脯氨酸羥化酶(PHDs)對動物骨骼肌發育和脂肪沉積的調控作用及其機制

梁淑怡,李 凡,江青艷,王松波

(華南農業大學動物科學學院 廣東省動物營養調控重點實驗室 優百特脂立方功能性脂肪酸研究中心,廣州 510642)

骨骼肌和脂肪是動物機體的主要組成部分,同時,骨骼肌發育及脂肪沉積也會直接影響畜禽的產品品質。動物骨骼肌發育和脂肪沉積都是復雜且有序的生理過程。骨骼肌的大小主要由肌纖維的數量以及肌纖維的肥大決定,肌纖維的數量在動物胚胎期就基本固定了,而肌纖維的肥大以及肌纖維的類型對畜禽的產肉性狀起著重要作用[1]。脂肪沉積主要通過脂肪細胞的數量增加和體積增大來實現[2]。骨骼肌發育和脂肪沉積過程受到多種因素的調節,具體的調控機制尚不完全明了。脯氨酸羥化酶(proline hydroxylases,PHDs)是一類非血紅素鐵依賴性雙加氧酶,可使靶蛋白的脯氨酸發生羥基化。近年的研究表明,PHD在肌肉發育和脂肪沉積過程中發揮著重要作用,其可以通過調控血管生成、肌肉纖維化、脂質代謝等多種生理過程,從而間接影響畜禽胴體品質和肉品質。

1 PHD的結構與功能及活性調節

1.1 PHD的結構與功能

脯氨酸羥化酶(proline hydroxylases,PHDs)作為一類非血紅素鐵依賴性雙加氧酶,是缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)信號通路的重要調控因子。此外,它還可以通過多種機制調節細胞內氧適應水平、細胞凋亡、細胞代謝和細胞轉運等方面,從而參與多種生理活動的發生。現已發現4個家族成員,分別是PHD1、PHD2、PHD3和PHD4,已有的研究大多涉及PHD1、PHD2和PHD3的生理功能,對PHD4的研究報道較少[3]。這幾種亞型的氨基酸序列相似性為42%～59%,在C末端結構域具有較高的序列同源性,在N端有明顯不同[4]。因此,他們雖結構相近,但也有不同。PHD2在氨基端具有一個PHD1和PHD3都不具備的特殊催化結構——鋅指結構,這個結構在線蟲EGL-9(egg laying-9)基因中也存在。并且編碼PHD1、2、3的基因與EGL-9基因同源[5-6]。可以推測PHD2與EGL-9的同源性更高,因此,PHD2具有和EGL-9蛋白相同的羥基化HIF蛋白的功能,且在PHDs家族中該成員生理活性最高。

PHDs在動物機體內主要的生理功能為羥基化目標蛋白的脯氨酸殘基,從而影響靶蛋白的穩定性和功能。最典型的就是羥基化HIF-1α,其中活性最強的是PHD2,PHD3次之,PHD1活性最小[5]。HIF-1是由α和β亞基組成的異源二聚體,常氧條件下,PHDs以O2和α-酮戊二酸為底物,以Fe2+作為輔助因子,可以識別HIF-1α上第402位和第564位的脯氨酸殘基,使之發生羥基化,進而經希佩爾林道蛋白(von Hippel-lindau tumor suppressor protein,pVHL)介導而進行泛素化降解。在缺氧條件下,PHDs羥基化活性下降,阻礙了HIF-1α的降解,使HIF-1α穩定表達并積累,從而激活下游靶基因,開啟相應的表達調控,如圖1所示[7-9]。此外,PHDs還可以羥基化其他蛋白,例如PHD2可以羥基化UCP1的Pro-33,133,232位點,以調控脂肪產熱等。

圖1 脯氨酸羥化酶的生理功能Fig.1 Physiological function of proline hydroxylase

圖2 PHD調控骨骼肌發育和脂肪沉積的可能機制Fig.2 Possible mechanisms of PHD regulating skeletal muscle development and fat deposition

