加味芍藥甘草湯基于Toll樣受體4/核因子κB信號通路對多囊卵巢綜合征大鼠妊娠結局及免疫機制的影響※

梁爽爽 朱 莎 劉妮英 肖新益

(湖北省中西醫結合醫院婦產科,湖北 武漢 430015)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)常見于育齡婦女,是一種內分泌和代謝異常疾病,以無排卵、卵巢多囊樣、高雄激素血癥等為臨床主要癥狀[1]。近年PCOS的發病率逐年增加,其可導致患者無排卵性不孕,對女性的身心健康造成嚴重影響[2]。目前,PCOS的發病機制尚未明確,有學者研究發現[3-4],慢性低度炎癥可介導PCOS的發生發展,研究發現腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)水平在PCOS女性體內明顯升高。因此,可從炎癥角度對PCOS進行認知,可為PCOS治療的靶點。目前臨床上常采用克羅米芬、來曲唑等藥物治療PCOS,但不能完全改善臨床癥狀,不能滿足PCOS患者的生殖需求,且不良反應和并發癥均較多[5]。而中醫因其具有整體性、多靶點且副作用小的優勢,受到越來越多的關注。芍藥甘草湯主要由芍藥和甘草兩味中藥組成,兩者合用理氣健脾,滋陰養肝,緩急止痛,活血化瘀[6]。有研究發現[7-8],芍藥甘草湯及有效成分能有效降低PCOS患者血清中游離睪酮水平,進而提高患者的妊娠率。中醫學認為,腎虛血瘀導致PCOS的發生。加味芍藥甘草湯是在芍藥甘草湯的基礎上加入澤蘭活血化瘀,疏通血脈,行水消腫,治療閉經、痛經及月經紊亂等[9]。目前有研究發現[10],多種中藥可通過抑制Toll樣受體4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信號通路達到緩解或治療慢性低度炎癥目的,從而改善PCOS臨床癥狀。因此本研究建立PCOS大鼠模型,研究加味芍藥甘草湯通過調控TLR4/NF-κB信號通路對PCOS大鼠妊娠結局及免疫機制的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 80只6周齡雌性SD大鼠,SPF級,均購自青海大學醫學院動物實驗中心,動物合格證號:SCXK(青)2018-0013。體質量180～200 g,統一飼養在22 ℃、相對濕度為50%的動物房內,光暗12 h交替更換,適應性喂養1周,自由飲水、飲食。

1.2 藥物 加味芍藥甘草湯藥物組成為白芍、甘草、澤蘭,購自山西醫科大學第二醫院中藥房,且由該醫院鑒定為正品。取白芍、甘草、澤蘭各600 g,粉碎后混合,將10倍量的水加入到藥物中,浸泡1 h后煎煮2次,每次1 h;過濾煎煮后濃縮成含生藥4.24 g/mL的藥液,即加味芍藥甘草湯。本實驗藥量根據臨床實驗中人體劑量的折算標準,按低、中、高藥物比例分別為0.5∶1∶2,即得到低、中、高劑量為12.5、25.0、50.0 g/(kg·d)。炔雌醇環丙孕酮片(深圳市康哲藥業有限公司,國藥準字J20140114),來曲唑片(浙江海正藥業股份有限公司,國藥準字H20133109)。

1.3 試劑和儀器 TLR4抑制劑TAK-242(北京百奧萊博技術有限公司);TLR4、NF-κB抗體(上海連碩生物科技有限公司);吉姆薩染液(上海澤葉生物科技有限公司);高速離心機(D37520 Osterode型,德國Biofuge公司);CytoFLEX型流式細胞儀[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司];TLR4、p-NF-κB p65、β-actin抗體(英國Abcam公司);蛋白提取試劑盒購(北京普非生物科技有限公司);超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術有限公司);DM3000生物光學顯微鏡(德國Leica公司);PROTEAN小型蛋白電泳轉膜系統(美國Bio-Rad公司)。

