miRNA-182、miRNA-200c 和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ單獨及聯合檢測對胃癌的診斷價值△

屠俊標，魏萍萍，葉施雨，黃耀

上海市靜安區中心醫院1 檢驗科，2 消化內科，上海 200040

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率均居消化系統惡性腫瘤首位[1]。目前，胃癌患者中晚期所占比例較高，且呈不斷升高趨勢[2]，胃癌的治療效果較差，因此早期診斷對提高胃癌患者的生存率、改善生活質量尤為重要。有研究發現，微小RNA（microRNA，miRNA）是一種產生于生物體內、具有內源性特征、非編碼單鏈形式的小分子RNA，普遍參與多種腫瘤的發生發展過程，是診斷多種早期腫瘤的標志物[3]。在人胃癌細胞內，miRNA-182 表達水平明顯高于正常胃上皮細胞，且miRNA-182 表達水平與胃癌大小、淋巴結轉移情況及臨床分期密切相關[4]。而miRNA-200c 在胃癌患者血清中水平明顯升高，且有學者發現，胃癌細胞中miRNA-200c 水平與上皮-間充質轉化及淋巴結轉移密切相關[5]。此外，胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）是一種胃蛋白酶前體，包括PGⅠ和PGⅡ兩種。PGⅠ多由胃底腺的主細胞及黏液頸細胞產生，PGⅡ除可由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌外，還可以由幽門腺的黏液頸細胞和十二指腸腺上段分泌。大部分PG 會運轉至胃腔，但也有少量的PG 會經過胃黏膜毛細血管轉運至血液，因此，PG 能夠通過血清進行檢測。當胃黏膜病變時，PG 分泌會受到影響，PGⅠ/PGⅡ可間接反映胃黏膜的萎縮程度[6]。因此，深入研究miRNA-182、miRNA-200c 和PGⅠ/PGⅡ在胃癌診斷中的作用不僅有助于胃癌的早期診斷，還可以用來制訂新的有效治療策略以及評估胃癌患者的預后。本研究探討miRNA-182、miRNA-200c 和PGⅠ/PGⅡ單獨及聯合檢測對胃癌的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022 年1—12 月上海市靜安區中心醫院收治的胃癌患者。納入標準：①符合《胃癌規范化綜合診療手冊》[7]中關于胃癌的診斷標準，經病理學檢查確診為胃癌；②臨床資料完整；③年齡﹥18歲。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②既往接受過其他抗腫瘤治療；③既往診斷為胃癌，再次入院治療；④檢測血清miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ、PGⅡ水平時已接受過胃癌切除手術。依據納入和排除標準，本研究共納入65 例胃癌患者，作為觀察組。選取同期在上海市靜安區中心醫院進行健康體檢的61 例健康者，作為對照組。觀察組中，男36 例，女29 例；平均年齡（56.39±14.93）歲；平均身高（173.26±16.36）cm；平均體重（78.63±9.03）kg；腫瘤部位：胃體32 例，胃竇33 例。對照組中，男25 例，女36 例；平均年齡（55.94±13.79）歲；平均身高（168.86±15.61）cm；平均體重（76.56±8.62）kg。兩組受試者性別、年齡、身高、體重比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測miRNA-182、miRNA-200c 水平

抽取兩組受試者血清，2000 r/min 離心15 min，取上層血清-80 ℃保存待檢。取-80 ℃凍存血清冰上融化后，3000 r/min 離心3 min，采用miRNeasy Serum/Plasma Kit 提取總RNA：吸取200 μl血清，加5 倍體積QIAzol 振蕩，室溫靜置5 min，加氯仿劇烈振蕩1 min，室溫靜置3 min 后4 ℃離心15 min。轉移上層水相600 μl，加入1.5 倍體積的100%乙醇，劇烈振蕩1 min。加入14 μl 超純水，2000 r/min 離 心3 min，收集洗脫 液RNA[8]。將-20 ℃的試劑、RNA 模板在室溫環境中溶解，并調配均勻，將調配好的混合液4000 r/min 離心3 min，42 ℃培育箱中培育2 min，室溫中冷卻[9]，合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），在85 ℃培育箱中培育，5 min 后備用，室溫溶解并進一步有效混合后進行后續的兩步法PCR：95 ℃10 min；95 ℃15 s，45～72 ℃1 min，40 個循環。以U6為內參，采用2-△△Ct法計算miRNA-182、miRNA-200c 水平[10]。U6上游引物為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT- 3'，下游引物為 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；miRNA-182上游引物為5'-UCACACUCAAGAUGGUAACGGUUU-3'，下游引物為5'-AGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA-3'；miRNA-200c 上游引物 為5'-AGGUAGUAAUGGGCCGUCAUAAU-3'，下游 引物為5'-UCCAUCAUUACCCGGCAGUAUUA-3'。

