間充質干細胞及外泌體對高原腦水腫的潛在作用機制研究進展

張 研, 雷勝男, 張 茜1, , 3, 哈小琴, 馬慧萍,孫海燕, 周士燕1,

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院, 1. 血液科, 5. 全軍高原醫學實驗室, 甘肅 蘭州, 730050;2. 西北民族大學, 甘肅 蘭州, 730106; 3. 甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院, 甘肅 蘭州, 730000;4. 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室, 甘肅 蘭州, 730050)

急性高原病(AMS)是指人群從平原進入高海拔地區或久居高原者進入更高的海拔地區,在數小時內發病,并出現一系列非特異性臨床表現的綜合征,嚴重時可引起多器官應激綜合征,如腦水腫、肺水腫、心力衰竭。AMS的發生和發展與高原地區低壓低氧環境密切相關,尤其是腦組織對缺氧極為敏感。高原腦水腫(HACE)是一種與高原疾病相關的嚴重且致命疾病,屬于重型急性高原病[1-2], 主要臨床表現為頭暈、頭痛、共濟失調、意識模糊等,是AMS的晚期,如治療不及時患者易在發病24 h內死亡。高原地區具有低壓低氧、寒冷干燥、強紫外線等環境特點,使得長期生活在低海拔地區的人迅速進入高原地區時極易發生HACE[3]。

1 間充質干細胞(MSC)、間充質干細胞 來源細胞外囊泡(MSC-EVs)、間充質 干細胞源性外泌體(MSC-Exos)

MSC在組織修復和再生中發揮著重要作用,可誘導血管生成,特別是在缺氧條件下更有利于血管再生,促進受損組織修復。但是缺氧MSC活化的分子機制尚不明確。MSC-EVs可產生與其親本MSC相似的治療效果,因具有免疫原性低、易于儲存、生物安全性高等特點,與全細胞治療相比更具有優勢[4]。MSC-EVs通過向受體細胞遞送微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)和蛋白質傳遞信號,直接發揮細胞、組織修復和再生的作用,避免了干細胞移植療法的許多不良反應[5]。此外,因MSC-EVs不是活細胞, MSC-EVs治療可以解決由存活率低導致的MSC療效差的弊端。MSC-EVs可分為MSC-Exos、細胞微泡和凋亡小體3種類型,其中, MSC-Exos是近年來國內外研究的熱點。MSC、MSC-Exos廣泛應用于醫學各個領域,在再生醫學領域作用尤為突出,目前HACE治療無特效藥,新的防治藥物研發迫在眉睫。MSC、MSC-Exos有望成為防治HACE的新選擇。

2 MSC防治HACE的潛在作用機制

2.1 腦血流量增加及血液-腦屏障(BBB)破壞

在進入高原地區初期,由于缺氧的刺激,機體會產生一系列適應性反應,包括腦血管擴張、通氣量增加和心率加快,以增加腦血流量,從而提供更多的氧氣和營養物質供給大腦。然而,這種腦血流量的增加也會導致血液對血管壁的側壓力增加引起顱內壓升高,顱內壓升高會對血管內皮細胞造成機械性損傷,促進內皮細胞凋亡,最終導致BBB的破壞。BBB是由血管內皮細胞和緊密連接蛋白組成的屏障,作用是將中樞神經系統與外周血液循環分開,阻止有害物質進入大腦[6-7]。缺氧會引起內皮緊密連接蛋白中斷,從而破壞BBB的完整性[8]。此外,缺氧還會導致炎癥反應的產生,從而導致血管壁破壞,使得BBB的屏障功能受損,有害物質可以進入大腦[9]。缺氧還會引起一系列生物化學反應的改變,包括缺氧誘導因子(HIF)-1α的表達和激活以及基質金屬蛋白9的表達和激活。HIF-1α是一種重要的調節因子,可以促進炎癥反應和細胞凋亡的發生,從而導致BBB的破壞。基質金屬蛋白9是一種可以降解血管基底膜的酶,其活化也會導致BBB的破壞。此外,血管內皮細胞還會分泌一系列的細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β等,它們的失衡也會導致BBB的破壞。這些細胞因子還可以促進炎癥反應的發生,進一步加劇BBB的損傷。綜上所述,高原地區缺氧引起的腦血流量增加及BBB的破壞會引發一系列病理生理變化。這些變化通過多種途徑相互作用,最終導致BBB的破壞,使有害物質進入大腦,加速HACE的形成[10]。進一步的研究可以揭示這些途徑的具體機制,為預防和治療高原腦水腫提供新的思路和方法。

