病之一，我國成人肛腸疾病的患病率50.10%，其中98.09%的患者具有痔瘡癥狀[1]。 在美國，痔是第三常見的門診胃腸診斷，患病率范圍從4.4% ～40%，每年造成近400 萬次醫(yī)院就診，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)成本和個(gè)人痛苦[2-4]。 痔最常見的表現(xiàn)是排便時(shí)無痛性直腸出血，伴或不伴肛門組織脫垂[5]。 而對其確切病理生理學(xué)知之甚少，主流理論認(rèn)為痔是由血管的異常擴(kuò)張和扭曲以及支撐結(jié)締組織的肛墊的破壞性變化引起的[6]。 其早期癥狀通常采用非手術(shù)方式治療，當(dāng)非手術(shù)治療無效時(shí)，通常選擇手術(shù)治療[7]，但手術(shù)后出現(xiàn)的排便困難、頑固性疼痛、大出血等并發(fā)癥讓患者心生恐懼[2]。 從消除或減輕癥狀出發(fā)，痔病最常用的治療方法是藥物治療[8]。 西醫(yī)一般使用靜脈活性藥物類黃酮來改善靜脈張力，穩(wěn)定毛細(xì)血管通透性和增加淋巴引流，進(jìn)行痔出血治療[9-10]。而中醫(yī)對痔的認(rèn)識由來已久，可以緩解痔病患者的癥狀，在藥物保守治療方面優(yōu)勢突出[11]。 芩薊涼血合劑為上海市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有清熱涼血、收斂止血、散瘀消癰等功效，臨床療效顯著，但是臨床提供的依據(jù)有限，因此，本研究通過建立急性痔病模型，旨在探討其治療抗痔的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80 只SPF 級雌性SD 健康大鼠，7 周齡，體重180 ～200 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK（滬）2022-0004】，24 只SPF 級C57BL／6雄性健康小鼠，6 周齡，體重18 ～20 g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（滬）2023-0004】，大鼠和小鼠均飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK（滬）2020-0014】，飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度控制在40% ～70%，溫度控制在22 ～25 ℃， 本研究經(jīng)過上海市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUC-2023002）。

1.1.2 主要試劑與儀器

巴豆油（C12229973，上海麥克林生化），吡啶（C865142，上海麥克林生化），乙醚（20210716，國藥化學(xué)試劑有限公司），乙酸（20080913，上海強(qiáng)順化工），地奧司明（H2005471，南京鄭達(dá)天晴制藥），腎上腺色腙片（H32023286，江蘇亞邦愛普森藥業(yè)），IL-6 （ 20220926-30219B， 上海酶聯(lián)）， TNF-α（20220926-31063B，上海酶聯(lián)），蘇木素染色液（22040716，中杉金橋生物技術(shù)），伊紅染色液（22062319，中杉金橋生物技術(shù)）。 芩薊涼血合劑（Qinji Liangxue mixture，QLM）已在上海市藥品監(jiān)督管理局（備案號：滬藥制劑字： Z20210039000。 執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)： SYZ-ZF-217-2005），由上海市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供（藥物組成：地黃、大薊草、黃芩、火麻仁、茜草（炭）、地榆（炭）、槐角（炭）、側(cè)柏葉（炭）、仙鶴草、甘草（蜜炙），比例為3 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶3 ∶3 ∶5 ∶1。

RM2016 病理切片機(jī)（Leica，德國），生物組織攤烤片機(jī)（YT-6C，亞光醫(yī)用電子技術(shù)），防脫載玻片（P031IH，湖南艾佳生物科技），鼓風(fēng)干燥箱（DHC-9070A，天津津立儀器設(shè)備科技），光學(xué)顯微鏡（AE41，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)）。

1.2 方法

1.2.1 巴豆油誘導(dǎo)急性痔瘡模型

巴豆油制劑（croton oil preparation，COP）由去離子水、吡啶、乙醚和6%巴豆油按1 ∶4 ∶5 ∶10 的比例配制而成。 將40 只SD 大鼠分為5 組，每組8 只，在使用COP 之前，大鼠禁食1 夜，將浸有160 μL COP 無菌棉簽（直徑4 mm），插入研究動(dòng)物的肛門（肛門直腸部分，距離肛門20 mm），并保持10 s[12]。誘導(dǎo)后24 h，各組的動(dòng)物被灌胃治療7 d，藥物的劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法》[13]進(jìn)行換算。 分組如下：對照組1（CA 組），模型組1（CB 組），QLM 低劑量組1-1（CC 組）：4.45 g／（kg·d），QLM 高劑量組1-2（CD 組）：17.8 g／（kg·d），地奧司明組1（CE 組）：100 mg／（kg·d）。 除了CA 組外，其他組均使用COP處理，CA 組及CB 組給予等量生理鹽水。