1.2 影響PHD活性的因素

研究表明,PHDs的活性受氧分壓、鐵的螯合物、抗壞血酸、α-酮戊二酸、一氧化氮(NO)、胰島素、血管緊張素等多種因素的調節[9-11]。

PHD作為細胞氧感受器,活性受到氧氣濃度的調節。有研究發現,在缺氧的條件下,PHD的活性下降,導致HIF-1α蛋白的累積,進而激活HIF信號通路,而持續激活的HIF信號通路,又會通過負反饋作用調控PHD的表達[12]。此外,NO對PHD的活性也有一定調控作用。在常氧條件下,NO通過穩定HIF來調節PHD活性[10]。

研究發現,在網織紅細胞的裂解產物中,鐵含量越少,PHD的活性就越大。鐵與PHD之間的關聯復雜,具體機制還有待進一步探究[13]。此外,一些二價金屬離子,如Co2+、Ni2+、Mn2+等,也可以抑制PHD的活性[14]。

α-酮戊二酸作為PHD發揮酶活性重要的輔助因子起著關鍵作用。α-酮戊二酸可被谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶催化,這些酶可以協調Fe2+的活性,導致底物的電子氧化,激活PHD下游基因。α-酮戊二酸的類似物,如甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalglycine,DMOG),可競爭性抑制PHD的活性[10-11,15-16]。此外,三羧酸循環的中間產物如延胡索酸、琥珀酸鹽、草酰乙酸等的積累也可以抑制PHD的活性[17]。

抗壞血酸在常氧條件下可以減少HIF-1α的積累,但在用α-酮戊二酸類似物阻斷PHD活性時其效果消失,這表明抗壞血酸與PHD活性有關[18]。

2 PHD對骨骼肌生長發育的調控作用及機制

骨骼肌是動物體的重要組成部分,在調控機體運動和代謝穩態方面起著非常重要的作用[19-20]。在畜禽生產當中,骨骼肌的發育直接決定了畜禽產品的產量及品質。動物骨骼肌的生長是一個較為復雜的生理過程,在胚胎期骨骼肌生長主要體現在肌纖維的生成和數量增加,而動物出生以后,骨骼肌的生長主要依靠肌纖維的肥大來實現[21]。動物骨骼肌的生長受到不同的內源性基因和轉錄因子的調控,此外,一些信號通路可以介導骨骼肌生長的調控,例如,Wnt信號通路[22]、PI3K-AKT信號通路[23]和HIF信號通路[24]等。

2.1 PHD對骨骼肌發育的調控

骨骼肌的發育涉及成肌細胞的增殖、分化和肌纖維的形成等。PHD各個亞型在骨骼肌以及在C2C12成肌細胞中均有表達,并且,在C2C12分化的過程中,PHD3的表達水平增加[25]。成肌細胞培養過程中,氧分壓變化可以影響成肌細胞的增殖分化能力[24],而PHD的活性受氧分壓的調控。骨骼肌的形成主要由生肌調節因子(myogenic regulatory factors,MRFs)協調,包括肌細胞生成素(myogenin,MyoG)、成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)、生肌因子5(myogenic factor 5,Myf5)和MRF4[26]。而據報道,PHD3可與這些調節因子相互作用[25],進一步證實了PHD3對骨骼肌生長的調控作用。

在PHD1敲除的小鼠中,肌肉質量減少[27]。PHD1敲除對亮氨酸的反應顯示mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1)激活受損,mTORC1是一種重要的肌肉質量調節器。PHD1促進mTORC1活性的能力與其羥基化活性無關[28],而與亮氨酰tRNA合成酶(LRS)亮氨酸傳感器蛋白含量的降低有關[29]。PHD1在機制上與LRS相互作用并穩定LRS。這種相互作用在氧和氨基酸消耗期間被促進,并保護LRS免于降解。

此外,有一些研究指出,PHD可以通過調節毛細血管的密度參與調控肌纖維的生成。例如,PHD2缺失導致骨骼肌中肌纖維的轉化,并且在I型纖維的比例增加的區域,其毛細血管密度也增加[30]。在該團隊的后續研究中,對小鼠進行為期4周的跑步訓練,發現與對照組相比,PHD2骨骼肌特異性敲除不僅增加了毛細血管的數量,骨骼肌中每個區域的肌纖維數量也有所增加[31]。