1.4 分組、模型制備和給藥 將80只大鼠隨機分為空白組10只和造模組70只。造模組采用來曲唑片誘導制備PCOS大鼠模型,將來曲唑片溶于1%羧甲基纖維素鈉中,予來曲唑溶液1 mg/(kg·d)灌胃21天;空白組大鼠予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。造模后每日對造模組大鼠進行陰道涂片,并經吉姆薩染液染色,觀察大鼠動情周期變化。大鼠進行陰道涂片處理,將棉簽浸泡在0.9%氯化鈉溶液中,然后用棉簽在大鼠陰道側壁上的1/3處輕輕刮取,將得到的黏液和細胞輕薄且均勻涂抹在載玻片上,將其置于無水乙醇中固定,3 min后將吉姆薩染液染色加入到載玻片中并染色,置于光學顯微鏡下觀察細胞變化情況。空白組大鼠有4～5天的規律動情周期,可分為4個階段,即以有核上皮細胞為主的動情前期,以無核不規則狀角化上皮細胞為主的動情期,同時可見有核上皮細胞、角化上皮細胞與白細胞的動情后期,以白細胞為主的動情間期。而造模大鼠動情周期明顯紊亂,表示PCOS模型制備成功。將造模成功的70只大鼠按照隨機數字表法分為7組,模型組10只予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃,加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組各10只,分別予加味芍藥甘草湯12.5、25.0、50.0 g/kg灌胃,炔雌醇環丙孕酮片組10只予炔雌醇環丙孕酮片0.2035 g/kg灌胃,抑制劑組10只經尾靜脈注射TAK-242 10 mg/kg,聯合組10只予加味芍藥甘草湯50 g/kg灌胃,同時尾靜脈注射TAK-242 10 mg/kg,空白組10只大鼠予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠均每日給藥1次,連續給藥2周。

1.5 大鼠體質量及卵巢質量 測量各組大鼠給藥結束后體質量,再在末次給藥24 h后分別處死大鼠,取出卵巢,快速去除兩側卵巢多余組織,稱取卵巢組織質量。

1.6 T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+各組大鼠末次給藥24 h后,麻醉各組大鼠,取腹主動脈血5 mL,將血液用EDTA抗凝后,各組取60 μL血加入到流式細胞儀中,檢測T細胞亞群中CD4+、CD8+細胞百分率和CD4+/CD8+。

1.7 蛋白質免疫印跡(Western Blot)檢測卵巢組織中TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)表達 末次給藥24 h后,取各組大鼠部分卵巢組織50 mg,于冰上裂解組織至組織均漿,離心組織均漿,用DAB法檢測上清液中蛋白濃度。分別配置濃縮和分離膠,濃度分別為5%和8%,在膠孔中分別加入樣品蛋白,電泳10 min后轉膜。孵育2 h后,將5%封閉液加入到樣品中,激活后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,封閉PVDF膜1 h。分別加入一抗TLR4、NF-κB過夜,繼續加入HRP標記的二抗,繼續孵育2 h,采用磷酸緩沖生理鹽水洗滌,取ECL發光液A和B等量混勻,加在膜的正面與之充分接觸,成像后通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。用ECL檢測細胞PVDF膜并成像。

1.8 檢測各組大鼠妊娠率和各組孕鼠的胚泡著床數 末次給藥后12 h,均隨機取各組8只雌性大鼠,于下午6∶00與雄鼠按照2∶1合籠,次日早8∶00檢查陰道涂片,以發現大量精子者記為妊娠第1天,如未見大量精子記為未孕鼠。于妊娠第8天下午4∶00處死,摘取雙側子宮,記錄所有孕鼠數及每只孕鼠的胚泡著床數,比較各組妊娠率(妊娠率=孕鼠數/受試動物數×100%)及各組孕鼠胚泡著床數。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和卵巢質量比較 與空白組比較,模型組體質量和卵巢質量均升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠體質量和卵巢質量均降低(P<0.05);加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組體質量和卵巢質量組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05),且呈劑量依賴;加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環丙孕酮片組和抑制劑組大鼠給藥后體質量和卵巢質量兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05);與加味芍藥甘草湯高劑量組比較,聯合組大鼠給藥后體質量和卵巢質量均降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量和卵巢質量比較

