魚肉中硝基呋喃類藥物殘留的測定能力驗證結果與分析

朱雨田,黎燕玲,李瑩瑩,鄭燕燕,何麗香,李錦才

(深圳市計量質量檢測研究院 國家營養食品質量檢驗檢測中心(廣東),深圳 518131)

硝基呋喃類藥物因具有良好的抑菌殺菌作用而廣泛用于水產及畜禽等動物疾病的防治[1-3]。呋喃唑酮作為最典型的一種硝基呋喃類抗生素,其在動物體內代謝消除快,生物半衰期短,但其代謝產物3-氨基-2-唑烷酮(AOZ)具有很強的蛋白結合性[4],可長時間殘存在動物內臟及肌肉等組織中,且AOZ有很強的毒副作用,長期攝入AOZ超標的食品可能會對人體胃腸道、肝臟等器官造成一定損傷[5-8]。出于安全性考慮,世界上大部分國家均嚴禁使用該類藥物。早在2002年我國就已將硝基呋喃類藥物列為禁用藥物,并不得在動物性食品中檢出,農業農村部250號公告也再次將呋喃唑酮列入食品動物禁用化合物名錄[9]。但是,由于該類藥物藥效好、價格低廉,一些養殖戶依然違規使用。近幾年,水產養殖業中違規使用硝基呋喃類藥物問題頻頻爆出,根據2021年1月農業農村部農產品質量安全監管司發布的《2020年食用農產品市場監管部門抽檢不合格情況》簡報顯示[10],水產品中硝基呋喃類代謝物檢出情況較為突出,其中不合格AOZ就有40批次。此外,根據各級地方政府監管抽檢通報信息顯示[11-15],畜禽水產品中AOZ檢出問題也頻頻發生,其中水產品中AOZ不合格情況尤為明顯。AOZ測定是檢驗檢測機構開展食品中獸藥殘留分析所必備的能力之一,從事該項目檢測的機構數量龐大,且近5年總局未組織過該類項目的國家級檢驗檢測機構能力驗證。因此,為了了解和評價參加實驗室在水產品中藥物殘留方面的檢測能力和水平,識別實驗室間存在的差異,受國家市場監督管理總局委托,本單位負責承擔2022年國家級檢驗檢測機構能力驗證計劃《魚肉中硝基呋喃類藥物殘留的測定》(計劃編號:CNCA-22-04)的具體實施工作,該項目的實施完成將助力相關監管部門強化對食品及食用農產品承檢機構的考核評價,也可進一步驅動和提升參加實驗室的技術能力,對規范實驗室的管理水平具有重要意義。

1 試驗方法

1.1 儀器與試劑

AB 5500+型液相色譜-串聯質譜聯用儀;Pilot7-12E型真空冷凍干燥機;QUINTIX313-1CN型電子天平;IKA MS3型漩渦混合器;Milli-Q型純水機;3K15型離心機;Turbo Vap LV型氮吹儀。

AOZ標準物質的純度為99.14%;AOZ-d4同位素內標的純度為99.7%;甲醇、乙酸銨、2-硝基苯甲醛、乙腈為色譜純;乙酸乙酯為分析純;試驗用水符合GB/T 6682—2008一級水指標。

1.2 樣品設計及制備

本次能力驗證共設計3個濃度水平(I、II、III組)的魚肉凍干粉,3組樣品中AOZ濃度水平均不同。每組濃度水平制備500份左右,共制備1 405份樣品,包括均勻性檢驗、穩定性檢驗、測試用樣品等。樣品選用草魚魚肉為基質,市場購買活魚后進行宰殺,取肌肉組織(去皮、剔除骨刺),斬拌成魚糜,根據預設各組樣品的AOZ濃度水平和魚糜質量,分別向各組魚糜中加入3,4,7.5 mL的5 mg·L-1的AOZ標準溶液,充分攪拌均勻,采用真空冷凍干燥工藝進行制備,凍干后粉碎、過篩、混勻,制成凍干粉,采用7 mL西林瓶密封包裝,再放入鋁箔袋真空密封包裝,并粘貼帶有唯一性隨機編號的標簽,制備成符合要求的能力驗證樣品,每瓶2 g左右。制備完成的魚肉凍干粉樣品按質量比1…4加水復原后等同于新鮮的魚肉糜樣品,最小取樣量為0.4 g。3組樣品分別于不同日期進行分裝并加貼標簽,以免混淆,于-18 ℃冷凍儲存。

