中國荷斯坦公牛不同耐凍性精子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

曹晉康,張 純,王佳瑤,李曉彤,王鵬宇,方穎妍,張 昱,丁 寧,姜 力

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100193)

公牛精液品質(zhì)是綜合反映精子授精能力和公牛繁殖力的重要指標(biāo)。隨著精液冷凍保存技術(shù)和人工授精技術(shù)的發(fā)展和普及,公牛冷凍精液質(zhì)量的提高備受關(guān)注。凍精解凍后的精子活力對(duì)母牛的受孕率和奶牛生產(chǎn)系統(tǒng)有著重要的經(jīng)濟(jì)影響。精子冷凍保存是一個(gè)持續(xù)的過程,包括降低溫度、細(xì)胞脫水、冷凍和儲(chǔ)存。這個(gè)過程中精子細(xì)胞會(huì)受到生理損傷,如膜結(jié)構(gòu)和精子代謝的改變,導(dǎo)致解凍后的精子活力和生育能力明顯下降[1]。

目前,我國荷斯坦公牛凍精活力與國外一些奶業(yè)發(fā)達(dá)國家存在明顯的差距,亟待進(jìn)一步提高。趙俊金等[2]對(duì)全國39個(gè)牛冷凍精液生產(chǎn)企業(yè)的冷凍精液樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示我國各品種公牛的凍精解凍后平均活力僅為40.9%,其中743份奶牛冷凍精液解凍后的平均精子活力為41%。然而,歐共體等國家牛冷凍精液的凍后活力最低要求已經(jīng)達(dá)到50%以上[3-4]。Kaminski等[5]的研究顯示,波蘭某一人工授精站統(tǒng)一環(huán)境條件下飼養(yǎng)的120頭荷斯坦公牛凍精解凍后的精子活力平均值為62.51%。Hitit等[6]對(duì)加拿大Alta Genetics公司2008年至2016年間8年的公牛凍精解凍后精子活力進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示荷斯坦公牛群體凍精的解凍后精子活力平均值為(57.9±6.5)%,其中耐凍性好的公牛精子凍后活力平均值為63.83%,而耐凍性差的公牛精子凍后活力平均值也達(dá)到52.10%。

近年來研究人員發(fā)現(xiàn),即便在相同的冷凍程序下,不同公牛的精液受到冷應(yīng)激后所產(chǎn)生的變化也不相同,一部分種公牛雖然鮮精活力良好,但凍后精子活力大幅下降。Druet等[7]對(duì)法國10個(gè)荷斯坦公牛家系的515頭公牛解凍后精子活力進(jìn)行遺傳力估計(jì),結(jié)果顯示該性狀的遺傳力為0.21,屬于中等遺傳力性狀。這表明遺傳因素對(duì)公牛凍精解凍后的精子活力具有重要影響。公牛精液凍后活力在個(gè)體間所表現(xiàn)的差異,顯然一部分是由于遺傳基礎(chǔ)不同造成的。目前,對(duì)于精液冷凍的研究主要是圍繞低溫保護(hù)劑、添加劑和冷凍方法,而從遺傳角度挖掘影響公牛精子耐凍性關(guān)鍵基因的研究仍非常有限。