2.2 各組大鼠T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較 與空白組比較,模型組大鼠CD4+、CD4+/CD8+降低(P<0.05),CD8+升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠CD4+、CD4+/CD8+均升高(P<0.05),CD8+均降低(P<0.05);加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05);加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環丙孕酮片組、抑制劑組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05);與芍藥甘草湯高劑量組比較,聯合組大鼠CD4+、CD4+/CD8+均升高(P<0.05),CD8+降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較

2.3 各組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達比較 與空白組比較,模型組大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達均升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達均降低(P<0.05);加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05),且呈劑量依賴;加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環丙孕酮片組組和抑制劑組大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達比較差異均無統計學意義(P>0.05);與芍藥甘草湯高劑量組比較,聯合組大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達均升高(P<0.05)。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達水平

表3 各組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達比較

2.4 各組大鼠妊娠率和各組孕鼠的胚泡著床數比較 與空白組比較,模型組大鼠妊娠率和胚泡著床數均降低(P<0.05);與模型組比較,加味芍藥甘草湯中、高劑量組大鼠妊娠率升高,加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組大鼠胚泡著床數升高(P<0.05),且呈劑量依賴;加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環丙孕酮片組和抑制劑組大鼠妊娠率和胚泡著床數比較差異均無統計學意義(P>0.05);與加味芍藥甘草湯高劑量組比較,聯合組大鼠胚泡著床數升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠妊娠率和各組孕鼠的胚泡著床數比較

3 討論

PCOS發病機制復雜,目前臨床上治療PCOS方法主要為對癥治療,但治療效果并不十分理想[11]。PCOS在中醫學中被歸為“閉經” “不孕”“崩漏”“癥瘕”等范疇,認為氣虛痰瘀是導致PCOS發病的關鍵因素。加味芍藥甘草湯中白芍養血斂陰,理氣健脾;甘草益血通經,緩急止痛;澤蘭活血祛瘀,利水消腫[12]。有研究表明[13],芍藥苷對離體脂肪組織分解有明顯的促進作用,白芍對卵巢肥胖大鼠的體質量有抑制作用。本實驗結果顯示,加味芍藥甘草湯可減輕PCOS大鼠體質量和卵巢質量,且呈劑量依賴。有文獻顯示[14],PCOS患者輕微減重,可促進自發排卵,增加妊娠率,且對高雄激素癥、高脂血癥有明顯的改善作用。由此可見,加味芍藥甘草湯可通過減輕體質量而改善PCOS癥狀。子宮內膜是女性生殖功能的基本結構單位,也是能量代謝活躍的器官。當子宮內膜容受性受損時,胚泡著床會發生障礙,從而導致PCOS患者不易受孕或受孕后容易流產。本研究結果顯示,加味芍藥甘草湯可增加PCOS大鼠妊娠率和胚泡著床數,提示加味芍藥甘草湯可促進PCOS大鼠胚泡著床數,進而改善PCOS大鼠預后。有研究證實,可通過上調子宮內膜PR表達改善卵巢功能,提高子宮內膜容受性和早期妊娠率,從而改善妊娠結局[15]。

