骨髓脂肪細胞因子與骨髓增生異常綜合征的相關(guān)性研究*

李遇春 王軍亮 王靖宇 李揚威 辛雅萍 呂曉東

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是起源于造血干細胞的一組高度異質(zhì)性髓系腫瘤，有較高的轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的風險，可作為白血病前期進展為臨床白血病的連續(xù)過程，因此是研究白血病發(fā)生和進展病理機制較好的研究模型。MDS 一直被認為是一種基因病，是由調(diào)控細胞增殖、凋亡和代謝的關(guān)鍵基因突變累積引起的疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，約80%的MDS 患者可檢測出突變基因，突變的發(fā)生存在高度異質(zhì)性和多樣性[1-2]。而相同的MDS 表型伴隨不同的突變基因，提示突變基因可能是更深層次原因的結(jié)果，而非MDS 發(fā)生進展的主要原因。

越來越多的研究提示，腫瘤細胞的代謝異常不僅是腫瘤的一個特征，也可能是腫瘤的潛在原因[3]，多數(shù)癌基因或抑癌基因的功能是維持腫瘤異常的代謝狀態(tài)。骨髓微環(huán)境是MDS 細胞發(fā)生的始動因素和賴以生存的環(huán)境，脂肪細胞是其重要組成部分，可通過分泌脂肪細胞因子如脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）、瘦素（leptin，LEP）、內(nèi)臟脂肪素（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）、降脂素（complement factor D，CFD）和人補體C1q 腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白1（C1q/TNF-related protein 1，CTRP1）等，參與正常造血，其與血液腫瘤的發(fā)生及治療關(guān)系密切[4]。本研究根據(jù)88 例MDS患者骨髓脂肪細胞因子水平及伴隨突變基因，結(jié)合臨床特征和生存信息，進一步評估骨髓微環(huán)境中脂肪細胞因子水平與MDS 發(fā)生、進展及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2020 年2 月至2022 年2 月鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院治療的72 例初診MDS（81.8%）患者和16 例MDS 繼發(fā)急性髓系白血病（secondary acute myeloid leukemia，sAML）（18.2%）患者的臨床資料。88 例患者中，男性51 例，女性37 例，中位年齡52（38～63）歲。納入標準：1）初發(fā)未治療的MDS 患者；采用MDS 中國診斷與治療指南（2019 年版）進行診斷和分型，根據(jù)MDS 修訂國際預(yù)后積分系統(tǒng)（IPSSR）進行評分與分組；2）性別、發(fā)病年齡、血常規(guī)計數(shù)資料、骨髓原始細胞比例、染色體結(jié)果等重要資料完整者。排除標準：1）妊娠或哺乳期患者；2）合并自身免疫性疾病患者；3）合并其他血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤患者。該研究經(jīng)過本院倫理委員會批準（批號：2020-KY-0090-001），并且全部患者及家屬均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理 于髂后或髂前上棘局部麻醉后抽吸骨髓液5 mL，EDTA 抗凝，2 000 轉(zhuǎn)/分離心后，分離骨髓上清液。剩余樣本，采用天根血液基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，經(jīng)微量分光光度計NanoDrop 2000 定量，樣本保存于-20℃冰箱待測。

1.2.2 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測脂肪細胞因子 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測骨髓上清液中的脂肪細胞因子，如ADP、LEP、NAMPT、CFD 和CTRP1。使用“Curve Expert”軟件制作標準曲線，根據(jù)樣本OD 值，計算脂肪細胞因子濃度。使用X-tile 軟件對患者進行脂肪因子表達水平分組。

1.2.3 高通量測序靶向檢測基因突變 使用探針捕獲78 種髓系腫瘤的熱點基因，采用Illumina Next Seq500測序平臺進行測序。測序后數(shù)據(jù)利用人基因組數(shù)據(jù)庫（HG19），COSMIC、1 000 genomes 和dbSNP等數(shù)據(jù)庫進行分析。平均基因覆蓋率＞99%，平均測序深度為1 500×，目標區(qū)域測序深度超過1 000×，檢測靈敏度1%。

1.2.4 染色體核型分析 骨髓細胞經(jīng)過24 h 培養(yǎng)，收集細胞制片，采用常規(guī)R 顯帶技術(shù)進行核型分析，根據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2013）》進行描述。

