定海灣龜足腸道微生物組成及代謝組分析

摘 要：為了解定海灣龜足腸道微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及代謝組特征，探索龜足生存環(huán)境、食性及腸道微生物組成之間的聯(lián)系，使用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)和非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)采集的龜足樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明：龜足腸道菌群在門(mén)水平上，最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，含量為47.17%， 其次為擬桿菌門(mén)， 含量為40.61%； 在綱水平上， 最優(yōu)勢(shì)綱為擬桿菌綱， 含量為40.59%，其次為γ 變形菌綱，含量為32.62%；在屬水平上，最優(yōu)勢(shì)屬為Sediminibacterium，含量為22.77%，其次為Pseudarcicella，含量為10.97%，還存在較多未能培養(yǎng)和未能鑒定的菌屬。龜足腸道代謝物中含量最多的為脂類(lèi)及類(lèi)脂物質(zhì)，約占代謝物總量的31%，其次為有機(jī)酸及其衍生物，約占代謝物總含量的23%。

關(guān)鍵詞：定海灣；龜足；腸道微生物；代謝組

中圖分類(lèi)號(hào)：S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253?2301（2024）11?0009?09

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.11.002

龜足Capitulum mitella（ Linnaeus，1 758）， 俗稱(chēng)佛手、觀音掌、龜腳等，因形似龜腳而得名，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、顎足綱、鞘甲亞綱、蔓足下綱、圍胸總目、有柄目、指茗荷科、龜足屬，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江口以南沿海的礁石縫隙。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)龜足均有一定的研究，國(guó)內(nèi)主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育[1?9]、地理分布[10]、人工培育[11?12] 、食性和營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化[13?14]等方面；國(guó)外相關(guān)研究較少，主要對(duì)龜足性腺發(fā)育及基因多樣性[15?16]進(jìn)行了探究，但關(guān)于龜足腸道微生物組成及代謝組分析的研究還未見(jiàn)報(bào)道。目前龜足作為有柄類(lèi)的代表，與無(wú)柄類(lèi)藤壺相比污損性較小，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，含有豐富的氨基酸、多不飽和脂肪酸及礦物元素，具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13， 17]。因龜足野外資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)，當(dāng)前已不能滿(mǎn)足市場(chǎng)供應(yīng)需求，使用高通量測(cè)序技術(shù)及非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)龜足腸道微生物進(jìn)行分析可以更好了解環(huán)境和餌料對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，加速推進(jìn)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化人工養(yǎng)殖。

腸道微生物在宿主體內(nèi)發(fā)揮重要作用，通過(guò)對(duì)復(fù)雜腸道微生物的組成、功能分析，可以解釋宿主食性和腸道微生物之間的相互關(guān)系。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于16S rRNA 的高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)ξ⑸锶郝涞姆N類(lèi)及數(shù)量進(jìn)行精確分析，逐漸成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)手段，并已廣泛應(yīng)用于腸道微生物方面的研究[18?21]。對(duì)龜足腸道微生物進(jìn)行相關(guān)分析可以更全面解析腸道細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及其種類(lèi)。代謝組學(xué)是一門(mén)利用高通量、高靈敏度和高分辨率的現(xiàn)代分析儀器，對(duì)細(xì)胞、體液或組織中所有代謝物進(jìn)行無(wú)偏向的定性和定量分析的學(xué)科[22]。非靶向代謝組學(xué)分析（如LC-MS）具有諸多優(yōu)勢(shì)，包括對(duì)樣品制備的要求較低、靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍廣，以及能夠檢測(cè)濃度差異較大的代謝物，因此在代謝組學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)龜足腸道樣品進(jìn)行分析，可以了解其代謝組特征。本研究使用上述兩項(xiàng)技術(shù)對(duì)野生龜足的腸道微生物群落組成和代謝組特征進(jìn)行了分析，綜合二者分析結(jié)果可以進(jìn)一步改善龜足配合飼料的營(yíng)養(yǎng)成分并優(yōu)化其飼料配方，為龜足營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)，也為龜足的人工繁育和養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 龜足樣品采集與處理