以上眾多因素中,內皮細胞損傷是BBB完整性被破壞導致腦水腫的關鍵因素[11-13]。ZHAO B等[14]認為,在急性低壓缺氧(模擬6 000 m高空)環境中脂多糖誘導的大鼠全身炎癥可能會通過破壞BBB完整性和激活小膠質細胞來加重腦水腫。缺氧損傷BBB的內皮細胞,引起細胞外水腫。小膠質細胞是腦組織中一種巨噬細胞,在極化狀態下對維持血BBB的完整性具有雙重作用[15-16]。正常環境下,小膠質細胞維持BBB的完整性,但活化小膠質細胞同時激活分化成M1型、M2型2種形式,M1型具有有害的神經毒性作用, M2型能夠促進組織修復和神經保護,其中M1型介導了HACE的發生[17]。活化的小膠質細胞由于趨化作用被募集到血管中,吞噬血管內皮的緊密連接的同時導致血管通透性增加,進而引起BBB的破壞。研究[18-20]顯示, MSC能夠誘導M2型的產生,進而發揮神經修復及保護作用。骨髓間充質干細胞來源的胞外囊泡通過核因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶途徑促進小膠質細胞M2極化,抑制小膠質細胞M1。MSC抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的產生,減少CD68+小膠質細胞的數量,促進抗炎細胞因子IL-10、轉化生長因子(TGF)-β的合成,從而減輕神經損傷部位內的炎癥。此外,來自人視網膜祖細胞的EVs可以穩定小膠質細胞,以避免其過度活化、遷移和增殖,從而減少炎性細胞因子的分泌,并增加抗炎基因的表達,從而減輕神經炎癥,進而發揮神經保護作用[21]。MSC-EVs的膜富含膽固醇、鞘磷脂、神經酰胺和脂質蛋白,可以通過胞吞、細胞內運輸和囊泡相關膜蛋白(VAMP)-3/Snap23/syntaxin 4依賴性EVs作用穿過BBB來充分發揮療效[22]。

2.2 腦細胞損害

腦耗氧量非常大,對缺氧極為敏感,缺氧導致Na+-K+-ATP酶受損、細胞鈉-鉀泵功能失調,進而影響水分子擴散,使腦細胞腫脹而出現HACE, 每個腦細胞受損程度決定HACE的預后,細胞毒性腦水腫和線粒體自噬引起單個腦細胞受損。ARCHACKA K等[23]發現,將缺氧預處理的骨髓基質細胞(BMSC)移植到受傷的肌肉組織中,血管內皮生長因子(VEGF)高表達進而促進細胞增殖、使肌肉組織再生,這也充分表明缺氧MSC能夠表現出更高的體內組織修復潛力[24]。LIU J等[25]研究顯示,常氧和缺氧嗅黏膜間充質干細胞(OM-MSC)均能降低腦損傷的嚴重程度,但與常氧OM-MSC治療相比,缺氧OM-MSC移植治療腦出血患者移植后14、28 d神經元凋亡顯著減慢,并且缺氧的OM-MSC表現出更高的組織修復及保護能力。此外, MSC的歸巢能力可以使其定向遷移到損傷部位,并分化成受損細胞、組織或分泌有助于組織再生的趨化因子、細胞因子和生長因子。MSC因其組織再生和修復潛力在再生醫學中受到越來越多的關注[26]。綜上所述, MSC對受損的腦細胞及神經細胞有潛在的修復和保護作用,尤其在低氧條件下MSC提高了干細胞存活率,能夠更好地發揮抑制細胞凋亡的作用,為高原低壓低氧環境MSC預防、HACE治療的新藥研發帶來了希望。但高原氣候復雜, MSC在高原地區的有效性還需大量的實驗研究進行驗證。

