基于細胞焦亡基因前列腺癌預后模型的構建及腫瘤微環境分析△

邵波，萬水，田申，馬園園，陳丹霞，杜沂宸

1 昭通市中醫醫院泌尿外科，云南 昭通 657000

蕪湖市中醫醫院2 泌尿外科，3 皮膚科，4 肛腸科，安徽 蕪湖 241000

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，在中國發病率呈上升趨勢，嚴重威脅中老年男性的生命健康[1]。PCa 發生于前列腺上皮[2]，是一種雄激素依賴性惡性腫瘤，病理類型包括導管腺癌、腺癌、鱗狀細胞癌等，其中90%以上為腺癌[3]，其發病機制目前尚不清楚。細胞焦亡是近年來被發現并證實的一種新的細胞程序性死亡方式，可參與腫瘤微環境的形成，具有促進和抑制腫瘤發生、發展的雙重效應，其特征為細胞膜穿孔、細胞腫脹及細胞破裂等[4-5]。目前，關于PCa 與細胞焦亡基因關系的研究較少。因此，本研究基于細胞焦亡基因構建PCa 預后模型并分析其腫瘤微環境，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據獲取

從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中獲取502 例PCa 患者和51 例健康者的基因轉錄組數據、基因突變數據。從基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中獲取96 例PCa 患者的臨床特征及細胞焦亡基因表達數據。

1.2 獲取差異表達的細胞焦亡基因

1.2.1 PCa 與細胞焦亡基因關系分析 將PCa 患者的基因突變數據導入R 語言“clusterProfiler”包中，分析腫瘤樣品中基因突變的類型、頻率及其堿基改變情況。通過perl 軟件進一步整理基因突變數據，計算腫瘤突變負荷及拷貝數頻率變化情況，分析拷貝數頻率在染色體上的變化。將從TCGA數據庫下載的502例PCa患者和51例健康者的轉錄組數據進行差異分析，提取差異表達的細胞焦亡基因。

1.2.2 預后相關基因的篩選 將從GEO 數據庫下載的96 例PCa 患者的臨床特征及細胞焦亡基因表達數據合并，設置參數P﹤0.001，篩選出與預后相關的細胞焦亡基因。根據風險比（hazard ratio，HR）將篩選出的預后相關基因分為高風險基因和低風險基因。HR≥1 為高風險基因，HR﹤1 為低風險基因。

1.2.3 PCa 分型及驗證 根據細胞焦亡基因的表達量，設置聚類算法clusterAlg=“km”，對PCa 進行聚類分析。根據R 語言“ConsensusClusterPlus”包累積分布函數（cumulative distribution function，CDF）圖的K 值確定最佳亞型分組，以CDF 圖中各顏色圖譜界限最清楚時的K 值為最佳分組。應用主成分分析（principal component analysis，PCA）驗證上述聚類分析結果是否可靠。對細胞焦亡基因亞型的基因表達量、不同亞型患者生存情況進行差異分析，來驗證分型是否可靠。

1.2.4 差異交集基因的獲取及富集分析 對不同亞型PCa 患者細胞焦亡基因的表達量進行差異分析，以|logFC|﹥1，P﹤0.05 為過濾條件篩選差異交集基因。使用R 語言“clusterProfiler”包對差異交集基因的分子功能和功能途徑進行基因本位（Gene Ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.3 預后相關差異表達基因的獲取、分析及驗證

將上述差異交集基因、PCa 患者的臨床特征進行單因素Cox 分析，以P﹤0.05 為過濾條件獲得與預后相關的顯著差異表達基因及其表達量。將顯著差異表達基因的表達量進行聚類分析，算法及判斷條件同1.2.3。將不同亞型的基因表達數據和臨床數據進行差異分析，以P﹤0.001 為過濾條件分析不同亞型PCa 患者的生存情況與細胞焦亡基因的關系。

1.4 預后模型的篩選、構建及驗證

1.4.1 預后模型基因的篩選及風險評分公式的驗證 將502 例PCa 患者隨機分為訓練集（n=376）和測試集（n=126），根據訓練集顯著差異表達基因的表達量進行Lasso 回歸分析，并做10 倍交叉驗證，輸出風險評分。取訓練集風險評分的中位值將訓練集、測試集分別分為高風險組和低風險組。將高風險組和低風險組進行生存情況、基因表達差異分析，由測試集分析結果驗證訓練集所構建的風險評分計算公式是否可靠。