本試驗(yàn)所用龜足樣品取自福州連江定海村青嶼潮間帶（ 119.810 E， 26.259 N）， 取樣時(shí)間為2022 年7 月，選取發(fā)育良好、健壯的成體龜足，低溫保存當(dāng)日帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)樣品處理。龜足形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)如下：峰吻徑22.53±2.84 mm、頭狀部長(zhǎng)18.37±1.54 mm、全長(zhǎng)31.17±3.08 mm、體重3.41±0.69 g。

將龜足置于滅菌解剖盤(pán)中，用無(wú)菌棉球蘸取75% 酒精擦拭龜足體表，再用無(wú)菌海水沖洗，之后用滅菌手術(shù)剪剪開(kāi)龜足柄部、頭狀部，取出“U”型腸道，修去腸道表面多余的脂肪組織和其他物質(zhì)，最后用無(wú)菌PBS 沖洗干凈后裝于2 mL 離心管。將收集好的樣品全部混勻后均分到9 個(gè)離心管中，取其中3 管分別標(biāo)記為Y1、Y2、Y3，用于腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析，剩余6 管分別標(biāo)記為DX1-DX6，用于腸道代謝組分析。全部樣品液氮速凍后置于?80℃ 冰箱冷凍保存。

1.2 龜足腸道微生物組成樣品提取與處理

1.2.1 龜足腸道樣品總DNA 的提取、擴(kuò)增與檢驗(yàn)

使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生物）對(duì)龜足腸道樣品基因組DNA 進(jìn)行提取，提取后使用Nanodrop 微量分光光度計(jì)對(duì)樣品濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。用所提取的基因組DNA 為模板，將16S rRNA 的V3～V4 區(qū)作為擴(kuò)增目的條帶，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為樣品DNA 30 ng、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、3 μL BSA、12.5 μL2×Taq Plus Master Mix、7.5 μL ddH2O。擴(kuò)增條件為94℃ 5min； 94℃ 30 s， 50℃ 30 s， 72℃ 60 s，循環(huán)數(shù)30；72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，并用Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒純化。所使用的16S rRNA V3～V4 區(qū)引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 龜足腸道樣品高通量測(cè)序

擴(kuò)增純化后的DNA 樣品送由北京奧維森（allwegene）基因科技有有限公司進(jìn)行測(cè)序，設(shè)置3 個(gè)平行重復(fù)，進(jìn)行Miseq 文庫(kù)構(gòu)建及Miseq 上機(jī)測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控及OTU 基礎(chǔ)分析

操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)等研究中，為便于分析而人為設(shè)定的標(biāo)識(shí)，用于了解樣品測(cè)序結(jié)果中的細(xì)菌種類(lèi)及其分類(lèi)信息。當(dāng)測(cè)序序列相似度達(dá)到97% 以上時(shí)， 將其歸入同一OTU 進(jìn)行后續(xù)分析。使用Qiime（版本1.8.0）和Vsearch（版本2.7.1）平臺(tái)及軟件，通過(guò)聚類(lèi)或降噪方式生成OTUs。聚類(lèi)方法可選擇uparse [23]、uclust [24]、cdhit [25]或ref 參照數(shù)據(jù)庫(kù)等方法，降噪法可選擇unoise3 [26]。默認(rèn)情況下，使用uparse 聚類(lèi)法。

原始數(shù)據(jù)在測(cè)序完成后以Fastq 格式保存，通過(guò)Miseq 測(cè)序獲得雙端序列（Pair-End，PE）數(shù)據(jù)。對(duì)獲取的Fastq 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制處理，最終得到高質(zhì)量的Fasta 數(shù)據(jù)。具體步驟如下：（1）使用Trimmomatic（版本0.36）和Pear（版本0.9.6）對(duì)Fastq（版本1.20）數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。Trimmomatic 采用滑動(dòng)窗口法，設(shè)置窗口大小為50 bp，平均質(zhì)量值設(shè)為20，最低保留序列長(zhǎng)度為120 bp，具有“N”的序列則使用Pear 進(jìn)行去除，以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量與分析的準(zhǔn)確性；（2）使用Flash 和Pear 程序依據(jù)雙端序列的重疊關(guān)系進(jìn)行拼接，設(shè)置最小重疊為10 bp，錯(cuò)配率為0.1，以獲得Fasta 序列；（ 3） 基于已知數(shù)據(jù)庫(kù)， 使用uchime 程序去除Fasta 序列中的嵌合體，對(duì)于未知數(shù)據(jù)庫(kù)則采用自比對(duì)技術(shù)進(jìn)行去除，同時(shí)清除不符合標(biāo)準(zhǔn)的短序列。下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw PE）在過(guò)濾低質(zhì)量Fastq 數(shù)據(jù)后（如去除條形碼和引物），拼接得到raw_tags，進(jìn)一步去除嵌合體和短序列后獲得高質(zhì)量序列clean_tags。