2.3 自噬

2.3.1 自噬與低氧誘導因子: 缺氧是HACE發生和發展的主要誘因,在缺氧條件下,線粒體以不同的方式調節其代謝,包括交換或修改呼吸鏈的亞基,降低氧化磷酸化、三羧酸(TCA)循環中間體,適應活性氧(ROS)的產生和減少β氧化[6]。線粒體TCA循環中間體參與調節HIF, HIF是生物體缺氧反應調節機制的關鍵調控因子,其家族中含有3個亞型,均是由1個O2敏感的α亞基(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)和1個O2不敏感的β亞基(HIF-1β)組成的異二聚體結構,也被稱為芳基烴受體核轉位器[8]。HIF參與機體的血管生成、紅細胞產生、細胞代謝以及自噬的發生和發展,還與小膠質細胞活化和神經元損傷密切相關[27]。HIF-1α是缺氧時基因表達的關鍵轉錄調節因子,并且對神經元細胞有保護及修復的作用[28]。因此, HIF-1α的研究也成為近年來學術界關注的焦點, MSC進行細胞治療是一種很有前景的治療策略。SHI Y等[29]發現, MSC通過HIF-1α/TGF-β1/SMAD途徑促進促血管生成、組織修復,表明HIF-1α修飾的MSC是一種防治HACE很有前景的新方案。

2.3.2 自噬與鐵死亡: 自噬是一種保護機制,通過將細胞內的有害或過剩物質包裹在囊泡中,然后與溶酶體融合,將其降解并釋放出來,在清除有害物質的同時抑制ROS的產生,維持內環穩定。低氧環境中線粒體功能受損,進而破壞細胞代謝穩態,導致ROS產生過量、細胞死亡[30]。細胞死亡一般被分為意外細胞死亡和調節性細胞死亡。鐵死亡是一種新發現的調節性死亡,是指細胞內鐵離子的過度積累導致細胞死亡的現象。過量的鐵離子可以引發細胞內的氧化應激,導致細胞膜的脂質過氧化、蛋白質的氧化損傷和DNA的損傷,最終導致細胞死亡。在鐵死亡過程中,自噬可能參與調節鐵離子的平衡,清除過量的鐵離子,減輕氧化應激和細胞損傷,從而保護細胞受到鐵死亡的影響。MSC、MSC-Exos通過SIRT1/Nrf2/HO-1通路、SLC7A11/GPX4信號通路抑制鐵死亡,進而對組織臟器發揮保護作用[31]。

在高原環境中線粒體存在過度自噬現象,這一現象可能介導了急性高原低氧期海馬神經元的損傷。HU Z等[32]認為, MSC-Exos通過促進叉頭蛋白3a(FOXO3a)的表達使線粒體自噬增強,從而保護小膠質細胞免受細胞焦亡的影響,以此減輕低氧對神經元的損傷。低氧時由HIF-1α-HMOX1軸介導的ROS產生的自噬活化和調節作用使MSC的生物學活性增強[33]。胡璐璐等[34]認為,在高原缺氧環境下腸黏膜上皮細胞自噬的調節過程,可能對腸黏膜有保護作用。線粒體自噬還可促進BMSC的增殖和分化,并保護其免受氧化應激損傷[14]。MSC通過調節受損組織、器官中細胞自噬的能力進而參與受損組織和器官的再生[35]。因此,MSC能夠調節靶細胞自噬的機制,反過來自噬又會影響MSC的治療特性。綜上所述,MSC、MSC-Exos可能通過抑制鐵死亡及調節自噬的途徑對HACE發揮藥用價值,但上述過程還需要大量的數據加以佐證。

