miRNA-21、白細胞介素-17、缺氧誘導因子-1α在多發性骨髓瘤患者中的表達水平及臨床意義

楊曉煜，朱登勤，龐素蕾，王盼盼，馬若巾，馬云云，宋春鴿

鄭州大學第五附屬醫院血液內科，鄭州 450052

多發性骨髓瘤是一種漿細胞惡性增殖性疾病，其特征為骨髓瘤細胞在骨髓內克隆性增殖及髓外浸潤，臨床主要表現為骨痛、貧血、感染、腎功能不全等[1-2]。目前，多發性骨髓瘤的發病機制尚不明確。有研究認為，細胞遺傳學、造血微環境與骨髓瘤細胞之間的相互作用及多種信號通路等可能與多發性骨髓瘤的發病機制有關[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）在細胞增殖、代謝、分化等過程中發揮重要的調控作用，參與多種腫瘤的發生、發展過程[5]。有研究表明，miRNA-21 在多發性骨髓瘤漿細胞中高表達，其可能通過靶向調控Krüppel 樣因子5（Krüpple-like factor 5，KLF5）的表達促進多發性骨髓瘤細胞增殖[6]。另有研究表明，造血微環境中，白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β等細胞因子在多發性骨髓瘤細胞的增殖及破骨細胞的激活等方面發揮著重要作用[7]。IL-17 也與多發性骨髓瘤的發病過程密切相關[8]。IL-17 是一種促炎因子，可通過信號轉導誘導特定的轉錄因子表達，引起IL-6、IL-1β等炎癥因子表達升高，從而促進骨髓瘤細胞的生長[9]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是在缺氧條件下廣泛存在于人體的一種轉錄因子，可調控細胞增殖、轉移及凋亡，參與腫瘤新生血管的生成過程[10-11]。相關研究顯示，下調HIF-1α的表達可以抑制多發性骨髓瘤細胞的增殖，促使腫瘤細胞凋亡，表明HIF-1α高表達會促進骨髓瘤細胞的增殖[12]。本研究探討miRNA-21、IL-17、HIF-1α在多發性骨髓瘤患者中的表達及臨床意義，以期為多發性骨髓瘤的早期防治提供一定的參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年2 月至2021 年2 月鄭州大學第五附屬醫院收治的多發性骨髓瘤患者。納入標準：①符合《中國多發性骨髓瘤診治指南（2015 年修訂）》[13]中多發性骨髓瘤的診斷標準；②年齡≥18歲；③出院后隨訪2 年；④臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并自身免疫性疾病；③合并全身感染性疾病；④合并其他血液系統疾病；⑤近1 個月內接受過對癥治療；⑥參與其他研究性試驗。依據納入及排除標準，本研究共納入78例多發性骨髓瘤患者作為研究組，其中男42例，女36例；年齡35～68 歲，平均（52.37±7.97）歲；病程2～7 年，平均（4.35±1.02）年；TNM分期：Ⅰ期38例，Ⅱ期24例，Ⅲ期16 例。另選取同期于鄭州大學第五附屬醫院體檢的64 例健康體檢者作為對照組，其中男34 例，女30 例；年齡37～69 歲，平均（53.24±8.04）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測血清miRNA-21 水平采集兩組受試者的空腹靜脈血200 μl，按照試劑盒說明書步驟提取血漿中的總RNA，采用核酸紫外分析儀檢測總RNA 的濃度。將RNA 逆轉錄生成互補DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA 為模板進行PCR 擴增反應。以U6為內參，采用2-△△Ct法計算miRNA-21 的相對表達量。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗檢測血清IL-17、HIF-1α水平 采集兩組受試者的空腹靜脈血3 ml，2500 r/min 離心10 min 后取上清液。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清IL-17、HIF-1α水平。HIF-1α試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。IL-17 試劑盒購自廣州市睿信生物科技有限公司。