基于OTU 聚類(lèi)結(jié)果，使用奧維森在線(xiàn)云平臺(tái)相關(guān)程序和軟件進(jìn)行分析，繪制樣品的稀釋曲線(xiàn)（Rarefaction curve）、香農(nóng)曲線(xiàn)（Shannon-Wienercurve），同時(shí)對(duì)樣品的Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用Blast [24]、RDP Classifier [27]等軟件或算法對(duì)OTU 代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，并在3 個(gè)水平（門(mén)、綱、屬）注釋其群落的物種信息，并分別繪制堆疊柱狀圖來(lái)反映群落結(jié)構(gòu)組成情況。

1.3 龜足腸道微生物代謝組樣品提取與處理

1.3.1 代謝物的提取與分析

取25 mg 樣品，加入500 μL 提取液，提取液由甲醇、乙腈和水按體積比2∶2∶1 混合，并加入同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)混合物。樣品在SCIENTZ-48 研磨儀上以35 Hz 的頻率研磨4 min，隨后在SB25-12D 超聲波清洗儀中于冰水浴條件下超聲處理5 min，重復(fù)此過(guò)程3 次。處理后的樣品在?40℃ 下靜置1 h，隨后在4℃、12 000 r·min?1 條件下離心15 min。收集上清液，并將其轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶進(jìn)行檢測(cè)，另外等量的上清液被混合并作為質(zhì)控（QC）樣品進(jìn)行檢測(cè)。

使用Vanquish 超高效液相色譜儀（ ThermoFisher Scientific）與ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（Waters）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。液相色譜的A 相為含有25 mmol·L?1 乙酸銨和25 mmol·L?1氨水的水相，B 相為乙腈。樣品盤(pán)溫度設(shè)定為4℃，進(jìn)樣體積為2 μL。通過(guò)Thermo Q ExactiveHFX 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific），在Xcalibur控制軟件的輔助下采集一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。具體參數(shù)設(shè)置為：（1）套管氣流速：30 Arb；（2）輔助氣流速： 25 Arb；（ 3） 毛細(xì)管溫度： 35℃；（4）全掃描分辨率：120 000；（5）MS/MS 分辨率：7 500；（6）碰撞能量：10/30/60（NCE 模式）；（7）噴霧電壓：正極3.6 kV 或負(fù)極?3.2 kV。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

將原始數(shù)據(jù)使用ProteoWizard 軟件處理并轉(zhuǎn)換為mzXML 格式，然后利用R 程序包進(jìn)行峰的識(shí)別、提取、對(duì)齊和積分，最后與二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)注釋。主要步驟包括：（1）過(guò)濾單個(gè)峰值，保留缺失值在實(shí)際樣品中小于50% 的峰；（2）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用每個(gè)樣品特征總和進(jìn)行歸一化；（3）模擬原始數(shù)據(jù)中的缺失值以獲得鑒定物數(shù)量；（4）進(jìn)行鑒定物的注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 龜足腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 龜足腸道微生物測(cè)序條帶篩選

龜足腸道樣品測(cè)序共得到原始條帶119 741.33±19 249 個(gè)，優(yōu)質(zhì)條帶108 277.67±18 222 個(gè)。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控處理最終得到的優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度主要分布在400～440 bp。

2.1.2 龜足腸道微生物樣品稀釋曲線(xiàn)

使用隨機(jī)抽樣的方法對(duì)序列進(jìn)行抽取，基于抽取的序列數(shù)量及其所代表的OTU 數(shù)量構(gòu)建樣品稀釋曲線(xiàn)。稀釋曲線(xiàn)可以反映樣品的測(cè)序深度情況。當(dāng)曲線(xiàn)趨于平坦時(shí)，表示測(cè)序數(shù)據(jù)量已足夠。由圖1 可知，本次龜足腸道樣品3 個(gè)組內(nèi)平行曲線(xiàn)重合度高，曲線(xiàn)在樣品讀數(shù)（Number of reads sample）大于10 000 之后逐漸趨于平緩，說(shuō)明本次測(cè)序數(shù)量符合要求。