1.3 樣品均勻性檢驗

采用隨機方式從3組樣品最小包裝單元各抽取10份,按照農業部783號公告-1—2006《水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[16](以下簡稱“農業部783號公告-1—2006”)測定,運用單因子方差分析,F檢驗判斷各組樣品的均勻情況。待參加者回報結果后,再利用0.3σ(σ表示能力評定標準差)準則再次評價樣品均勻性。

1.4 樣品穩定性檢驗

本次能力驗證項目穩定性檢測方法也采用農業部783號公告-1—2006。將樣品儲存在40℃環境條件下7 d,模擬樣品的運輸穩定性。分別在樣品制備完成后、發樣前、回收結果后進行儲存穩定性檢驗。按照CNAS-GL003:2018 《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》要求,采用t檢驗法及0.3σ準則進行評定。

1.5 樣品發放

向每家參加實驗室隨機發放兩份不同的考核樣品,記錄樣品信息,同時隨樣品一同發放相關資料,再放入冰袋進行包裝,并加貼快遞面單。

1.6 推薦檢測方法

本項目可選用GB/T 20752—2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》、GB/T 21311—2007《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯質譜法》、GB 31656.13—2021《食品安全國家標準 水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》、農業部781號公告-4—2006《動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》及農業部783號公告-1—2006等國家及行業標準。

1.7 不確定度計算

本項目以穩健平均值為指定值,根據GB/T 28043—2019《利用實驗室間比對進行能力驗證的統計方法》第7.7.3條要求,指定值不確定度(ux)可以按下式估計獲得。

式中:s*表示穩健標準差;p表示結果數。

1.8 結果統計方法

結果回收匯總后,依據原始記錄和結果上報表,剔除小數點錯誤、單位錯誤、計算錯誤等存在粗大誤差的結果。采用穩健統計技術算法A對參加者結果進行處理,穩健平均值用作指定值,穩健標準差用作能力評定標準差。該計劃統計量包括結果提交數量、穩健平均值、穩健標準差、不確定度、變異系數。該項目選擇z值作為各參加者的能力評定統計量,當兩個樣品的AOZ項目檢測結果均符合|z|<3,則判定為滿意實驗室,當兩個樣品的任一AOZ項目檢測結果|z|≥3,則判定為不滿意實驗室。

2 結果與討論

2.1 樣品均勻性和穩定性評價

本次能力驗證所制備的3組不同濃度水平的樣品均勻性F值分別為1.89,1.66,1.43,均小于臨界值[F0.05(9,10)=3.02];穩定性檢驗t值為0.755～1.33,均小于臨界值[t0.05(30)=2.042];均勻性平均值與各穩定性平均值的絕對差值小于0.3σ;回收結果后,樣品間不均勻性標準差Ss分別為0.182,0.127,0.067 1,均小于0.3σ。以上結果表明樣品的均勻性和穩定性完全滿足本次能力驗證的要求。

2.2 能力驗證結果統計

2.2.1 參加實驗室概況

該項目共收到339家實驗室報名,最終327家參與,12家因故未能參加。參加者地域及行業覆蓋范圍廣,全國除港澳臺外的31個省(直轄市、自治區)均有實驗室報名參加,實驗室類型包括海關、農業農村部、市場監督管理、疾病控制等系統內實驗室及科研院所、第三方檢測機構等。參加者具體地域和行業分布見表1和表2。

表1 實驗室地域分布

表2 實驗室的行業分布及占比

2.2.2 能力驗證結果統計量

該項目統計量具體見表3,由表3可知,指定值不確定度均小于0.3s*,說明該項目的不確定度可忽略。根據3組參加者結果繪制頻率分布直方圖,見圖1。由圖1可知,該項目參加者結果服從近似正態分布,說明該項目可以采用穩健統計技術算法A分析。

圖1 實驗室結果頻率直方圖

表3 AOZ能力驗證統計量

2.2.3 參加者結果評價

從總體分析結果看,滿意實驗室為297家,占總參加數量的90.8%;不滿意實驗室為30家,占總參加數量的9.2%。按不滿意實驗室類型分析,海關系統檢測機構不滿意情況較為突出,占所有不滿意實驗室總數的53%。各組樣品評價結果見表4。

表4 3組樣品評價結果匯總

由表4可知:按樣品分組情況分析,本次能力驗證共收到654個測試結果;第Ⅰ組滿意的結果數209個,占該組結果總數的95.4%;第Ⅱ組滿意的結果數195個,占該組結果總數的89.9%;第Ⅲ組滿意的結果數200個,占該組結果總數的91.7%。