PHD還可以影響骨骼肌代謝,例如,PHD3可以通過ACC2的羥基化介導骨骼肌組織中脂肪酸的氧化,從而影響肌肉的運動能力。在高能量條件下,ACC2羥基化可以抑制脂肪酸氧化[32]。PHD3缺失的小鼠骨骼肌中ACC2羥基化缺失,從而導致脂肪酸氧化升高。AMPK在許多細胞類型的低營養條件下都很活躍,在低葡萄糖條件下ACC2磷酸化增加[33],而在ACC2中觀察到的相反的羥基化則受AMPK負調控。ACC2物理結合PHD3[34],磷酸化ACC2會降低PHD3的活性。另外,PHD3可以介導AKG調節骨骼肌蛋白轉換的過程,當PHD3過表達時,PHD3羥基化ADRB2,阻斷AKG在C2C12肌管中的抗蛋白降解作用[35]。PHD3還可以通過羥基化NF-κB信號通路關鍵因子來調節肌肉發育過程中的蛋白質轉化,從而抑制肌肉發育過程中的蛋白質合成[36]。

此外,本團隊對豬不同骨骼肌組織中PHDs、骨骼肌生長相關信號分子的表達進行檢測,豬腰大肌中PHD3表達水平遠高于背最長肌。骨骼肌生長基因的表達與PHD3水平呈負相關,而骨骼肌蛋白質降解基因的表達與PHD3水平呈正相關(數據未發表)。說明PHD3可能在豬骨骼肌生長發育中發揮重要作用,提示PHDs可能參與肉品質調控。

2.2 PHD對骨骼肌損傷和再生的調控

骨骼肌組織在肌外傷后具有很高的再生能力,機械性軟組織創傷有缺血性和炎癥性缺氧兩種,這表明HIF在肌外傷中有一定作用[37]。而PHD作為HIF通路的重要調控因子,對骨骼肌的再生可能存在一定影響。確有研究證明,PHD1和PHD3的敲除可以通過激活HIF-1α,促進骨骼肌內的血管生成,并改善缺血性的骨骼肌損傷和炎癥反應[38-39]。PHD2缺失可增強小鼠軟組織創傷后骨骼肌組織的再生[40]。

而在PHD1敲除的小鼠中,PHD1氧傳感器的丟失會減少肌肉質量[27]。此外,干擾PHD1或PHD3活性的小鼠表現出腓腸肌纖維化程度降低,并緩解缺血損傷后的肌肉質量損失[39]。類似的,肌肉注射紅景天苷來抑制PHD3的轉錄活性,可激活骨骼肌細胞的旁分泌信號,進而激活骨骼肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞之間的通訊,促進內皮細胞和平滑肌細胞的活性[38]。

肥胖會導致肌肉質量下降和肌肉再生受損,據研究顯示,在肥胖狀態下病理性增加的PHD2會導致肌肉再生受損,同時觀察到血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達水平顯著下降,而在肥胖狀態下抑制PHD2活性可使肌肉恢復再生潛力[41]。

綜上所述,PHD缺失可以促進成肌細胞增殖分化、肌纖維類型轉化、肌纖維數量增加以及骨骼肌再生等,對骨骼肌生長發育起著重要調控作用。

3 PHD對脂肪沉積的調控作用及機制

脂肪組織是機體內重要的能量存儲、內分泌以及代謝器官,對于維持機體能量穩態和產熱供能具有重要作用。動物體內脂肪的沉積主要靠脂肪細胞數量增加、脂肪細胞肥大兩種途徑[42-43]。

3.1 PHD對脂肪生成與代謝的調控

PHDs可能是脂肪細胞的成脂分化以及脂肪代謝過程中重要的調控因子。

在對脂肪細胞的研究中發現,在誘導3T3-L1前脂肪細胞成脂分化過程中,PHD的3個亞型均有表達。PHD1在脂肪生成早期表達,PHD2和PHD3則在脂肪生成晚期表達[44]。在脂肪生成的初始階段,抑制PHD的活性,會降低PHD的基因表達,進而阻斷脂肪細胞的形成[44]。還有研究探索了PHD在羅格列酮誘導的脂肪細胞分化期間所起的作用,發現在脂肪細胞分化期間,3種PHD亞型在脂肪細胞中表達上調,而抑制PHD可使抗脂肪生成蛋白如GATA-3、KLF-2的水平增加[45]。以上結果說明,PHD可能參與調控脂肪的生成。