2.1.3 龜足腸道微生物樣品香農(nóng)曲線(xiàn)

香農(nóng)曲線(xiàn)可用來(lái)體現(xiàn)樣品在不同測(cè)序深度時(shí)微生物的多樣性情況。樣品的微生物多樣性越高，香農(nóng)指數(shù)（shannon）越大。由圖2 可知，3 個(gè)組內(nèi)平行樣品曲線(xiàn)重合度高，香農(nóng)指數(shù)在4 左右，表明本次所測(cè)龜足腸道樣品組內(nèi)的重復(fù)性較好且微生物豐富度較高。

2.1.4 龜足腸道樣品門(mén)水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

由圖3可知，在門(mén)分類(lèi)水平上，龜足腸道樣品中主要鑒定到變形菌門(mén)Proteobacteria、擬桿菌門(mén)Bacteroidota、放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacteriota、髕骨菌門(mén)Patescibacteria、疣微菌門(mén)Verrucomicrobiota、厚壁菌門(mén)Firmicutes、蛭弧菌門(mén)Bdellovibrionota、藍(lán)藻門(mén)Cyanobacteria、Methylomirabilota、彎曲桿菌門(mén)Campilobacterota、酸桿菌門(mén)Acidobacteriota、硝化菌門(mén)Nitrospirota、Dependentiae、粘球菌門(mén)Myxococcota、迷蹤菌門(mén)Elusimicrobiota、MarinimicrobiaSAR406_clade、DTB120、綠彎菌門(mén)Chloroflexi、Margulisbacteria、浮霉菌門(mén)Planctomycetota、SAR324_clade_Marine_group_B、MBNT15、WOR-1、梭桿菌門(mén)Fusobacteriota、螺旋體門(mén)Spirochaetota 及少量其他菌門(mén)。

由表2 可知，龜足腸道樣品的最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，含量大于1% 的菌群門(mén)類(lèi)數(shù)量有5 種，其他菌門(mén)含量均小于1%，選擇合并。

2.1.5 龜足腸道樣品綱水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

由圖4可知，在綱分類(lèi)水平上，龜足腸道樣品中主要鑒定到擬桿菌綱Bacteroidia、γ 變形菌綱Gammaproteobacteria、α 變形菌綱Alphaproteobacteria、放線(xiàn)菌綱Actinobacteria、Omnitrophia、Gracilibacteria、Bdellovibrionia、藍(lán)藻綱Cyanobacteriia、Methylomirabilia、梭菌綱Clostridia、芽孢桿菌綱Bacilli、酸微菌綱Acidimicrobiia、Vampirivibrionia、彎曲桿菌綱Campylobacteria、Babeliae、脫鹵脫亞硫酸菌綱Desulfitobacteriia、Vicinamibacteria、uncultured_bacterium、硝化螺旋菌綱Nitrospiria、Oligoflexia等菌綱。

由表3 可知，龜足腸道樣品的最優(yōu)勢(shì)綱類(lèi)為擬桿菌綱Bacteroidia，含量大于1% 的菌群綱類(lèi)數(shù)量有5 種，其他綱類(lèi)含量小于1%。

2.1.6 龜足腸道樣品屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

由圖5可知，在屬分類(lèi)水平上，龜足腸道樣品中鑒定到沉積物桿狀菌屬Sediminibacterium、Pseudarcicella、Limnohabitans、新鞘氨醇菌屬Novosphingobium、uncultured、假單胞菌屬Pseudomonas、Rhodoluna、萊茵海默氏菌屬Rheinheimera、黃質(zhì)菌屬Flavobacterium、unidentified、嗜麥芽寡單胞菌屬Stenotrophomonas、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、Aurantimicrobium、假紅桿菌屬Pseudorhodobacter、Arcicella、Fluviicola、Candidatus_Omnitrophus、苯基桿菌屬Phenylobacterium、C39、Fluviicoccus等菌屬。