1.4.2 預后影響因素分析、預后模型的構建及驗證 采用多因素Cox 回歸模型分析PCa 患者預后的獨立影響因素，并構建預后模型、繪制列線圖，預測PCa 患者第6、9、12 年的生存情況，并采用一致性分析驗證該模型與PCa 患者的實際生存情況是否相符。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）驗證預后模型的可靠性，AUC≥0.65 時，表明預后模型的準確度較高。

1.5 腫瘤微環境分析

從ImmPort 數 據庫（https://www.immport.org/）中下載免疫細胞數據，應用R 語言“cibersort”包分析免疫細胞含量，數據下載截止日期為2023 年1月12 日。應用R 語言通過“quantile”包分析參與預后模型構建的基因與免疫細胞含量的相關性。應用R 語言“estimate”包得出腫瘤微環境基質細胞評分、免疫細胞評分并評估PCa 樣品的腫瘤純度。從PubMed 數據庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載泛癌干細胞數據，分析干細胞含量與風險評分之間的相關性，數據下載截止日期為2023 年1 月12 日。對高風險組和低風險組樣本進行腫瘤突變負荷分析，數據來源于1.2.1 部分。

2 結果

2.1 差異表達的細胞焦亡基因

2.1.1 PCa與細胞焦亡基因的關系 突變頻率最高的細胞焦亡基因分別為斑點型BTB/POZ 蛋白（speckle type BTB/POZ protein，SPOP）（11%）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）（11%）、肌聯蛋白（titin，TTN）（10%）；TP53、帶電多泡體蛋白7（charged multivesicular body protein，CHMP）7、顆粒酶A（granzyme A，GZMA）、CHMP4C、消皮素（gasdermin，GSDM）C、含核苷酸結合寡聚化結構域1（nucleotide binding oligomerization domain containing，NOD）1 等51 個焦亡基因存在拷貝數變異；各突變基因幾乎分布于人體所有染色體。差異分析得到37 個顯著差異表達的細胞焦亡基因，其中B 細胞淋巴瘤/白血病-2 相關X 蛋白（B cell lymphoma/leukemia- 2- associated X protein，BAX）、CHMP2A等10 個基因在PCa 樣本中表達量高，胱天蛋白酶（caspase，CASP）1、CHMP2B等27 個基因在正常樣本中表達量高。（圖1）

圖1 PCa患者與健康者焦亡基因表達差異箱線圖

2.1.2 預后相關基因的篩選 根據細胞焦亡基因的表達量及臨床數據分析，獲得10 個與預后相關的細胞焦亡基因，其中9 個高風險基因為BAX、CASP3、CASP6、CASP8、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、白細胞介素（interleukin，IL）1B、IL6、含PYD 和CARD 域（PYD and card domain containing，PYCARD）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），1個低風險基因為IL1A。

2.1.3 PCa 分型及驗證 聚類分析顯示，根據CDF 圖將K 值確定為3，將PCa 分為A、B、C 三個亞型，采用PCA 驗證分型結果可靠。差異分析結果顯示，不同亞型之間存在顯著差異，數據可用于后續分析。

2.1.4 差異交集基因的獲取及富集分析 通過差異分析獲得A、B、C 三個亞型的交集基因共109個。GO 及KEGG 富集分析結果顯示，差異交集基因主要通過細胞外基質組織（extracellular matrix organization，EMO）、細胞外結構組織（extracellular structure organization，ESO）、肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation，PTP）、肽基酪氨酸修飾（peptidyl-tyrosine modification，PTM）等通路來激活蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）、跨膜受體蛋白激酶（transmembrane receptor protein kinase，TRPK）等分子的功能，從而影響PCa 的發生、發展。（圖2）

圖2 GO功能注釋及KEGG富集通路分析

2.2 預后相關的顯著差異表達基因的獲取、分析及驗證

單因素Cox 分析得到與預后相關的顯著差異表達基因109 個。對不同亞型PCa 患者的細胞焦亡基因表達量、生存情況進行分析，得出不同亞型PCa 患者的生存情況與細胞焦亡基因表達量之間的關系與2.1.2 及2.1.3 相符，說明篩選出的顯著差異表達基因具有可靠性，可用于后續預后模型構建。