2.4 炎癥反應

免疫反應及炎癥反應失調參與了HACE的發生和發展[36]。小膠質細胞是存在于中樞神經系統實質中的唯一免疫細胞,因此在促炎細胞因子、損傷和氧化應激等環境中小膠質細胞會被激活[37-38]。在缺血的早期階段,激活的小膠質細胞吞噬作用有利于維持細胞穩態、清除細胞廢物和減少炎癥反應。然而,持續性缺血、缺氧小膠質細胞過度活化,會誘導內皮損傷[39-40]。NF-κB和TFAM通路能夠促進缺氧小膠質細胞的炎癥反應,從而使水通道蛋白4(AQP4)誘導星形膠質細胞腫脹。在腦出血模型中發現MSC-EVs, 說明MSC、MSC-Exos歸巢到受傷的組織和炎癥部位[41]。缺氧環境下, MSC、MSC-Exos可能通過NF-κB和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)信號通路抑制T細胞分泌IFN-γ, 以發揮免疫調節作用預防炎癥反應,增強受損細胞的修復和再生[42-43]。MSC還參與減輕炎癥免疫細胞的自噬來抑制炎癥反應[44]。

2.5 氧化應激

低壓缺氧環境引發的氧化應激導致人體的多個器官功能受損,尤其是大腦和心臟[45]。氧化應激誘導脂質氫過氧化物水平升高和自由基產生進而導致BBB血管損傷,加速了HACE的發生和發展,而且缺氧誘導的氧化應激會導致內質網功能障礙,促進炎癥反應[46]。BAILEY D M等[47]也證實,高海拔地區居民認知能力的下降和抑郁的產生與氧化應激和炎癥有關。MSC因其強大的分化潛能、免疫調節作用和抗氧化應激而被廣泛應用于細胞治療和組織工程領域[48]。氧化應激是不受控制的ROS產生和抗氧化劑水平不足的結果,MSC可能通過TGF-β/Smad途徑下調miR-486-5p、上調PIM1以減輕氧化應激損傷,因此MSC具有抗氧化應激作用[49]。通過調節ROS產生、自噬可以介導MSC保持較高細胞活力,這表明自噬活化、氧化應激與MSC之間相互作用[33, 50]。因此,高原地區輸注MSC能夠更有效地發揮MSC功能。抗氧化治療可能是減輕HACE嚴重程度的重要策略,因此, MSC的抗氧化應激的作用為治療HACE提供了理論支持。

3 小 結

雖然HACE發生率低,但其病情兇險,病死率高,目前針對HACE的治療藥物種類有限且無特效藥,迫切需要更切實有效的防治措施。MSC、MSC-Exos可促進急性器官損傷后的細胞增殖并抑制細胞凋亡和炎癥反應, MSC和MSC-Exos療法已成功應用于多種急慢性疾病的治療,如慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征和特發性肺纖維化、急性心肌梗死、急性肝損傷、急性重癥胰腺炎、急性腎損傷和急/慢性移植物抗宿主病[51]。此外, MSC和MSC-Exos療法的安全性、有效性和多功能性已經得到充分證實[52]。動物模型試驗發現, MSC、MSC-Exos療法在神經相關疾病如癲癇、帕金森病、腦卒中、短暫性腦缺血發作和急性脊髓損傷中也具有良好的效果。MSC來源廣泛、致瘤性低且無倫理束縛,被認為是治療疾病的理想選擇,但因細胞準備期和細胞移植時間長,很難用于暴發性疾病患者[53]。此外, MSC和MSC-Exos在體內可能會被快速清除,從而限制其長期治療效果。國際干細胞建議使用液氮(-196 ℃)進行冷凍干細胞儲存、運輸,在進行儲存及運輸時存在著成本高、運輸困難的問題。MSC可以在4 ℃培養基中保存14 d, 并且其生物學特性及功能不受影響,但非冷凍運輸方式不方便[54]。通常情況下,體外擴增會降低DNA聚合酶和修復能力,從而導致DNA損傷積累,降低天然BMSC的遺傳穩定性,進而導致細胞異常增殖和功能改變,甚至可能引發腫瘤,臨床級的MSC、MSC-Exos在生產、儲存、運輸過程中嚴格控制質量,要求理化性質及生物學特性比較穩定[55]。MSC療法是相對較新的治療,其長期安全性、有效性以及潛在風險尚缺乏了解。生產設備、收集方法、培養條件、供體之間的差異,使得生產的MSC、MSC-Exo也很難滿足標準要求,因而MSC的臨床應用仍然十分有限。總的來說,MSC療法在治療高原疾病方面表現出潛在的益處,但也存在一定風險, MSC和MSC-Exos防治HACE還需要大量的臨床試驗數據對結果進行支持。