1.2.2 冰醋酸誘導(dǎo)急性痔瘡模型

將40 只SD 大鼠分為5 組，每組8 只，在冰醋酸誘導(dǎo)急性痔病模型之前，大鼠禁食1 夜，將直徑6 mm 濾紙片浸泡于99.0%醋酸溶液中，將浸泡后的濾紙片放到大鼠肛門周圍，使濾紙片緊密接觸肛周皮膚及黏膜，每次用濾紙1 片，每只鼠于0.5、1 min時(shí)換1 次濾紙片，共更換2 次[14]。 誘導(dǎo)后24 h，各組的動(dòng)物被灌胃治療7 d，藥物劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法》[13]進(jìn)行換算。 分組如下：對照組2（GA 組），模型組2（GB 組），QLM 低劑量組2-1（GC 組）：4.45 g／（kg·d），QLM 高劑量組2-2（GD 組）：17.8 g／（kg·d），地奧司明組2（GE 組）：100 mg／（kg·d）。 除了GA 組外，其他組均使用冰醋酸處理，GA 組及GB 組給予等量生理鹽水。 結(jié)束后對大鼠肛門潰瘍的最大直徑進(jìn)行測量，并計(jì)算潰瘍面積［潰瘍面積（mm2） ＝ π（最大直徑／2）2］。

1.2.3 小鼠分組及給藥

將24 只C57BL／6 小鼠分為4 組，藥物劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法》[13]進(jìn)行換算：對照組（A 組）：等量生理鹽水；QLM 低劑量組（B 組）：6.4 g／（kg·d）；QLM 高劑量組（C 組）：25.6 g／（kg·d）；腎上腺色腙片組（D 組）：1.5 mg／（kg·d）；連續(xù)灌胃7 d。

1.2.4 肛門直腸組織病理學(xué)評估

大鼠肛門直腸組織先使用4%多聚甲醛固定，再經(jīng)過包埋、切片進(jìn)行HE 染色，然后進(jìn)行封片鏡檢。 觀察巴豆油誘導(dǎo)的SD 大鼠肛門直腸組織病理學(xué)形態(tài)，參照文獻(xiàn)[14]并進(jìn)行分級評分：“-”肛門直腸黏膜上皮正常記為0 分；“ ＋”肛門直腸黏膜上皮部分變性，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤記為1 分；“＋＋”肛門直腸黏膜上皮部分變性、排列紊亂，黏膜下見大量炎性細(xì)胞浸潤記為2 分；“＋＋＋”肛門直腸黏膜上皮部分變性、缺損、壞死，黏膜下見大量炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織增生記為3 分。

1.2.5 血清炎癥因子檢測

按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定各組大鼠血清IL-6、TNF-α 水平。

1.2.6 止血療效評估

參照文獻(xiàn)[15-16]使用毛細(xì)玻管法檢測凝血時(shí)間，小鼠斷尾法測出血時(shí)間，對QLM 的止血療效進(jìn)行評價(jià)。

毛細(xì)管法測凝血時(shí)間：在末次給藥后1 h，用毛細(xì)玻璃管從小鼠內(nèi)眼球的后靜脈叢中取血。 當(dāng)血液充滿玻璃管時(shí)，立即計(jì)時(shí)。 每隔30 s 將兩端的玻璃管（約5 mm）折斷，慢慢左右拉動(dòng)，觀察破裂處是否有血凝塊。 從血液充滿玻璃管到出現(xiàn)血凝塊的時(shí)間為凝血時(shí)間。

小鼠斷尾法測出血時(shí)間：末次給藥后1 h，將小鼠麻醉，距離小鼠尾尖5 mm 處剪斷，立即開始計(jì)時(shí)，每30 s 用濾紙擦拭斷尾直至濾紙上無血為止，經(jīng)過的時(shí)間為出血時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0、Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、作圖，計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，差異比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布和方差不齊，采用中位數(shù)（上四分位數(shù)，下四分位數(shù)）［M （P25， P75）］表示，差異比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；等級資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QLM 對COP 誘導(dǎo)的大鼠痔病模型病理形態(tài)學(xué)的影響