由表4 可知，龜足腸道最優(yōu)勢(shì)菌屬為Sediminibacterium，含量大于1% 的菌群屬類(lèi)數(shù)量有13 種，其他屬類(lèi)含量小于1%，此外還有較多uncultured（5.47%）和unidentified（2.79%）的菌屬。

2.1.7 龜足腸道微生物Alpha 多樣性分析

對(duì)龜足腸道微生物樣品進(jìn)行Alpha 多樣性分析，可運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法快速評(píng)估菌群的豐富度及群落多樣性。Alpha 多樣性分析中的各項(xiàng)指數(shù)結(jié)果如下：Chao1指數(shù) 1 115.92±145.65、Observed_species 指數(shù)854.00±91.99、 PD_whole_tree 指數(shù) 78.69±7.85、Simpson 指數(shù) 0.87±0.02。

2.1.8 龜足腸道微生物功能預(yù)測(cè)

由表5 可知，基于龜足腸道樣品的KEGG 比對(duì)獲得的功能信息總共包含32 種代謝功能。KEGG 代謝通路分析表明， 排名前3 的二級(jí)功能分別為氨基酸代謝（ Amino acid metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）和輔助因子與維生素代謝（ Metabolism of cofactors and vitamins）， 其占比分別為13.48%、12.94% 和12.58%。

2.2 龜足腸道代謝組分析

2.2.1 代謝物種類(lèi)分析

對(duì)共6 個(gè)龜足腸道樣品進(jìn)行基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)的代謝分析，共檢測(cè)到1 288 個(gè)代謝物，其中相對(duì)定量均值排名前50 的代謝物名稱(chēng)見(jiàn)圖6。

2.2.2 代謝物分類(lèi)

對(duì)龜足全部腸道樣品代謝物進(jìn)行分類(lèi)，在二級(jí)分類(lèi)水平共鑒定到13 類(lèi)代謝物，結(jié)果見(jiàn)圖7。 其中，脂類(lèi)和類(lèi)脂分子含量最多，例如前列腺素、雄激素、花生四烯酸、牛磺酸、二十二碳六烯酸等，占總代謝物的31%；其次是有機(jī)酸及其衍生物，例如甲酸、蘋(píng)果酸、乳酸、丁酸、乙醛酸、琥珀酸、多巴胺、谷胱甘肽、甜菜堿等，占總代謝物的23%。

本次檢測(cè)還在龜足腸道樣品中發(fā)現(xiàn)了較多的氨基酸種類(lèi)，除了對(duì)于人體常見(jiàn)的8 種必需氨基酸外，還含有甘氨酸Glycine、谷氨酸Glutamic acid、谷氨酰胺Glutamine、天冬氨酸Aspartic acid、脯氨酸Proline、絲氨酸Serine、羥脯氨酸Hydroxyproline、酪氨酸Tyrosine、瓜氨酸Citrulline、精氨酸Arginine、半胱氨酸Cysteine 等非必需氨基酸。

3 討論

腸道是生物體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收與代謝發(fā)生的重要場(chǎng)所，腸道微生物在促進(jìn)腸道行使生理功能的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[28]。通過(guò)分子水平的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物的種類(lèi)及豐度會(huì)與宿主的食性和健康相互作用[29]。水生動(dòng)物腸道微生物組成受到多方面因素影響，例如生存環(huán)境、物種類(lèi)別、食物來(lái)源、養(yǎng)殖模式、發(fā)育階段等都可能使宿主腸道微生物的組成產(chǎn)生差異，甚至對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的種類(lèi)產(chǎn)生影響。龜足與其他水生動(dòng)物的腸道微生物組成種類(lèi)相似，優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等，但結(jié)構(gòu)比例有較大差異，如赤眼鱒腸道菌群在門(mén)水平上的優(yōu)勢(shì)菌群為放線(xiàn)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等[30]，長(zhǎng)江口日本鰻鱺幼體腸道微生物菌群以變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[31]，中華絨螯蟹的腸道優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)[32]，蝦類(lèi)的腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和厚壁菌門(mén)等[33?35]。