有文獻顯示,機體在排卵前卵泡存在多種免疫細胞,包括T淋巴細胞等,當免疫細胞異常表達時,機體免疫功能紊亂,從而導致機體所分泌的免疫相關因子比例嚴重失調,引發PCOS[16]。近年來免疫學快速發展,學者們也逐漸認識到PCOS的發病機制可能與T淋巴細胞亞群密切相關[17]。在所有成熟的T淋巴細胞表面均有CD3+分子的表達,而CD4+、CD8+會在不同的成熟T淋巴細胞表面表達。CD4+細胞可分泌白細胞介素2(IL-2)、IL-12、干擾素γ(IFN-γ)等介質,進而對B細胞產生的抗體進行促進;而CD8+可對B細胞產生抗體進行抑制。胡偉嬌等[18]通過研究發現,與正常女性比較,PCOS患者卵泡液中CD3+細胞、CD8+細胞比例顯著降低,表明PCOS患者體內免疫系統處于紊亂狀態。除此之外,外周活化的T淋巴細胞可誘導其受體PD-1的表達,并通過抑制PCOS患者CD4+和CD8+細胞功能而降低IFN-γ表達,進而對T淋巴細胞亞群的功能起到抑制作用;另外,當T淋巴細胞亞群功能出現失調時,雌激素水平降低,IFN-γ和PD-1異常表達,進而對卵泡發育、排卵造成影響。本研究結果顯示,PCOS大鼠CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高,提示PCOS大鼠體內免疫系統處于紊亂狀態,加味芍藥甘草湯干預后PCOS大鼠CD4+、CD4+/CD8+升高,CD8+降低,提示加味芍藥甘草湯可改善PCOS大鼠免疫功能。

目前,PCOS的發病機制尚不完全清楚,但近年來發現慢性低度炎癥可介導PCOS的發生發展。研究發現,PCOS以雙側卵巢增大、白膜增厚并發生硬化、皮質出現纖維化、卵巢間質增生等為主要病理改變,同時也是慢性增生性炎癥的一種表現[19]。有研究顯示,激活的TLR-4 /NF-κB炎癥信號通路與多種炎癥疾病的發生發展密切相關。TLR4是炎性反應的“閘門”,適度的TLR4表達可維持機體功能,但TLR4過度表達可損傷相關組織[20]。TLR4可通過MyD88而活化NF-κB。NF-κB是炎癥啟動和調節過程中關鍵的轉錄因子之一,可介導炎癥的發生發展。在靜息狀態下,NF -κB家族蛋白可結合其遏制物核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α),從而形成無活性三聚體,當細胞內內外源性刺激無活性三聚體后,IκB-α會通過磷酸化和泛素化降解而釋放大量的NF-κB易位,從而磷酸化細胞核,后可結合轉錄調控元,從而激活下游多個炎癥基因的轉錄,導致炎癥發生。本研究結果顯示,PCOS大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達升高,加味芍藥甘草湯干預組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達降低。由此可見,PCOS大鼠存在慢性增生性炎癥狀態,加味芍藥甘草湯可通過抑制TLR4和p-NF-κB p65的表達抑制炎癥狀態。常壯鵬等[21]研究證實,加味芍藥甘草湯可能通過抑制NF-κB炎癥信號通路的活化減少炎癥因子釋放,達到調節卵巢激素微環境并且改善多囊卵巢形態和功能的作用。為證實加味芍藥甘草湯能通過抑制TLR4/NF-κB通路而對PCOS進行調控,本研究采用TLR4/NF-κB信號通路抑制劑TAK-242對PCOS大鼠進行干預,結果顯示,TAK-242能降低大鼠體質量和卵巢質量,改善大鼠體內免疫功能,抑制卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達,增加妊娠率和胚泡著床率。為進一步證實加味芍藥甘草湯是通過抑制TLR4/NF-κB通路而對PCOS大鼠發揮作用,本研究用加味芍藥甘草湯高劑量聯合TAK-242干預PCOS大鼠,結果發現其干預效果高于單獨使用加味芍藥甘草湯或TAK-242。

綜上所述,加味芍藥甘草湯能通過抑制TLR4/NF-κB通路調節PCOS大鼠免疫機制,改善PCOS大鼠妊娠結局。