隨著近年來組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,越來越多的研究利用組學(xué)技術(shù)從不同水平分析具有不同耐凍性公牛精子的遺傳差異[8-11]。由于精液中含有多種代謝物,代謝組也被用于精子耐凍性方面的研究。Evans等[12]檢測(cè)了12頭高、低耐凍性荷斯坦公牛精子的脂肪酸組成,發(fā)現(xiàn)這些脂肪酸組成在兩組間存在極顯著差異(P<0.001),并且發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的脂肪酸在膜功能、細(xì)胞氧化應(yīng)激以及解凍后精子的生存能力等方面具有重要的作用。很早以前就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)精子經(jīng)冷凍-解凍過程會(huì)發(fā)生膜蛋白分離或缺失的現(xiàn)象[13],因此蛋白質(zhì)組學(xué)研究是揭示精子耐凍性機(jī)制的一條重要途徑。目前已被報(bào)道的與精子耐凍性有關(guān)的蛋白家族主要包括HSP家族蛋白、BSP家族蛋白和AQP家族蛋白[14-16]。本研究以中國荷斯坦公牛精液為研究對(duì)象,選擇精子耐凍性表型兩尾極端個(gè)體的精子細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,通過檢測(cè)差異表達(dá)蛋白并結(jié)合生物信息學(xué)分析,篩選與精子耐凍性相關(guān)的重要功能基因。研究結(jié)果不僅為揭示公牛精子耐凍性分子基礎(chǔ)提供理論依據(jù),同時(shí)為將來有效開展種公牛精子耐凍性性狀的分子育種提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究試驗(yàn)公牛來自山東奧克斯公牛站,所有公牛在同一環(huán)境條件下進(jìn)行飼養(yǎng)管理,健康狀況良好。按照鮮精精子活力和凍后活力多次表型記錄對(duì)所有荷斯坦公牛進(jìn)行篩選,最終得到高精子耐凍組(high freezability, HF)的9頭荷斯坦公牛(鮮精活力> 0.65,凍后活力> 0.40)和低精子耐凍組(low freezability, LF)的6頭荷斯坦公牛(鮮精活力> 0.65,凍后活力≤ 0.27)用于后續(xù)蛋白質(zhì)組研究(圖1)。

1.2 精液的采集與檢測(cè)

采用假陰道法采集15頭公牛新鮮精液,取到鮮精后使用19 ℃恒溫冰箱轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室,使用PBS稀釋后,取10 μL的精液滴在載玻片上,利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)檢測(cè)精子活力等各項(xiàng)參數(shù)。每頭公牛精液的凍后精子活力為該個(gè)體采樣前20次記錄在冊(cè)的凍精解凍后精子活力的均值。

1.3 總蛋白的提取

分別將采集的15頭公牛的精子樣品中加入裂解液大約400 μL(7 mol·L-1尿素,2 mol·L-1硫脲,0.1% PMSF蛋白酶抑制劑,65 mmol·L-1DTT),然后在冰浴條件下進(jìn)行超聲(70 W,5 s開,10 s關(guān),3～5次)處理,隨后在冰上放置40 min。將上述溶液14 000×g離心30 min后,收集上清。提取的總蛋白濃度采用Bradford assay (Beyotime, Shanghai, China)測(cè)定。

1.4 蛋白質(zhì)組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 采用Label-free技術(shù)對(duì)精子的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析。通過酶解和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè),獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜庫。本試驗(yàn)使用牛Uniprot蛋白序列庫作為數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/proteomes?query=Bos+taurus)進(jìn)行搜索。測(cè)序產(chǎn)生的原始文件采用Maxquant(1.5.2.8)軟件分析,導(dǎo)入質(zhì)譜原始文件及數(shù)據(jù)庫文件,肽段質(zhì)控FDR設(shè)為1%,特異性肽段設(shè)為1,最小肽段長(zhǎng)度設(shè)為7,其他參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。

1.4.2 差異表達(dá)蛋白分析 對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行quantile歸一化處理,分別保留在兩組中都有表達(dá)的蛋白(HF組中重復(fù)鑒定次數(shù)大于4,LF組中重復(fù)鑒定次數(shù)大于3),用最小值填補(bǔ)缺失值,使用在線網(wǎng)站 (https://www.omicstudio.cn/tool/13) 進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA),然后采用R程序limma包進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選,以差異倍數(shù)|log2FC|>1以及P<0.05為顯著性閾值;只在HF組或LF組中鑒定到的蛋白視為特異性表達(dá)蛋白,將鑒定到的顯著差異表達(dá)蛋白和特異性表達(dá)蛋白統(tǒng)稱為差異表達(dá)蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)。

1.4.3 基因的富集分析及蛋白互作分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)DEPs進(jìn)行GO和KEGG富集分析,以P<0.05為閾值,鑒定DEPs顯著富集的GO條目和KEGG通路。利用STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)進(jìn)行DEPs的互作網(wǎng)絡(luò)分析。利用Cytoscape軟件構(gòu)建互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖,使用Cytohubba插件中的Maximal Clique Centrality (MCC)方法給每個(gè)蛋白進(jìn)行賦值評(píng)分,篩選評(píng)分前10的蛋白構(gòu)建重要蛋白互作網(wǎng)絡(luò);使用MCODE插件的默認(rèn)參數(shù)篩選網(wǎng)絡(luò)得分最高的子網(wǎng)絡(luò)。