1.3 PGⅠ、PGⅡ水平檢測[11]

抽取兩組受試者清晨空腹靜脈血3 ml，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清PGⅠ、PGⅡ水平，并計算PGⅠ/PGⅡ。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ單獨及聯合檢測對胃癌的診斷價值；以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-182、miRNA-200c 水平的比較

觀察組患者血清miRNA-182、miRNA-200c 水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 兩組受試者血清miRNA-182、miRNA-200c 水平的比較（±s）

表1 兩組受試者血清miRNA-182、miRNA-200c 水平的比較（±s）

組別觀察組（n=65）對照組（n=61）t值P值miRNA-182 5.22±0.94 4.31±0.63 6.341 0.000 miRNA-200c 0.29±0.08 0.14±0.04 13.178 0.000

2.2 血清PGⅠ、PGⅡ水平及PGⅠ/PGⅡ的比較

觀察組患者血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ均低于對照組，PGⅡ水平高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 兩組受試者血清PGⅠ、PGⅡ水平及PGⅠ/PGⅡ的比較（±s）

表2 兩組受試者血清PGⅠ、PGⅡ水平及PGⅠ/PGⅡ的比較（±s）

組別觀察組（n=65）對照組（n=61）t值P值PGⅠ（ng/ml）37.46±2.24 57.81±2.66 46.552 0.000 PGⅡ（ng/ml）13.17±3.13 11.93±2.27 2.532 0.013 PGⅠ/PGⅡ3.31±0.51 4.64±0.87 12.712 0.000

2.3 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ單獨及聯合檢測對胃癌的診斷價值

ROC 曲線顯示，miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ聯合檢測診斷胃癌的AUC 為0.829（95%CI：0.633～0.859），高于各指標單獨檢測的0.650、0.722、0.818，此時的靈敏度為0.825，特異度為0.890（表3、圖1）。miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ單獨及聯合檢測診斷胃癌的模型質量評價見圖2，﹥0.5 表示該模型的預測價值良好，≤0.5 表示該模型的預測價值并不優于隨機預測。

圖1 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ單獨及聯合檢測診斷胃癌的ROC曲線

圖2 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ單獨及聯合檢測診斷胃癌的模型質量評價圖

表3 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ單獨及聯合檢測對胃癌的診斷價值

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，中國胃癌發病率和病死率均居所有消化系統惡性腫瘤首位[12]，因此，多數研究者認為，早期對胃癌進行診斷十分必要，可以有效預防胃癌進展或復發。胃癌篩查可以有效提高早期診斷率，從而給予早期治療，以改善患者預后和生活質量。

既往臨床診斷腫瘤以檢測腫瘤標志物的表達情況為主，但臨床實際工作發現，通過檢測腫瘤標志物的表達水平來診斷腫瘤存在諸多不足[13]。miRNA 在細胞分化、細胞周期及凋亡過程中發揮著多種生物學功能，同時也可參與傷口愈合、調節免疫系統功能。此外，miRNA 在表達譜上包含組織特異性的特點，部分腫瘤組織中可以存在明顯不同的miRNA，因此，對于腫瘤診斷及預后評估的價值較高。目前，研究發現，健康者血清中檢測的miRNA，與腫瘤患者血清中的miRNA 有明顯不同的表達譜，因此，檢測血清中的miRNA 或許是更加準確的腫瘤診斷方法。