在活體上,有研究表明,不論是在普通日糧還是在高脂日糧飼喂的條件下,PHD2敲除的小鼠與野生型小鼠相比,脂肪組織減少,脂肪細胞也相對更小。PHD2敲除小鼠白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)中脂解標記物Lipe和Pnpla2的mRNA水平增加[46]。此外,PHD抑制劑也可導致肥胖癥小鼠WAT的質量顯著降低,脂肪細胞大小減少,同時伴隨著血漿脂聯素的恢復以及脂質代謝的改善[47]。脂聯素是脂肪細胞分泌的一種具有生物活性的蛋白質,其表達水平與胰島素抵抗、肥胖和2型糖尿病呈負相關。有報道顯示,PHD是脂聯素產生和多聚化所必需的[48]。另外,PHD3缺失會激活促炎IKKβ/NF-κB信號通路,而減輕脂肪組織炎癥可以介導脂質代謝的改善[47]。PHD3通過阻斷IKKβ的磷酸化來抑制NF-κB信號,而這些磷酸化不依賴于羥基化。

此外,PHD可影響肝的脂肪沉積。缺氧影響肝脂質代謝并擾亂肝脂質積累,缺氧信號傳導也是脂肪組織功能障礙的關鍵,會導致脂肪組織纖維化、炎癥和胰島素抵抗。而PHD作為主要的細胞氧傳感器,自然也是關鍵調節因子[49]。PHD1敲除小鼠在正常飼喂條件下肝的重量降低,肝組織脂肪變性和炎癥增加[50]。在PHD2或PHD3敲除的小鼠肝中,脂肪酸合成以及脂肪生成減少[46,51-52]。

本團隊對豬不同脂肪組織中PHDs、脂肪沉積相關信號分子的表達進行檢測,發現PHD2在豬不同脂肪組織中的表達存在差異,且與脂質合成相關基因的表達呈正相關(數據未發表)。說明PHD2可能在豬脂肪沉積中發揮重要作用。

3.2 PHD對脂肪產熱的調控

目前,激活褐色脂肪產熱被認為是減少肥胖的一種思路,通過激活脂肪產熱來減少脂肪的沉積。褐色脂肪組織是哺乳動物體內非顫栗產熱的主要來源,對于維持動物的體溫和能量平衡起重要作用。解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)作為褐色脂肪產熱的標志性蛋白,通過將氧化磷酸化與ATP合成解偶聯,把底物氧化產生的能量轉化為熱能,以此促進棕色脂肪產熱[53]。

而有研究表明,PHD2在褐色脂肪組織中的表達明顯高于在白色脂肪組織中的表達,并且小鼠全身脂肪PHD2選擇性敲除,通過激活HIF信號通路激活了小鼠的褐色脂肪并增加能量消耗[54]。不同的是,在本實驗室的研究中,在活體小鼠褐色脂肪上特異性敲除PHD2,顯著抑制了褐色脂肪的產熱過程,發現PHD2可以直接與線粒體產熱蛋白UCP1結合,通過促進UCP1蛋白的羥基化修飾,增加UCP1蛋白穩定性和表達,并協同AMPK信號通路促進褐色脂肪產熱,以減少脂肪沉積[55]。然而,PHD對脂肪沉積的調控機制復雜多樣,更多的調控路徑仍有待進一步研究。

綜上所述,抑制PHD可減少動物體脂肪沉積、脂肪酸攝取及脂肪變性等,PHD還可以參與褐色脂肪組織的產熱,這為PHD作為營養調控靶點改善畜禽產品品質提供了科學依據。

4 小 結

本文在介紹PHD生理功能的基礎上,闡述了其在骨骼肌發育及脂肪沉積方面的調控作用及可能機制,為生產上提高畜禽產品的產量以及品質提供了新的靶點。此外,PHD抑制劑也有望在畜禽生產中起到作用。目前的PHD抑制劑大多是廣泛的抑制,但PHD家族各個成員的作用都有不同,其具體機制并不十分明確,有待進一步研究。因此,尋找PHD亞型特異性的抑制劑,或能為將來應用于生產開辟新的道路。