1.4.4 QTL數(shù)據(jù)庫比對(duì) 首先,搜索動(dòng)物QTLs數(shù)據(jù)庫中(https://www.animalgenome.org/,下載日期:2023年12月2日)與牛解凍后活精子百分比性狀相關(guān)的QTLs,對(duì)其進(jìn)行基因注釋。其次,將檢測(cè)到的差異表達(dá)蛋白與QTL區(qū)域內(nèi)的關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行比對(duì),進(jìn)一步篩選與精子耐凍性相關(guān)的重要候選功能基因。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

公牛凍前和凍后精子活力表型統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS Statistics軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為存在顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)公牛精子耐凍性差異分析

對(duì)HF組和LF組公牛的精子活力表型進(jìn)行分析,結(jié)果顯示HF組鮮精的平均精子活力為70%,LF組鮮精平均精子活力為68%,兩組精液凍前活力沒有顯著差異。然而,HF組凍精解凍后的平均精子活力為43%,顯著高于LF組(22%),表明HF組和LF組的凍后精子活力存在顯著差異(P<0.01,圖1)。

2.2 精子蛋白質(zhì)的鑒定與分析

蛋白質(zhì)組測(cè)序結(jié)果顯示,在所有樣品中共檢測(cè)到36 151個(gè)肽段,質(zhì)控過濾后最終鑒定到1 944個(gè)蛋白,其中HF組鑒定到1 823個(gè)蛋白質(zhì),LF組鑒定到1 756個(gè)蛋白(圖2A),兩組都鑒定到的蛋白共1 635個(gè)。利用HF和LF組精子蛋白質(zhì)表達(dá)量信息進(jìn)行主成分分析,結(jié)果顯示,HF組樣品和LF組樣品明顯分為兩簇(圖2B),表明蛋白質(zhì)豐度在兩組之間存在較大差異。在HF和LF組同時(shí)鑒定到的1 635個(gè)蛋白質(zhì)中,共檢測(cè)到123個(gè)顯著的組間差異表達(dá)蛋白(|log2FC|≥1,P≤0.05)。與LF組相比,HF組有73個(gè)差異表達(dá)蛋白顯著上調(diào),50個(gè)差異表達(dá)蛋白顯著下調(diào)(圖2C,D)。表1顯示了差異倍數(shù)最高的前10個(gè)蛋白的信息。此外,在HF組和LF組分別鑒定到了只在單一組中表達(dá)的188和121種特異表達(dá)蛋白(圖2D)。在本研究中,將顯著差異表達(dá)蛋白和特異表達(dá)蛋白均定義為差異表達(dá)蛋白(differentially expressed proteins, DEPs),因此共鑒定到432個(gè)差異表達(dá)蛋白。

表1 高耐凍組前10個(gè)上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)蛋白

A. HF組和LF組精子中鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量;B. PCA分析結(jié)果顯示HF和LF組公牛明顯分為兩簇;C. 差異蛋白火山圖(紅色圓點(diǎn)代表HF組上調(diào)蛋白,藍(lán)色圓點(diǎn)代表LF組下調(diào)蛋白);D. 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果(紅色柱子代表HF組上調(diào)表達(dá)蛋白;紫色柱子代表HF組下調(diào)表達(dá)蛋白;橙色柱子代表HF組特異表達(dá)蛋白;藍(lán)綠色代表LF組特異表達(dá)蛋白)A. The number of proteins identified in the sperm of the HF and LF groups; B. PCA result showed a distinct separation between the HF and LF bulls; C. Volcano plot of differential proteins (Red dots represent up-regulated proteins in the HF group, and blue dots represent down-regulated proteins in the HF group);D. The result of differentially expressed proteins identification (Red bar represents up-regulated proteins in the HF group, purple bar represents down-regulated proteins in the HF group, orange bar represents special expression proteins in the HF group, and turquoise bar represents special expression proteins in the LF group)