1.2.5 治療 依據(jù)患者年齡、IPSS-R 預(yù)后分層、依從性等進行評價，選擇治療方案。88 例患者中，20 例（22.7%）接受單純支持治療，12 例（13.6%）接受免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑治療，36 例（40.9%）接受去甲基化藥物治療，8 例（9.1%）接受化療，8 例（9.1%）接受異基因造血干細胞移植，4 例（4.5%）接受中藥制劑治療。

1.2.6 隨訪 上述病例通過電話溝通及查閱門診及住院電子病例的方式對患者進行隨訪，并記錄患者疾病進展情況及生存結(jié)局，隨訪時間截至2023 年4 月，并計算患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）及總生存期（overall survival，OS）。隨訪患者中，失訪2 例（2.3%），中位隨訪時間19（1～37）個月。PFS 定義為MDS 診斷之日至進展、復(fù)發(fā)或死亡的日期。OS 定義MDS 為診斷之日至死亡或隨訪截止日期。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用t檢驗或非參數(shù)秩和檢驗進行比較，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗進行比較。Spearman或Pearson 相關(guān)分析檢驗變量相關(guān)性。采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，Cox 比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料

88 例患者外周血結(jié)果顯示，血紅蛋白（HGB）中位數(shù)為83.0（69.0～103.3）g/L，中性粒細胞計數(shù)（ANC）中位數(shù)為1.3（0.7～3.1）×109/L，血小板（PLT）中位數(shù)為51.0（26.0～150.8）×109/L，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）中位數(shù)為23.2（21.5～26.0）kg/m2。其他項目，見表1。

表1 患者臨床特征

2.2 骨髓脂肪細胞因子表達水平分析

骨髓脂肪細胞因子與臨床特征分組結(jié)果分析，性別相關(guān)結(jié)果顯示，男性ADP 和LEP 水平［ADP：6.67（2.73～18.32）μg/mL；LEP：0.30（0.16～0.69）ng/mL］分別較女性［ADP：13.12（7.53～24.18）μg/mL；LEP：0.57（0.19～1.45）ng/mL］顯著降低（P=0.027，P=0.019），見圖1A，1B。

圖1 骨髓脂肪細胞因子表達水平分析

年齡相關(guān)結(jié)果顯示，年齡＜65 歲患者的ADP、CFD和NAMPT 水平［ADP：7.88（3.41～17.62）μg/mL；CFD：1.30（0.78～2.20）μg/mL；NAMPT：0.78（0.56～1.59）ng/mL］較年齡≥65 歲患者［ADP：17.60（5.77～29.86）μg/mL；CFD：2.43（1.73～4.83）μg/mL；NAMPT：1.37（1.02～4.37）ng/mL］顯著降低（P=0.020，P＜0.001，P=0.021）。而年齡＜65 歲患者的LEP 水平0.45（0.20～1.11）ng/mL，較年齡≥65 歲患者0.27（0.12～0.49）ng/mL 顯著升高（P=0.043），見圖1C～1F。

BMI 相關(guān)結(jié)果顯示，BMI＜24 kg/m2患者的ADP水平［12.07（4.75～24.71）μg/mL］較BMI≥24 kg/m2患者的［6.55（2.73～15.06）μg/mL］顯著升高（P=0.025），然而BMI＜24 kg/m2患者的LEP 水平［0.32（0.16～0.67）ng/mL］較年齡≥24 歲患者的0.56（0.24～1.21）ng/mL 顯著降低（P=0.020），見圖1G，1H。

原始細胞比例相關(guān)結(jié)果顯示，升高組（原始細胞≥5%）的NAMPT 水平1.36（0.68～3.16）ng/mL 較無原始細胞升高組0.78（0.50～1.48）ng/mL 顯著升高（P=0.037），見圖1I。疾病類型分組結(jié)果顯示，MDS組的CTRP1 水平0.09（0.02～0.21）ng/mL 較sAML組0.04（0.01～0.05）ng/mL 顯著升高（P=0.010），見圖1J。其余脂肪細胞因子各組間差異均無統(tǒng)計學意義。