2.3 預后模型的構建及驗證

2.3.1 預后相關基因的篩選 將顯著差異表達的基因納入Lasso 回歸模型進行篩選，采用10 倍交叉驗證篩選出B 細胞淋巴瘤/白血病3（B-cell leukemia/lymphoma 3，BCL3）、骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、C-C 趨化因子受體5（C-C motif chemokine receptor 5，CCR5）、幾丁質酶3 樣蛋白2（chitinase 3 like 2，CHI3L2）、肝癌缺失蛋白1（deleted in liver cancer 1，DLC1）、主要組織相容性復合體Ⅱ類DQ alpha 2（major histocompatibility complex, class Ⅱ, DQ alpha 2，HLADQA2）、分泌球蛋白家族3A 成員1（secretoglobin family 3A member 1，SCGB3A1）、serpin 家族E 成員1（serpin family E member 1，SERPINE1）、溶質載體家族14 成員1（solute carrier family 14 member 1，SLC14A1）9 個與預后相關的基因，并構建預后模型。風險評分計算公式：風險值=DLC1表達量×（-3.01982305649243）+SERPINE1表達量×（ -1.79410577740395 ） +BCL3表達量 ×（ -1.33453048935853 ） +CCR5表達量 ×（ -4.46426540725949 ）+CHI3L2表達量 ×（ - 4.92826100054168）+BMP2表達量 ×（ 5.20551784803045 ）+SCGB3A1表達量 ×（ - 4.55414507965178）+SLC14A1表達量×（2.10817308576526）+HLA-DQA2表達量 ×（2.6657243859992），分別計算每例患者的風險評分。按照風險評分的中位值，將HR≥4、HR﹤4 的PCa 患者分別作為高風險組（n=376）與低風險組（n=126）。差異分析顯示，訓練集與測試集預后情況大致相同，且隨著風險評分的升高，患者死亡數增加。由此可得，風險計算公式可靠，可用于預后模型構建。

2.3.2 預后影響因素分析、預后模型的構建及驗證 多因素Cox 分析結果顯示，年齡、腫瘤分期（T 分期、N 分期）、風險程度均是PCa 患者預后的獨立影響因素。繪制預后模型列線圖，并與患者實際生存情況進行一致性分析，結果顯示，該模型預測PCa 患者第6、9、12 年的生存情況與患者的實際生存情況比較相符（圖3）。ROC 曲線顯示，該模型預測PCa 患者第6、9、12 年生存情況的AUC分別為0.803、0.722、0.689，表明該模型預測預后的準確度較高。

圖3 PCa患者預后模型列線圖

2.4 腫瘤微環境分析

2.4.1 免疫細胞相關性分析 免疫細胞含量與細胞焦亡基因存在相關性（正相關或負相關）（圖4）。對高風險組與低風險組進行差異分析，結果顯示，高風險組患者的基質細胞評分明顯高于低風險組，差異有統計學意義（P﹤0.01）；兩組免疫細胞評分、綜合評分比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）（圖5）。

圖4 免疫細胞與參與預后模型構建焦亡基因關系圖

圖5 高風險組（n=376）和低風險組（n=126）腫瘤微環境差異分析

2.4.2 干細胞相關性分析 相關性分析結果顯示，干細胞含量與風險評分呈正相關（P﹤0.01）。（圖6）

圖6 干細胞含量與風險評分的相關性

2.4.3 腫瘤突變負荷差異分析 差異分析結果顯示，高風險組患者的腫瘤突變負荷明顯高于低風險組（P﹤0.01）。（圖7）

圖7 高風險組（n=376）和低風險組（n=126）腫瘤突變負荷差異分析

3 討論

PCa 屬于泌尿系高發惡性腫瘤，與細胞焦亡密切相關。細胞焦亡基因主要通過雄激素受體（androgen receptor，AR）、CASP3、CASP1/GSDMD 等信號通路影響PCa 的發生和發展[6-8]。同時，也可以由紫杉醇、雙氫青蒿素等藥物來誘導PCa 相關的細胞焦亡[9-10]。細胞焦亡是一種不同于細胞凋亡的細胞死亡方式，通過活化CASP 蛋白來裂解GSDMD 蛋白，誘導炎癥小體的表達以及炎癥因子的分泌，最終導致細胞死亡[11]。炎癥小體、炎癥因子和GSDMD 蛋白等與腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關[12]。