2.3 技術分析

2.3.1 檢測方法匯總與分析

參加本次能力驗證計劃的機構共計采用了6種檢測方法,109家采用GB/T 21311—2007、94家采用GB 31656.13—2021、94家采用農業部783號公告-1—2006、15家采用GB/T 20752—2006、14家采用農業部781號公告-4—2006、1家采用《2019年國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊》對測試樣品中的呋喃唑酮代謝物(AOZ)進行測定。在方法等效性方面,6種方法均為液相色譜-串聯質譜法,原理基本一致,樣品經過鹽酸水解、鄰硝基苯甲醛衍生后,調節酸度,提取液利用乙酸乙酯液液萃取或采用固相萃取柱等方式凈化,各檢測方法的檢出限/測定下限完全滿足此次計劃要求,通過對6種方法技術參數的詳細比對[見表5,其中實驗室157#采用了序號6的檢測方法,實際稱樣量為2.00 g(折算干粉為0.40 g)滿足該能力驗證計劃最小稱樣量的要求,其采用的凈化方式為乙酸乙酯液液萃取],表明6種方法技術是等效一致的。此外,為了驗證方法之間的差異性,項目組還在方案設計之初,分別采用推薦的5種檢測方法對預試驗制備的樣品各自獨立測定10次,采用兩兩配對獨立t檢驗方式進行分析,t值均小于臨界值t0.05(18)(2.101),結果表明本項目推薦的方法之間無顯著性差異。本項目只有1家機構使用了推薦方法以外的檢測方法,經過對該方法及參加者提交的原始記錄等材料的審核和比較,該參加者使用的方法與推薦方法基本一致。綜上,說明本項目中參加者選擇不同的檢測方法并不會影響對結果的判斷。

2.3.2 檢測過程質量控制

檢測結果準確度的影響因素有很多方面,主要涉及人-檢測員、機-關鍵設備、料-試劑耗材、法-檢測標準、環-試驗環境、測-檢測環節等。基于該項目開展情況及參加者提交資料分析,檢測機構在測定AOZ過程中應重點關注以下幾點。

(1) 前處理操作方面:目標物上機前需要經過水解衍生、提取凈化等步驟,檢測員應嚴格按照標準及參試指導書要求進行。AOZ檢測的前處理過程中,按標準要求調節酸度是關鍵步驟,未控制好提取液的酸度會嚴重影響AOZ的提取效率。同時,衍生過程要控制好溫度,避光,衍生時間要滿足標準要求。

(2) 標準物質方面:AOZ的標準物質多為固體形式,在配制標準溶液時應根據證書上提供的純度進行折算。采用經過檢定合格的天平、移液管、容量瓶等器具進行配制。配制后,儲存條件要符合標準要求。1家實驗室偏離標準要求,直接使用了AOZ的衍生物作為標準物質對樣品中AOZ含量進行檢測,導致報送錯誤結果。

(3) 儀器參數設定方面:該項目測定均為液相色譜-串聯質譜法,色譜條件和質譜條件都會影響到結果準確度。從參加者提供譜圖記錄可以看出,個別實驗室結果峰形拖尾,積分不準確,影響結果的準確定量。質譜參數的設置也會直接影響結果準確度,質譜數據采集點設置不合理,且積分未做平滑處理時,峰形差,峰面積積分可能會存在誤差,也會影響檢測結果的準確度。

(4) 檢測方法使用方面:部分實驗室偏離方法要求,且未采用相應的質控方式對結果進行驗證。個別實驗室選用GB 31656.13—2021、GB/T 21311—2007等檢測方法,但未按方法要求采用內標法進行定量,偏離方法要求,這可能是導致最終測試結果偏離較大的主要原因。

3 結論

作為2022年國家級檢驗檢測機構食品領域能力驗證計劃之一,該項目對我國327家檢測實驗室魚肉中AOZ殘留量測定的能力進行了驗證比對分析,從統計分析情況看,總體滿意率達90.8%,說明我國食品檢測實驗室在水產品中藥物殘留檢測方面具備較高的水平。本項目實施過程中,也發現個別檢測實驗室在人員能力、設備維護、記錄合規性、標準理解等方面的水平有待進一步提高,建議不滿意的實驗室和結果評價偏差在臨界值附近的實驗室利用本次能力驗證分析結果,依據檢測方法標準要求,聯系機構自身情況,仔細查找分析可能存在的問題,并按質量管理體系要求進行整改,持續強化對實驗室人員檢測技能的監督和評價。