超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定蔬菜中4種異噻唑啉酮類化合物的含量

李根容,阮 燕,田小艷,余文琴,蔡 瓊

(1.重慶市計量質量檢測研究院,重慶 401123;2.國家農副加工產品及調味品質量監督檢驗中心,重慶 401123)

異噻唑啉酮類化合物是一類含有氮原子和硫原子的五元雜環化合物,主要包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMIT)、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MIT)、1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮(OIT)等。異噻唑啉酮類化合物是一種重要的滅菌防腐劑,因具有高效、作用持續時間長、可降解等優點被廣泛應用于化工、農業園林、造紙、日化等領域[1-3]。研究表明,該類化合物具有細胞毒性和神經毒性,是一類致敏劑,可導致皮膚產生接觸性過敏或皮炎等癥狀[4-5]。蔬菜中殘留的異噻唑啉酮類化合物被人們直接攝入,危害身體健康[6]。近年來,國內外對玩具、化妝品、食品接觸材料等日用品中異噻唑啉酮類殺菌防腐劑的使用制定了嚴格的法規標準[7-8],但我國現行國家標準尚未對蔬菜中的異噻唑啉酮類化合物的使用量和使用范圍進行規定,僅在2015年農業部農藥檢定所起草發布的《農藥助劑禁限用名單》(征求意見稿)中規定BIT、MIT的限量(質量分數)分別為0.1%、0.002 2%,但正式稿至今還未出臺。因此,開發測定異噻唑啉酮類化合物含量的分析方法對保障蔬菜食品安全具有重要意義。

目前,異噻唑啉酮類化合物的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[9]、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[10]、紫外分光光度法[11]、高效液相色譜法(HPLC)[12]、超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)[13-16]等。HPLC靈敏度低,易出現假陽性,已經無法滿足檢驗檢測要求;GC和GC-MS/MS操作繁瑣,分析時間長且容易造成目標物的損失。相較之下UHPLC-MS/MS檢出限低,選擇性好,分析時間短,更適用于檢測復雜體系中極性較強和沸點較高的異噻唑啉酮類化合物。然而,UHPLC-MS/MS檢測異噻唑啉酮類化合物主要集中于化妝品、紙張、膠黏劑等領域,蔬菜中異噻唑啉酮類化合物的檢測尚未見報道。因此,本工作提出了一種以乙腈為提取溶劑,結合固相萃取凈化技術,采用UHPLC-MS/MS測定蔬菜中4種異噻唑啉酮類化合物含量的方法,以期為蔬菜中異噻唑啉酮類化合物的檢測和相關標準的制定提供技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ExionLC型超高效液相色譜儀,AB SCIEX API 5500型三重四極桿質譜儀,配電噴霧離子(ESI)源;3K15型醫用離心機;SP-40LN型氮氣發生器;KQ-500DE型數控超聲波清洗器;QSPE-24型固相萃取裝置。

混合標準溶液:分別移取0.1 mL的CMIT、MIT、BIT標準儲備溶液,0.005 mL的OIT標準儲備溶液于100 mL容量瓶中,以10%(體積分數,下同)甲醇溶液定容,得到CMIT、MIT、BIT、OIT質量濃度分別為1,1,1,0.05 mg·L-1的混合標準溶液,現配現用。

CMIT標準物質的純度為99.7%;MIT標準物質的純度為100.0%±1.0%;BIT標準物質的純度為99.8%;OIT標準物質的純度為98.96%,于0～4 ℃避光儲存;甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯均為色譜純;其余試劑為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQIUTY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫 35 ℃;進樣量 2 μL;流量0.3 mL·min-1;流動相A為水,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～0.5 min時,A由0升至95%;0.5～1.5 min時,A由95%降至80%;1.5～2.5 min時,A由80%降至5%,保持1.0 min;3.5～4.0 min時,A由5%升至95%,保持1.5 min。