有研究發現，miRNA-182 能夠抑制cAMP 反應元件結合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1，CREB1）基因的表達從而抑制胃癌細胞的增殖[14]。周懌等[15]通過RT-PCR 檢測miRNA-182的表達水平發現，胃癌組織中miRNA-182 的表達水平較高，且存在淋巴結轉移胃癌患者胃癌組織中miRNA-182 的表達水平更高，表明miRNA-182可發揮原癌基因的作用，能夠導致胃癌發生及轉移。miRNA-200c 可通過靶向調控DNA 甲基轉移酶3β（DNA methyltransferase 3β，DNMT3B）的表達抑制胃癌細胞生長和增殖。研究顯示，miRNA-200c 可直接調控DNMT3B基因的表達，蛋白質印跡法（Western blot）檢測發現，miRNA-200c 升高能夠抑制DNMT3B 蛋白的表達，從而減少胃癌細胞的生長和增殖[16-17]。本研究結果顯示，觀察組血清miRNA-182、miRNA-200c 水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01），表明miRNA-182、miRNA-200c 可能在胃癌發生發展過程中發揮重要作用。

本研究ROC 曲線顯示，miRNA-182、miRNA-200c 診斷胃癌的AUC 分別為0.650、0.722，提示其水平升高可能與胃癌的發生發展有關。miRNA-182、miRNA-200c 可一定程度上影響抑癌基因和轉錄因子的表達，從而發揮調控胃癌發生發展的生物學作用，故檢測miRNA-182、miRNA-200 水平，可為胃癌患者選擇更優的治療方案提供參考，并成為評估胃癌患者預后的有效生物標志物。

天冬氨酸蛋白酶可于酸性狀態下被激活，轉變為PG 并發揮促消化作用[18]，而部分PG 經過胃黏膜毛細血管的轉運最終到達血液，因此，PG 能夠通過血清進行檢測。本研究結果顯示，觀察組患者血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ均低于對照組，PGⅡ水平高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。慢性萎縮性胃炎是進展為胃癌的重要階段，研究顯示，80%以上的胃癌患者伴有萎縮性胃炎，大多數腸型胃癌可從慢性萎縮性胃炎進展至腸化生，隨之進展為不典型增生，最終進展為胃癌[19]。胃黏膜嚴重萎縮時，胃體腺和胃底腺的數量會隨之降低，幽門腺會有所升高，可使PGⅠ水平降低，而PGⅡ水平變化不明顯甚至可能會有所增加，因此，PGⅠ/PGⅡ可能會存在一定程度的降低。此外，胃癌導致的胃黏膜損傷和炎癥反應，加之幽門螺桿菌感染、藥物等，也導致了PG 分泌失衡，導致PGⅠ/PGⅡ升高。

本研究ROC 曲線顯示，PGⅠ/PGⅡ診斷胃癌的AUC 為0.818，表明PGⅠ/PGⅡ對胃癌的診斷效能較高，可能是一個較為敏感和特異的胃癌診斷標志物。這可能是因為胃癌的刺激使機體發生免疫反應，使胃黏膜發生炎癥、萎縮、癌變等，導致血清PG 水平發生了改變。PGⅠ/PGⅡ可以反映胃黏膜功能和狀態，由于胃癌患者胃黏膜受損嚴重，導致PGⅠ分泌減少，而PGⅡ水平相對穩定或增加，導致PGⅠ/PGⅡ降低，這也在一定程度上使PGⅠ/PGⅡ在診斷胃癌時具有較高的靈敏度和特異度，從而提高了AUC。MiKi[20]的研究發現，PGⅠ水平及PGⅠ/PGⅡ降低能夠作為胃癌患者的診斷標志物。還有研究表明，胃癌患者PGⅠ水平降低會被幽門腺或腸上皮化生逆轉，因此，胃癌患者血清中PGⅠ水平降低，但產生PGⅡ的腺體增多，PGⅡ水平變化不明顯甚至可能有所升高，最終PGⅠ/PGⅡ明顯降低，其診斷胃癌具有很高的診斷價值[21]。

本研究結果顯示，miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ聯合檢測診斷胃癌的AUC 為0.829（95%CI：0.633～0.859），高于各指標單獨檢測，此時的靈敏度為0.825，特異度為0.890，表明三者聯合檢測進一步提高了胃癌的診斷價值。這可能是因為雖然PGⅠ/PGⅡ單獨檢測診斷胃癌的AUC 較高，但PGⅠ/PGⅡ失衡也常見于胃炎、胃潰瘍、幽門螺桿菌感染等疾病，三者聯合檢測可進一步提高診斷準確度。

綜上所述，miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ聯合檢測對胃癌的診斷價值更高，或可作為胃癌診斷的有效指標。