由圖1 可見，CA 組大鼠肛門直腸區(qū)組織結(jié)構(gòu)正常；CB 組大鼠結(jié)直腸區(qū)黏膜嚴(yán)重糜爛、破損，伴有明顯的炎性浸潤，鱗狀上皮化生，黏膜下層水腫明顯，血管擴(kuò)張明顯；CC 組的組織病理學(xué)顯示明顯的黏膜上皮再生，中度的脫屑和變性，較少的炎癥浸潤，較少的血管擴(kuò)張，并且沒有明顯的充血和出血；CD 組的組織病理學(xué)顯示黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞排列有序，黏膜下微血管不充血；CE 組黏膜上皮明顯再生，結(jié)構(gòu)較完整，輕度脫屑變性，炎癥浸潤血管擴(kuò)張明顯減少，未見明顯充血出血。

2.2 QLM 對COP 誘導(dǎo)的大鼠痔病模型病變程度評分的影響

如表1 所示，與CA 組相比，CB 組病變程度評分顯著升高（P＜0.05），與CB 組相比，QLM 治療后能夠顯著降低其病變程度評分（P＜0.05）。

表1 QLM 對COP 誘導(dǎo)的大鼠痔病模型病變程度評分的影響［M （P25， P75），n ＝8］Table 1 Effect of QLM on the pathological grade score of rat hemorrhoid model induced by COP ［M （P25， P75），n ＝8］

2.3 QLM 對COP 誘導(dǎo)的大鼠痔病模型炎癥因子的影響

如表2 所示，與CA 組相比，CB 組IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），與CB 組相比，QLM 治療后能夠顯著降低IL-6、TNF-α 水平（P＜0.05）。

表2 QLM 對COP 誘導(dǎo)的大鼠痔病模型IL-6、TNF-α 的影響（± s，n ＝8）Table 2 Effect of QLM on IL-6、TNF-α in COP-induced hemorrhoids model in rats（± s，n ＝8）

表2 QLM 對COP 誘導(dǎo)的大鼠痔病模型IL-6、TNF-α 的影響（± s，n ＝8）Table 2 Effect of QLM on IL-6、TNF-α in COP-induced hemorrhoids model in rats（± s，n ＝8）

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2.4 QLM 對冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠痔病模型病理形態(tài)學(xué)的影響

如圖2 所示，GA 組肛周組織結(jié)構(gòu)正常，GB 組肛周組織紋理紊亂、糜爛、缺損、水腫，黏膜與肌層分離，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤及毛細(xì)血管擴(kuò)張；GC組肛周組織糜爛、缺損、水腫較明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，未見明顯毛細(xì)血管擴(kuò)張；GD 組及GE 組肛周組織未見明顯缺損、水腫及炎性浸潤。

圖2 QLM 對冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠痔病模型病理形態(tài)學(xué)的影響Figure 2 Effect of QLM on pathomorphology of rat hemorrhoid model induced by glacial acetic acid

2.5 QLM 對冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠痔病模型肛周潰瘍面積的影響

如表3 所示，與GA 組相比，GB 組肛周潰瘍面積顯著升高（P＜0.05），與GB 組相比，QLM 治療后能夠顯著降低其肛周潰瘍面積（P＜0.05）。

表3 QLM 對冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠痔病模型肛周潰瘍面積的影響（± s，n ＝8）Table 3 Effect of QLM on perianal ulcer area of rat hemorrhoids model induced by glacial acetic acid（± s，n ＝8）

表3 QLM 對冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠痔病模型肛周潰瘍面積的影響（± s，n ＝8）Table 3 Effect of QLM on perianal ulcer area of rat hemorrhoids model induced by glacial acetic acid（± s，n ＝8）

注：與GA 組相比，aP ＜0.05；與GB 組相比，bP ＜0.05。Note. Compared with group GA， aP ＜0.05. Compared with group GB，bP ＜0.05.

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2.6 QLM 止血療效評價(jià)

使用毛細(xì)管法和小鼠斷尾法對QLM 止血效果進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示QLM 可以顯著縮短凝血時(shí)間、出血時(shí)間（P＜0.05），見表4。

表4 QLM 止血療效評價(jià)（± s，n ＝6）Table 4 Evaluation of QLM hemostasis effect（± s，n ＝6）

表4 QLM 止血療效評價(jià)（± s，n ＝6）Table 4 Evaluation of QLM hemostasis effect（± s，n ＝6）

注：與A 組相比，cP ＜0.05。Note. Compared with group A， cP ＜0.05.