1.2.2 質譜條件

ESI源,正離子(ESI+)掃描模式;多反應監測(MRM)采集模式;離子噴霧電壓 5 500 V;離子源溫度 600 ℃;干燥氣和霧化氣均為高純氮氣;4種異噻唑啉酮類化合物的其他質譜參數見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質譜參數

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取

2.3 血清因子與肺功能及EOS、ACT評分的相關性分析 血清IgE、IL-4水平與FVC 、FEV1、FEV1/FVC及ACT評分呈負相關(P<0.05)，與痰EOS呈正相關(P<0.05)；RPB水平與FVC 、FEV1、FEV1/FVC及ACT評分呈正相關(P<0.05)，與痰EOS呈負相關(P<0.05)。見表3。

準確稱取10.0 g(精確至0.01 g)已勻漿的蔬菜樣品置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,超聲提取30 min后以轉速8 000 r·min-1離心3 min。取上清液,殘渣用10 mL乙腈重復提取一次,合并乙腈提取液,加入5 g氯化鈉,劇烈振蕩1 min后靜置5 min,取上層乙腈相,于40 ℃氮吹濃縮至近干,用2 mL 10%甲醇溶液溶解殘渣,待凈化。

1.3.2 樣品凈化

將HLB固相萃取小柱置于固相萃取裝置上,依次用5 mL甲醇和5 mL水活化柱子,然后將待凈化的提取液全部轉移到已活化平衡的HLB固相萃取小柱中,待液體全部流出,加入5 mL 10%甲醇溶液淋洗,棄去流出液,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,于40 ℃氮吹濃縮至近干后,用甲醇定容至1 mL,過0.22 μm有機濾膜,按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱

試驗分別考察了SHIM-PARK CISS C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)、ZORBOX ECLISE PLUS C8(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Kromasil C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)、ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)4種色譜柱對4種異噻唑啉酮類化合物的分離效果,結果見圖1。

1—MIT;2—CMIT;3—BIT;4—OIT

結果表明,4種色譜柱對目標物的保留能力差別不大,但ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱對目標物的分離效果相對較好,響應較高,目標物均能實現基線分離且峰形尖銳、對稱。因此,試驗選擇ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱進行分離。

2.1.2 流動相

在相同梯度洗脫條件下試驗對比了分別以甲醇-水和乙腈-水為流動體系時4種異噻唑啉酮類化合物的分離效果, 結果表明, 甲醇-水體系的分離效果更好,質譜響應更高。為了增加正離子的電離程度,改善峰形,可在甲醇-水體系中加入甲酸或甲酸銨,因此試驗又對比了甲醇-0.1%(體積分數)甲酸溶液體系和甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨溶液體系對目標物的分離效果。結果顯示:在流動相體系中加入甲酸后目標物的響應降低,峰形未得到明顯改善;而加入甲酸銨后,可有效降低基線背景,但響應同樣有所降低。為了得到更高的方法靈敏度,試驗選擇甲醇-水體系為流動相。

2.2 樣品前處理條件的選擇

2.2.1 提取溶劑

4種異噻唑啉酮類化合物都是極性化合物,易溶于水以及多種有機溶劑。選取了空白白菜基質進行加標試驗,分別考察了以水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑時4種異噻唑啉酮類化合物的提取效果,低濃度水平下(添加CMIT、MIT、BIT質量濃度為5.0 μg·kg-1,OIT質量濃度為0.25 μg·kg-1)4種異噻唑啉酮類化合物的回收率結果見圖2。

圖2 低濃度水平下提取溶劑對4種異噻唑啉酮類化合物回收率的影響

結果表明:在低濃度水平下,采用乙酸乙酯提取時目標物回收效果較差;采用水、甲醇、乙腈、丙酮提取時目標物的回收率均能達到70.0%以上。考慮到隨著加標濃度水平的增大,以水和甲醇提取時OIT的回收率降低,且丙酮毒性較大,試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 固相萃取條件