1.3 隨訪方法

對78 例多發性骨髓瘤患者隨訪2 年，根據隨訪結果將患者分為預后良好及預后不良，生存為預后良好，死亡為預后不良。隨訪截止時間為2023 年2 月。

1.4 觀察指標及評價標準

①比較兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平。②比較不同預后情況多發性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平。③分析多發性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關性。④分析miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測對多發性骨髓瘤的診斷價值。⑤分析多發性骨髓瘤患者預后的影響因素。⑥分析miRNA-21、IL-17、HIF-1α對多發性骨髓瘤患者預后的預測價值。⑦比較不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達情況多發性骨髓瘤患者的生存情況。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson 相關分析法分析多發性骨髓瘤患者血清miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關性；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計算曲線下面積（area under the curve，AUC），分析miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測對多發性骨髓瘤的診斷價值及對預后的預測價值；采用Cox 風險比例回歸模型分析多發性骨髓瘤患者預后的影響因素；繪制Kaplan-Meier 生存曲線，比較不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達情況多發性骨髓瘤患者的生存情況。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較

研究組患者的血清miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

表1 兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

組別研究組（n=78）對照組（n=64）t值P值miRNA-21 5.03±1.54 2.94±0.68 10.076 0.000 IL-17（pg/ml）28.44±4.47 23.67±4.05 6.598 0.000 HIF-1α（ng/ml）1.38±0.47 0.42±0.13 15.842 0.000

2.2 不同預后情況多發性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較

預后不良多發性骨髓瘤患者血清miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于預后良好患者，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表2）

表2 不同預后情況多發性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

表2 不同預后情況多發性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

預后不良（n=20）良好（n=58）t值P值miRNA-21 5.87±1.65 4.74±1.32 3.091 0.003 IL-17（pg/ml）30.29±3.26 27.80±3.07 3.079 0.003 HIF-1α（ng/ml）1.57±0.29 1.31±0.25 3.848 0.000

2.3 多發性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關性分析

Pearson 相關性分析結果顯示，多發性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平均呈正相關（r=0.447、0.462，P﹤0.05）。

2.4 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測對多發性骨髓瘤的診斷價值

ROC 曲線顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯合檢測診斷多發性骨髓瘤的AUC、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均高于三者單獨檢測。（圖1、表3）

圖1 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測診斷多發性骨髓瘤的ROC曲線

表3 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測對多發性骨髓瘤的診斷價值

2.5 多發性骨髓瘤患者預后的影響因素分析

以miRNA-21、IL-17、HIF-1α為自變量，多發性骨髓瘤患者的預后情況為因變量構建Cox 風險比例回歸模型，結果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α均是多發性骨髓瘤患者預后的獨立危險因素（P﹤0.05）。（表4）

表4 多發性骨髓瘤患者預后影響因素的Cox 風險比例回歸分析

2.6 miRNA-21、IL-17、HIF-1α對多發性骨髓瘤患者預后的預測價值

ROC 曲線顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯合檢測預測多發性骨髓瘤患者預后的AUC、靈敏度、陰性預測值均高于三者單獨檢測。（圖2、表5）

圖2 血清miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測預測多發性骨髓瘤患者預后的ROC曲線

表5 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測對多發性骨髓瘤患者預后的預測價值

2.7 不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達情況多發性骨髓瘤患者生存情況的比較

依據2.6 中miRNA-21、IL-17、HIF-1α的最佳截斷值（5.3、29.8 pg/ml 和1.3 ng/ml）將多發性骨髓瘤患者分為高表達組和低表達組。采用Kaplan-Meier 生存曲線比較兩組患者的生存情況，結果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α高表達組患者的2 年累積生存率均低于低表達組患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（圖3）