2.3 骨髓脂肪細胞因子與MDS 基因突變分析

70 例患者髓系血液腫瘤熱點基因突變結(jié)果顯示，共檢測到35 種突變基因，其中45 例64.3%（45/70）患者檢出至少1 個基因突變，突變基因頻率最高的為RUNX1 12 例（13.0%），其余突變檢出率依次為U2AF 19 例（9.8%），TET 25 例（5.4%），TP5 35 例（5.4%），NPM 15 例（5.4%），EVT 64 例（4.4%），NRAS 4 例（4.4%），SETBP 14 例（4.4%），SRSF 24 例（4.4%），ASXL 14 例（4.4%）。突變基因依據(jù)其功能進行分類，按突變頻率高低依次排列，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因31 例（33.7%），表觀遺傳相關(guān)基因24 例（26.1%）、剪接子相關(guān)基因13 例（14.1%）、信號傳導(dǎo)相關(guān)基因12 例（13.0%）、細胞周期與凋亡相關(guān)基因12 例（13.0%）。

45 例基因突變陽性患者中，發(fā)生1 個基因突變16 例（35.6%），2 個基因突變15 例（33.3%），3 個基因突變10 例（22.2%），4 個及以上基因突變4 例（8.9%）。

脂肪細胞因子與突變基因功能分類的相關(guān)分析顯示，CTRP1 水平的升高與表觀遺傳相關(guān)異常基因的發(fā)生呈正相關(guān)（CTRP1：γ=0.252，P=0.001），CTRP1 水平與TET2 和U2AF1 的發(fā)生呈正相關(guān)（TET2：γ=0.416，P＜0.001；U2AF1：γ=0.251，P=0.036），ADP 和CFD 水平分別與NPM1 的發(fā)生呈正相關(guān)（ADP：γ=0.237，P=0.048；CFD：γ=0.265，P=0.026），見圖2。

圖2 骨髓脂肪細胞因子與MDS 基因突變等因素相關(guān)性分析

2.4 骨髓脂肪細胞因子與患者預(yù)后的關(guān)系

86 例隨訪患者，中位PFS 時間15.4（95%CI：13.1～17.6）個月，中位OS 時間22.3（95%CI：15.4～29.2）個月。根據(jù)患者一般情況（年齡、性別和BMI），疾病特征［ANC、HGB、PLT、血細胞減少系數(shù)、染色體核型、原始細胞比例分組和修訂的國際預(yù)后積分系統(tǒng)（IPSS-R）預(yù)后評分］、高頻突變基因（RUNX1、U2AF1、TET2、TP53、NPM1）、脂肪細胞因子（CTRP1、LEP、ADP、CFD 和NAMPT）進行單因素生存分析。結(jié)果顯示，較高危（IPSS-R＞3.5 分）（P=0.001）、RUNX1+（P=0.002）、TP53+（P=0.001）、LEP＜0.2 ng/mL（P=0.001）、NAMPT ≥2.1 ng/mL（P=0.027）、原始細胞5%～20%（P＜0.001）、TET2-（P=0.02）、CTRP1＜0.1 ng/mL（P=0.041）與較差的PFS 相關(guān)。而較高危（IPSSR＞3.5 分）（P=0.01 ）、RUNX1+（P=0.001 ）、TP53+（P=0.001）、LEP＜0.2 ng/mL（P＜0.001）、NAMPT≥2.1 ng/mL（P=0.024）、原始細胞≥20%（P＜0.001）、NPM1+（P=0.045）和CFD ≥2.9 μg/mL（P=0.032）與較差的OS 相關(guān)。

將單因素分析中P＜0.05 的獨立因素納入多因素Cox 回歸模型。對于PFS，將P＜0.05、相互獨立且相互之間不存在多重共線性（VIF＜5）的變量，原始細胞比例、RUNX1、TET2、TP53、LEP、NAMPT、CTRP1納入多因素Cox 回歸分析。結(jié)果顯示RUNX1 陽性（HR=2.323，95%CI：1.076～5.017，P=0.032）、原始細胞5%～20%（HR=6.829，95%CI：2.700～17.272，P＜0.001）、LEP＜0.2 ng/mL（HR=3.238，95%CI：1.529～6.853，P=0.002）是MDS 患 者PFS 的危險因素。NAMPT＜2.1 ng/mL（HR=0.459，95%CI：0.216～0.977，P=0.043）是MDS 患者PFS 的保護因素，見圖3A。