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3 討論

我國對痔的認(rèn)識可以追溯到夏商時(shí)期，最早出現(xiàn)在非醫(yī)學(xué)典籍《山海經(jīng)》[17]。 中醫(yī)學(xué)對痔病病因病機(jī)的認(rèn)識由來已久，《素問·生氣通天論》最早有“因而飽食，筋脈橫解，腸澼為痔”的記載。 后世進(jìn)一步概括為臟腑本虛，飲食勞逸，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，風(fēng)濕燥熱下迫大腸，瘀阻魄門，瘀血濁氣結(jié)滯不散，筋脈縱橫而成痔；臨床上分為治療上以清熱利濕，涼血止血，活血祛風(fēng)，補(bǔ)中益氣等為主[18]。

前期臨床研究發(fā)現(xiàn)QLM 能有效緩解出血性痔瘡患者大便帶血的癥狀，改善痔瘡黏膜充血、縮小痔瘡體積等，有效干預(yù)痔瘡的臨床進(jìn)展，降低住院手術(shù)比例，改善患者的生活，治療期間無明顯副作用[19-21]。 其中大薊草涼血止血，散瘀解毒消癰為君藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大薊有效成分具有抗炎、止血等作用[22-23]。 黃芩清熱燥濕，瀉火解毒，涼血止血依為君藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃芩有效成分具有良好的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及心腦血管保護(hù)等作用[24]。 生地黃為治熱入營血之要藥，可以清熱涼血止血，與大薊、黃芩同為君藥。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)地黃具有抗炎、止血、抗氧化等作用[25]。地榆（炭）、側(cè)柏葉既能涼血止血，又能收斂止血為臣藥。 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)地榆、側(cè)柏葉中的有效成分具有抗炎止血、抗氧化、抗菌等多種藥理活性[26-27]?；苯牵ㄌ浚鲅寡?，清腸疏風(fēng)，仙鶴草收斂止血，意在加強(qiáng)收澀止血治標(biāo)之功，共為“臣藥”。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)槐角具有止血、抗炎等作用[28]，仙鶴草具有抗炎、抗氧化等作用，同時(shí)具有抗凝促凝雙重特性[29]。 此外，涼血止血藥易于涼遏戀邪，有止血留瘀之弊。 茜草（炭）味苦性寒，功能涼血止血，祛瘀通經(jīng)。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)茜草具有良好的化瘀止血作用[30]。 治療急性出血同時(shí)，具有化瘀的作用，起到止血不留瘀，祛瘀生新血的療效。 火麻仁為“佐藥”，與生地、槐角相配功能潤腸通便，緩解長期出血的痔病患者血燥津虧，引起的便秘癥狀。 甘草調(diào)和藥性，緩和諸藥之寒，顧護(hù)脾胃陽氣，是為“使藥”。 諸藥合用共達(dá)涼血止血，清熱祛風(fēng)，散瘀消癰，潤腸通便等功效的功效。

有研究報(bào)道在痔組織血管壁及周圍結(jié)締組織發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)[31]。 國內(nèi)學(xué)者通過對380 例痔病患者痔組織進(jìn)行病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)195 例痔組織中存在慢性炎癥[32]。 免疫組化[33-34]分析也發(fā)現(xiàn)痔組織中IL-6、TNF-α 等炎癥因子表達(dá)水平升高，這提示炎癥因子可能參與了痔病的發(fā)生發(fā)展。 本課題組通過綜述近年來中藥復(fù)方或草藥制劑治療痔病的機(jī)制[35]，發(fā)現(xiàn)抑制炎癥因子也是其治療痔病的機(jī)制之一。 一些中藥復(fù)方如加味補(bǔ)中益氣湯[36]可以很好的改善痔相近動(dòng)物模型出血、局部潰瘍及水腫狀況；ZHANG 等[37]能夠降低COP 誘導(dǎo)的痔病動(dòng)物模型炎癥因子水平，減輕組織損傷；生姜外用可以減輕大、小鼠痔病模型肛周腫脹及潰瘍程度[38]；銀芷顆粒熏洗劑可以緩解急性痔病模型癥狀，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血作用[39]。 此外，國外一些研究發(fā)現(xiàn)葡萄葉醇提物、魔芋塊莖以及茄子也具有良好的抗痔活性，可能與其抗炎、抗氧化、降低血清炎癥因子等作用密切相關(guān)[40-42]。

本研究按照《中藥痔瘡動(dòng)物模型制備規(guī)范（草案）起草說明》[14]使用COP 誘導(dǎo)了大鼠肛門腫脹模型，使用冰醋酸誘導(dǎo)了大鼠肛門潰瘍模型，QLM 治療后能夠顯著改善COP、冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠肛門直腸病理損傷，降低COP 誘導(dǎo)的大鼠痔病模型病變程度評分，IL-6、TNF-α 水平以及冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠肛周潰瘍面積。 此外，使用毛細(xì)管法測凝血時(shí)間，小鼠斷尾法測出血時(shí)間，發(fā)現(xiàn)了QLM 顯示出良好的止血療效。 因而，QLM 具有的抗痔活性，其作用可能是通過抗炎、止血、減少組織損傷實(shí)現(xiàn)的。