圖3 不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達情況多發性骨髓瘤患者的生存曲線

3 討論

多發性骨髓瘤是一種常見的血液系統惡性腫瘤，其發病率呈現逐年上升趨勢且病死率較高，主要表現為骨髓漿細胞異常增生和單克隆免疫球蛋白過度生成，導致免疫缺陷和骨骼破壞[14]。早發現、早防治是改善多發性骨髓瘤患者預后的關鍵。現階段常用的實驗室指標（免疫球蛋白、尿本周蛋白等）對多發性骨髓瘤的診斷及預后預測的靈敏度普遍較低，故探索新的診斷多發性骨髓瘤的生物標志物仍然是臨床研究的重點方向。miRNA 是一種小分子非編碼RNA，與多發性骨髓瘤的發生和發展存在一定相關性。其中miRNA-21 是研究相對較多的miRNA，在多種惡性腫瘤中異常表達[15]。IL-17 是由輔助性T 細胞（helper T cell，Th）17 分泌的促炎因子，通過誘導炎癥因子的表達來促進骨髓腫瘤細胞的生長，在多發性骨髓瘤的發病機制中至關重要[16]。HIF-1α是一種在腫瘤細胞適應缺氧、能量代謝、血管生成、侵襲及轉移過程中發揮重要作用的轉錄因子，在多發性骨髓瘤中高表達[17]。本研究探討miRNA-21、IL-17、HIF-1α在多發性骨髓瘤患者中的表達及臨床意義，結果顯示，研究組患者的miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于對照組，表明多發性骨髓瘤患者的miRNA-21、IL-17、HIF-1α均高表達，提示其可以作為診斷多發性骨髓瘤的生物學標志物。本研究結果還顯示，預后不良多發性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于預后良好患者，進一步提示miRNA-21、IL-17、HIF-1α可以預測多發性骨髓瘤患者的預后。朱廣偉等[18]研究表明，miRNA-21 在多發性骨髓瘤患者中高表達，且其表達水平與患者的血液學指標顯著相關，可以預測患者的預后，這與本研究結果相似。譚昱等[19]研究表明，多發性骨髓瘤患者IL-17的表達明顯上調，且其表達水平與病理分期相關，提示IL-17 可能與多發性骨髓瘤患者的預后存在一定關系，也與本研究結果相似。本研究采用Pearson 相關分析法分析多發性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關性，結果顯示，多發性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平均呈正相關（r=0.447、0.462，P﹤0.05），表明多發性骨髓瘤患者miRNA-21 水平升高，則IL-17 和HIF-1α水平也隨之升高。分析原因可能與miRNA-21 對多發性骨髓瘤患者Th17 細胞功能的調節作用有關，也可能與miRNA-21/程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）、miRNA-21/磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）等信號通路的調節作用有關[20-22]。本研究結果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α均是多發性骨髓瘤患者預后的獨立危險因素，并進一步分析了miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨及聯合檢測對多發性骨髓瘤的診斷價值及對預后的預測價值。ROC 曲線顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯合檢測診斷多發性骨髓瘤的AUC、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均高于三者單獨檢測；miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯合檢測預測多發性骨髓瘤患者預后的AUC、靈敏度、陰性預測值均高于三者單獨檢測。表明miRNA-21、IL-17、HIF-1α三者聯合檢測可較好地診斷多發性骨髓瘤及預測預后。本研究還分析了不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達情況的多發性骨髓瘤患者的生存情況，結果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α高表達組患者的2年累積生存率均低于低表達組患者，提示多發性骨髓瘤患者的miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達水平越高，患者生存率越低，進一步表明miRNA-21、IL-17、HIF-1α能較好地預測多發性骨髓瘤患者的預后。

綜上所述，多發性骨髓瘤患者中miRNA-21、IL-17、HIF-1α 均高表達，且miRNA-21 與IL-17、HIF-1α水平均呈正相關，三者聯合檢測可較好地診斷多發性骨髓瘤及預測預后，有助于臨床及早采取有效的防治措施，改善多發性骨髓瘤患者的預后情況。