2.3 差異表達(dá)蛋白功能富集分析

對(duì)DEPs進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果顯示在生物過程(biological progress, BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)以及分子功能(molecular function,MF)3個(gè)方面顯著富集到147個(gè)GO條目,BP和MF分類中P值最顯著的前10個(gè)條目如表2所示。在生物過程方面,主要富集到“抗原加工和內(nèi)源性肽抗原通過MHC Ib類遞呈”、“抗原加工與遞呈”、“嘌呤核苷酸生物合成過程”和“精子與透明帶結(jié)合”等生物學(xué)過程;在細(xì)胞成分方面,主要富集到“胞質(zhì)”、“細(xì)胞質(zhì)”、“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)”等;在分子功能方面,主要富集“蛋白結(jié)合”、“ATP結(jié)合”、“特異性同型蛋白質(zhì)結(jié)合”等。

表2 GO富集分析BP、MF各前10顯著的GO條目

對(duì)DEPs進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果顯示36條通路顯著富集,最為顯著的前3條通路分別是“內(nèi)吞作用”、“吞噬體”、“代謝途徑”通路(表3)。這3條通路共包含了85個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中ATP6AP1同時(shí)富集到“吞噬體”和“代謝通路”兩條通路中,RAB7A、BoLA、RAB5C同時(shí)富集到“內(nèi)吞作用”以及“代謝通路”兩條通路中。ACSL4除了富集到“代謝通路”中以外,還富集到“線粒體”的細(xì)胞成分GO條目中以及“花生四烯酮-輔酶a連接酶活性”的分子功能GO條目中。

表3 KEGG 富集分析前10顯著的通路

2.4 差異表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING網(wǎng)站對(duì)DEPs進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析,并使用Cytoscape中的Cytohubba插件計(jì)算出評(píng)分前10的具有強(qiáng)互作關(guān)系的蛋白,分別是NDUFS6、ND1、ND5、ATP5F1A、ACTB、HSPA1A、ANXA5、LAMP1、APP、CANX,其中6個(gè)蛋白在HF組表達(dá)顯著上調(diào),4個(gè)蛋白在LF組表達(dá)顯著上調(diào)(圖3A)。此外,研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)重要的子網(wǎng)絡(luò)(圖3B),包含24個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中17個(gè)蛋白在HF組顯著上調(diào),7個(gè)蛋白在HF組顯著下調(diào)。值得注意的是,該網(wǎng)絡(luò)中的蛋白顯著富集于“線粒體呼吸鏈復(fù)合體I”、“ATP酶激活劑活性”、“線粒體電子傳遞-NADH到泛醌”、“氧化磷酸化”等,表明這些蛋白與精子能量供應(yīng)存在密切關(guān)系。

A. DEPs 中前10個(gè)具有強(qiáng)相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò);B. PPI 網(wǎng)絡(luò)中的評(píng)分最高的子網(wǎng)絡(luò)(藍(lán)色圓圈代表HF組下調(diào)蛋白,橙色圓圈代表HF組上調(diào)蛋白,圓圈大小代表連接節(jié)點(diǎn)的多少)A. Top 10 DEPs with strong interaction relationships; B. The sub network with the highest score in the PPI network (The blue circles represent down-regulated proteins in the HF group, the orange circles represent up-regulated proteins in the HF group, and the size of the circle represents the number of connected nodes)

2.5 QTL數(shù)據(jù)庫比對(duì)

在QTLdb數(shù)據(jù)庫(https://www.animalgenome.org/)中檢索與牛解凍后活精子百分比有關(guān)的QTLs,共涉及519個(gè)功能基因。通過與差異表達(dá)蛋白結(jié)果比對(duì),鑒定到9個(gè)與精子抗凍性相關(guān)的重要候選基因,分別是CRISP3、TUBB、ABHD16A、CRISP1、HSPA1A、ADAM3A、VWA7、ENPP4和LY6G5C。其中CRISP3、TUBB、ABHD16A在HF組中顯著上調(diào)表達(dá),CRISP1、HSPA1A、ADAM3A、VWA7、ENPP4、LY6G5C在HF組中顯著下調(diào)表達(dá)。其中HSPA1A不僅富集于最顯著的“內(nèi)吞體通路”中,同時(shí)還富集到“ATP結(jié)合”的分子功能GO條目。此外,CRISP1和ADAM3A顯著富集到“精子和透明帶結(jié)合”的生物過程GO條目。