蔬菜提取液中除含有大量葉綠素、葉黃素等多種色素外,還含有糖類、有機酸等雜質,基質成分十分復雜,會抑制化合物的離子化率,不利于質譜檢測分析,故選擇對極性化合物有很好保留效果的HLB固相萃取小柱對提取液進行凈化。為了盡可能將親水親脂雜質均淋洗下來,需要在淋洗液中加入一定比例的有機溶劑,但有機相比例過大會將目標物一起淋洗下來,因此試驗首先對淋洗液的有機相含量進行考察,分別以體積分數為1%,5%,10%,15%,20%,30%的甲醇溶液為淋洗液,考察了其對4種異噻唑啉酮類化合物回收率的影響,結果如圖3所示。

圖3 淋洗液中甲醇體積分數對4種異噻唑啉酮類化合物回收率的影響

結果表明,10%甲醇溶液具有很好的淋洗效果,且淋洗流出液中未檢測到目標物,故試驗選擇10%甲醇溶液作為淋洗液。

試驗進一步考察了甲醇和乙腈兩種不同極性的洗脫溶劑對目標物的洗脫效果。結果發現甲醇和乙腈對目標物的洗脫效果基本一致,考慮到甲醇沸點低于乙腈,便于后續氮吹濃縮,試驗選擇甲醇作為洗脫溶劑。

2.3 基質效應

基質效應是指除被測物以外樣本的特征,其能夠影響被測物的檢測及測定結果,包括基質增強效應和基質抑制效應。基質效應(ME)=(基質溶液中目標物的峰面積/純溶液中目標物的峰面積)×100%,ME<80%視為強基質抑制效應,80%120%視為強基質增強效應。試驗選擇了白菜、豇豆、番茄和韭菜4種蔬菜基質樣品,在CMIT、MIT、BIT質量濃度為50.0 μg·L-1,OIT質量濃度為2.5 μg·L-1的情況下,對4種異噻唑啉酮類化合物進行基質效應評價,結果如圖4所示。

圖4 4種異噻唑啉酮類化合物在不同基質中的基質效應

由圖4可知,CMIT、MIT、BIT、OIT在4種蔬菜基質中均表現為強基質抑制效應,其中韭菜對目標物的基質效應整體更強,在相同蔬菜基質中BIT的基質抑制效應相對較大。因此,試驗采用配制基質匹配標準溶液來繪制工作曲線,以消除基質效應。

2.4 工作曲線、檢出限和測定下限

分別使用白菜、豇豆、番茄和韭菜4種蔬菜空白基質溶液配制CMIT、MIT、BIT的質量濃度為5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,400.0,600.0 μg·L-1,OIT質量濃度為0.25,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,20.0,30.0 μg·L-1的混合標準溶液系列,在優化的儀器工作條件下分析,以目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標,繪制工作曲線。結果表明,4種異噻唑啉酮類化合物的質量濃度在一定范圍內與對應的峰面積呈線性關系,其線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

表2 線性參數、檢出限和測定下限

分別采用3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(3S/N),10倍信噪比確定方法的測定下限(10S/N),結果見表2。

2.5 精密度和回收試驗

在空白蔬菜基質溶液中加入低、中、高3種濃度水平的4種異噻唑啉酮類化合物,按試驗方法進行測定,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果(n=6)

由表3可知,4種異噻唑啉酮類化合物在不同蔬菜基質中的回收率為68.8%～81.3%,測定值的RSD為2.6%～8.9%,滿足蔬菜中農藥殘留的檢測要求。

2.6 樣品分析

采用試驗方法對市售的20種蔬菜進行測定,結果發現僅在一組韭菜樣品中檢出BIT,檢出量為2.3 μg·kg-1,其余樣品中均未檢出目標物。

本工作提出了一種快速測定蔬菜中4種異噻唑啉酮類化合物含量的超高效液相色譜-串聯質譜法。以乙腈為提取溶劑,經過HLB固相萃取小柱凈化,采用基質匹配法定量,在優化的儀器工作條件下,能準確測定蔬菜中殘留的4種異噻唑啉酮類化合物。該方法操作簡單,靈敏度高,回收率、精密度均滿足蔬菜中農藥殘留的檢測要求,適用于高通量的樣品檢測。