生物體腸道微生物種類(lèi)受到生存環(huán)境和食物的影響。食物種類(lèi)可以明顯影響甲殼類(lèi)動(dòng)物的消化酶活力，消化酶活力水平的高低直接反映了生物體對(duì)攝入食物中營(yíng)養(yǎng)成分的利用能力[36?37]，林崗等[38]對(duì)采自福建省連江縣定海海區(qū)龜足的5 種消化酶的酶活力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，其中酶活力最高的為類(lèi)胰蛋白酶，胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力均為較高水平，活力極低的為纖維素酶，這與龜足在野外生存環(huán)境中春夏季食譜中橈足類(lèi)、無(wú)節(jié)幼體等動(dòng)物性食物較為豐富有關(guān)。齊衍萍等[39]2005 年9 月和2006 年5 月對(duì)福建羅源灣浮游動(dòng)物群落特征進(jìn)行了調(diào)查，共鑒定到浮游動(dòng)物70 種，浮游幼蟲(chóng)20 類(lèi)，其中浮游動(dòng)物成體所屬門(mén)類(lèi)中橈足類(lèi)多達(dá)32 種，這些浮游類(lèi)生物為龜足主要的食物來(lái)源，共同印證了龜足腸道微生物代謝組數(shù)據(jù)中脂類(lèi)及類(lèi)脂分子處于較高水平的結(jié)果。劉倩倩[40]對(duì)定海灣微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同養(yǎng)殖時(shí)期的浮游細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群均為變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)和擬桿菌門(mén)，這與龜足腸道微生物測(cè)序結(jié)果基本吻合。在對(duì)鮑魚(yú)腸道微生物的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的變化與鮑魚(yú)飲食的變化相吻合[41]。高通量測(cè)序及代謝組學(xué)分析顯示，在刺參飼料中添加一定量的鼠李糖乳桿菌可以通過(guò)調(diào)控一系列代謝通路對(duì)刺參腸道微生物組成造成顯著影響[42]，表明餌料中的營(yíng)養(yǎng)組成可改變宿主腸道微生物的結(jié)構(gòu)。這解釋了龜足腸道微生物種類(lèi)會(huì)受到其生存環(huán)境及食物的影響。

在樣品的功能預(yù)測(cè)方面，龜足腸道微生物氨基酸代謝、碳水化合物代謝和輔助因子、維生素代謝途徑較為旺盛，這些過(guò)程與蛋白質(zhì)的合成與加工、新陳代謝等重要生理生化過(guò)程緊密相關(guān)，經(jīng)過(guò)腸道微生物的加工能夠?yàn)辇斪闾峁┛芍苯永玫拇x底物[43]，對(duì)龜足生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用。赤眼鱒[30]、日本鰻鱺玻璃鰻[31，44]、納木錯(cuò)裸鯉[45]腸道微生物功能預(yù)測(cè)的研究結(jié)果也具有一定的相似性。

綜上所述，可以在明確龜足腸道微生物的組成、功能及其與生存環(huán)境關(guān)系的基礎(chǔ)上通過(guò)改善養(yǎng)殖環(huán)境、調(diào)整餌料配比、針對(duì)性飼料開(kāi)發(fā)等方式改善龜足腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，在人工養(yǎng)殖條件下提供更適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，提高成活率及飼料營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化率，縮短養(yǎng)殖周期，實(shí)現(xiàn)快速人工育成。

4 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)龜足腸道樣品的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)龜足腸道微生物在門(mén)水平、綱水平、屬水平的最優(yōu)勢(shì)菌分別為變形菌門(mén)Proteobacteria、擬桿菌綱Bacteroidia、沉積物桿狀菌屬Sediminibacterium。KEGG 代謝通路分析表明，龜足腸道微生物排名前3 的二級(jí)功能為氨基酸代謝（ Amino acidmetabolism）、碳水化合物代謝（ Carbohydratemetabolism）、輔助因子和維生素代謝（Metabolismof cofactors and vitamins）， 分別占比13.48%、12.94%、12.58%；龜足腸道微生物代謝產(chǎn)物在二級(jí)分類(lèi)水平上共檢測(cè)到13 類(lèi)，排名前三的為脂類(lèi)和類(lèi)脂分子、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)雜環(huán)化合物，分別占比31%、23%、15%；氨基酸排名前3的種類(lèi)為甘氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸。結(jié)果可為龜足營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為龜足人工養(yǎng)殖及餌料開(kāi)發(fā)提供一定參考。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

基金項(xiàng)目：中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)（2022L3010）。