3 討 論

隨著對(duì)優(yōu)良種公牛凍精的需求越來越多,公畜的精液品質(zhì)備受關(guān)注。有研究顯示遺傳基礎(chǔ)是導(dǎo)致精子耐凍性差異的重要因素之一[7]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者,其表達(dá)差異能夠?qū)拥哪蛢鲂援a(chǎn)生最直接影響。本研究對(duì)不同耐凍性的公牛精子細(xì)胞進(jìn)行全蛋白質(zhì)組測(cè)序和分析,結(jié)果共檢測(cè)到1 944種蛋白質(zhì),其中432個(gè)為差異表達(dá)蛋白。相較于LF組,HF組有261個(gè)DEPs表達(dá)上調(diào),171個(gè)DEPs表達(dá)下調(diào)。

目前對(duì)牛精子耐凍性生物標(biāo)記物的研究集中于精子和精漿的蛋白質(zhì)組學(xué)[14-16]、代謝組學(xué)[17]和脂質(zhì)組學(xué)[12]。一些與精子耐凍性相關(guān)的重要蛋白已被報(bào)道,如HSP90、BSPs和AQPs[14-16]。HSP家族蛋白是生物機(jī)體或細(xì)胞受到突然應(yīng)激而產(chǎn)生的一系列維持生命體正常生理功能且高度保守的蛋白,對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[18]。據(jù)報(bào)道,熱休克蛋白90(HSP90)的表達(dá)與公牛精子的耐凍性呈正相關(guān)[19]。Spinaci等[20]發(fā)現(xiàn),精子遭受應(yīng)激時(shí),HSPA1A蛋白的細(xì)胞分布會(huì)發(fā)生變化。此外,有研究顯示精子中HSPA1A的含量與精子氧化還原狀態(tài)之間呈正相關(guān)關(guān)系[21]。本研究發(fā)現(xiàn),HSPA1A在LF組中呈現(xiàn)高表達(dá),并且富集于“ATP結(jié)合”等重要GO條目中,暗示HSPA1A在牛精子凍融過程中遭受到應(yīng)激時(shí)可能發(fā)揮重要功能,進(jìn)而影響精子的耐凍性。

BSP家族蛋白是由精囊分泌的大量存在于牛精漿中的蛋白家族,包括BSP-A1/BSP-A2(BSP1)、BSP-A3(BSP3)、BSP-30kD(BSP5)幾種亞型[22],占精漿總蛋白質(zhì)的50%～65%[23]。其中,BSP1是BSP-A1和BSP-A2蛋白的混合物,其在公牛精子冷凍保存過程中的作用已經(jīng)被廣泛研究[15]。BSP蛋白通過部分插入精子質(zhì)膜覆蓋在精子表面[24],與精子膜上的膽堿磷脂結(jié)合[25-26],在膜穩(wěn)定和失穩(wěn)過程中發(fā)揮作用,還可與獲能因子結(jié)合促進(jìn)精子獲能。BSP蛋白可通過刺激膽固醇和磷脂外流引起精子質(zhì)膜的改變[25-26],因此精子過度暴露于BSP中對(duì)精子質(zhì)膜有害。Ardon和Suarez[24]發(fā)現(xiàn),3種BSP蛋白(BSP1、BSP3、BSP5)在冷凍解凍后牛精子中的含量均高于新鮮精子。隨后,Magalh?es等[27]發(fā)現(xiàn)BSP1蛋白在精子抗凍性好的公牛精液中表達(dá)量低,而在精子抗凍性差的公牛精液中表達(dá)量高。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致,BSP3蛋白在LF組中顯著高表達(dá)(log2FC=-1.72,P=0.003),推測(cè)BSP3高表達(dá)會(huì)降低精子的耐凍性。