本文篩選出9 個與預后相關的顯著差異表達的細胞焦亡基因，包括DLC1、BCL3、SERPINE1、CCR5、CHI3L2、SCGB3A1、HLA-DQA2、SLC14A1、BMP2。DLC1為抑癌基因，通過與其伴侶磷脂酶Cδ1、真核延伸因子、鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶活化蛋白結合，影響細胞動力，或與張力蛋白、黏著斑激酶相互作用重塑黏著斑，加強黏附蛋白的作用，從而降低腫瘤細胞轉移風險[13-14]。BCL3可阻斷核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路，影響細胞增殖、分化、凋亡以及免疫反應等，對多數腫瘤具有促進作用，但對如PCa 等炎癥性腫瘤具有明顯的抑制作用[15-16]。SERPINE1、CCR5、CHI3L2、SCGB3A1基因在肺癌、直腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中具有促進腫瘤發生、發展的作用[17-20]。根據本文分析結果，上述基因可以降低PCa 患者的死亡風險并延長患者的生存期。分析原因可能為，基因表達物分泌至腫瘤微環境中，與炎癥因子相互作用，激活了細胞焦亡基因對腫瘤的抑制作用。因此，上調上述細胞焦亡基因的表達或可成為治療PCa 的新方法。BMP2屬于轉化生長因子β超家族成員的低分子糖蛋白基因，可誘導髓源性抑制細胞增殖，促進腫瘤細胞浸潤[21-22]。SLC14A1編碼的尿素轉運蛋白B（urea transporter B，UT-B）在腫瘤組織中大多處于堿基缺失狀態，因此功能低下，增加微環境腫瘤負荷可促進腫瘤的發生、發展[23]。HLA-DQA2屬于白細胞抗原的一種亞型，可限制CD4+輔助性T 細胞的相關反應，降低機體抗原呈遞、免疫激活等功能的效應，對惡性腫瘤的預后產生不利影響[24]。

GO 功能注釋和KEGG 富集分析結果顯示，細胞焦亡基因通過EMO、ESO、PTP、PTM 等通路來激活PTK、TRPK 等分子的功能，從而調控PCa 的發生、發展。EMO、ESO 信號通路包括腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導物（TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）/成纖維細胞生長誘導因子14（fibroblast growth factor-inducible 14，Fn14）、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）/Rho 關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶1（Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）/Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）、WNT/β-聯蛋白（βcatenin）等，對細胞成分、功能、增殖、分化以及構建起調節作用，失衡時可引起細胞增殖、分化紊亂及密集重疊生長，促進腫瘤的發生、轉移和浸潤[25-27]。PTP 通路屬于肽基酪氨酸修飾的方式之一。酪氨酸在調控細胞活動過程起到分子開關的作用，可導致腫瘤擴散。幾乎所有的多肽因子均通過PTP 通路來激活和刺激細胞的生長、增殖，促進腫瘤的發生[28]。PTK 可催化多種含Scr 同源結構域2（Src homology domain 2，SH2）的底物蛋白磷酸化，誘導細胞增殖和分化，促進PCa、膀胱癌等多種惡性腫瘤的發生、發展[29]。TRPK 屬于跨膜蛋白，膜外信號物質與跨膜受體蛋白結合后，可激活其活性，促進跨膜受體蛋白功能，如NOTCH 受體蛋白易造成腫瘤細胞增殖、分化及逃逸[30]。

本文成功構建了基于細胞焦亡基因的PCa 預后模型，并進行了腫瘤微環境分析，發現了BCL3、BMP2、CCR5、CHI3L2、DLC1、HLA-DQA2、SCGB3A1、SERPINE1、SLC14A19 個細胞焦亡基因，可預測PCa 患者的預后和免疫治療反應，有利于進一步指導臨床實踐。