本研究發(fā)現(xiàn),大量與代謝通路和能量有關(guān)的蛋白在HF和LF組間顯著差異表達(dá),如ACTR2、STK24、DNAJA2、ATP1A1等。在精子中,ATP是維持精子活力和精子獲能所必須的能量來源。DGKA、ATP5F1A、ATP11C、HSPA1A等差異表達(dá)蛋白富集在“ATP結(jié)合”的GO條目。近年來有研究表明,脂肪酸代謝受阻也會(huì)顯著影響精子活力以及獲能[28]。同時(shí)有研究顯示水牛精子的耐凍性與脂質(zhì)代謝有關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn),部分差異表達(dá)蛋白顯著富集于代謝通路,其中4個(gè)蛋白(ACSL4、ACSL5、HACD3、TECR)顯著富集于脂肪酸代謝通路。ACSL家族作為脂質(zhì)代謝中間體,促進(jìn)脂肪酸代謝和膜修飾。目前已在人類和嚙齒動(dòng)物中鑒定出5種ACSL亞型(ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6),它們?cè)谥舅岽x中具有不同的功能[30]。本研究發(fā)現(xiàn),ACSL4和ACSL5在HF組中顯著上調(diào)表達(dá),暗示ACSL4和ACSL5可能通過調(diào)節(jié)促進(jìn)脂肪酸代謝,幫助精子在凍融過程中生存。

此外,本研究在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)6個(gè)DEPs (ATP5F1A、NDUFA5、NDUFS6、COX3、ND1、ND5)在氧化磷酸化通路顯著富集,并且存在互作關(guān)系。其中NDUFA5、NDUFS6是NADH脫氫酶的組成成分[31],本研究結(jié)果顯示NDUFA5、NDUFS6在LF組中高表達(dá),這兩個(gè)蛋白的高表達(dá)可能促進(jìn)ATP的過量產(chǎn)生,使精子在凍融過程中提前獲能,進(jìn)而導(dǎo)致精子死亡。有研究顯示,將雄鹿添加抗氧化劑的冷凍精液復(fù)蘇后比未添加抗氧化劑的復(fù)蘇后精子活力高,并且ATP5F1A表達(dá)量有顯著上升[32]。本研究結(jié)果顯示,ACTB蛋白是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的蛋白,并且與HSPA1A蛋白存在直接或間接的互作關(guān)系。有研究顯示,ACTB在細(xì)胞中主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞體積,并構(gòu)建精子細(xì)胞的細(xì)胞骨架[33],它定位于精子的鞭毛膜和頂體膜,其在精子運(yùn)動(dòng)和獲能中發(fā)揮作用[34-36],除此以外,ACTB與TBC1D21互作可以調(diào)節(jié)精子中部的結(jié)構(gòu)[37]。本研究中,ACTB蛋白的表達(dá)在LF組顯著上調(diào),表明ACTB蛋白可能對(duì)精子的耐凍性具有不利的作用。

通過與QTL數(shù)據(jù)庫收錄的QTL定位結(jié)果比對(duì),發(fā)現(xiàn)了9個(gè)與精子耐凍性相關(guān)的重要候選基因。其中CRISPR3蛋白在HF組顯著上調(diào)表達(dá),而CRISPR1蛋白在LF組顯著上調(diào)表達(dá)。已有研究顯示CRISPR3可以與精子頂體膜相結(jié)合[38]。CRISPR1具有離子通路調(diào)節(jié)活性[39-40],可能會(huì)影響精子在獲能過程中攝取離子[41],同時(shí)該蛋白參與精子與卵子的透明帶結(jié)合[42-43]。研究發(fā)現(xiàn),CRISPR3和CRISPR1蛋白在附睪精子成熟過程中被包裹在精子表面或插入質(zhì)膜中[39,44],暗示這些蛋白可能通過與精子的頂體膜結(jié)合調(diào)節(jié)精子的凍后活力。

4 結(jié) 論

綜上所述,本研究使用Label-free技術(shù)對(duì)中國荷斯坦公牛不同耐凍性精子進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,篩選和挖掘與公牛精子耐凍性相關(guān)的重要功能基因。通過蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)分析,共鑒定到432個(gè)DEPs,其中9個(gè)DEPs同時(shí)位于牛解凍后活精子百分比相關(guān)的QTLs內(nèi)。生物信息學(xué)分析顯示這些DEPs主要集中在代謝通路和氧化磷酸化通路。本研究揭示了中國荷斯坦公牛不同耐凍性精子的蛋白質(zhì)組成特征和差異,并挖掘了HSPA1A、BSP3、ACSL4等重要候選蛋白可作為預(yù)測(cè)精子耐凍性的標(biāo)志物,為深入理解公牛精子耐凍性分子機(jī)制提供理論依據(jù)。