圖3 影響OS 和PFS 的多因素分析

對于OS，同上將原始細胞比例、RUNX1、TP53、NPM1、LEP、NAMPT、納入多因素Cox 回歸分析。結(jié)果顯示RUNX1 陽性（HR=2.778，95%CI：1.266～6.097，P=0.011 ）、TP53 陽 性（HR=6.182，95%CI：1.583～24.138，P=0.009）、LEP＜0.2 ng/mL（HR=4.145，95%CI：1.872～9.179，P＜0.001）、原始細胞≥20%（HR=4.183，95%CI：1.808～9.678，P=0.001）是MDS患者OS 的獨立危險因素，見圖3B。

3 討論

腫瘤的發(fā)生依賴于細胞代謝重編程，而細胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的改變與腫瘤微環(huán)境、基因異常和腫瘤細胞分化關(guān)系密切[3]。骨髓脂肪細胞因子是骨髓造血微環(huán)境中的脂肪細胞衍生的代謝物和生物活性肽。本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓脂肪細胞因子水平與MDS 患者性別、年齡以及BMI 關(guān)系密切。既往研究結(jié)果提示，不同性別間存在脂肪細胞因子水平差異，女性LEP 水平高于男性[4-5]。在年齡相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，ADP 水平隨著年齡的增長而增加，而LEP 水平隨著年齡的增長而下降[6]。且脂肪細胞因子水平與BMI 指數(shù)關(guān)系密切，其中ADP與總脂肪量呈反比[7]，而LEP 呈正比[8]。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果相近，但既往研究多數(shù)分析外周血或組織中脂肪因子水平，而骨髓微環(huán)境中脂肪細胞因子水平更適于分析其與血液腫瘤發(fā)生及進展間的關(guān)系。

在與MDS 基因異常分析中發(fā)現(xiàn)，CTRP1 表達與表觀遺傳類相關(guān)基因突變（TET2）和U2AF1 突變（RNA 剪切相關(guān)基因）的發(fā)生呈正相關(guān)。CTRP1 是CTRP 家族成員之一，主要在脂肪組織中表達，是代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)，CTRP1 的表達有助于NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進肺癌和結(jié)腸癌進展，且CTRP1高表達與肺癌、胃癌和腎癌的預(yù)后不良相關(guān)[10-11]。此外，CTRP1 高表達可通過調(diào)節(jié)p53 基因促進人類腫瘤細胞（大腸癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、肺癌細胞和胚胎腎細胞）生長[12]。上述結(jié)果提示，CTRP1 可促進實體腫瘤進展且與預(yù)后不良有關(guān)，但鮮見CTRP1在血液腫瘤中的相關(guān)研究。TET2 編碼一種甲基胞嘧啶雙加氧酶，可促進DNA 去甲基化，有助于骨髓生成的表觀遺傳調(diào)節(jié)，其突變可影響造血干細胞/祖細胞的分化及增殖過程[13-14]。而動物實驗也證實，TET2 突變小鼠可發(fā)展為與人MDS 相似的髓系惡性腫瘤[15]。U2AF1 突變可導(dǎo)致RNA 剪接發(fā)生錯誤，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前鮮見CTRP1 與TET2、U2AF1 間的相關(guān)研究，但有研究發(fā)現(xiàn)造血細胞因子可磷酸化TET2，導(dǎo)致其在紅系祖細胞中的激活[16]。本研究提示TET2 等基因突變的出現(xiàn)，可能是骨髓微環(huán)境中脂肪細胞因子變化（如CTRP1）的適應(yīng)性改變，與MDS的發(fā)生及進展關(guān)系密切，但相關(guān)機制仍需要在未來的研究中進一步闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT 在≥65 歲患者和原始細胞≥5%患者的骨髓微環(huán)境中明顯升高，且預(yù)后相關(guān)多因素分析提示骨髓NAMPT 低表達是MDS 患者預(yù)后生存的保護因素。NAMPT 是一種已知可調(diào)節(jié)惡性腫瘤細胞生長、凋亡和血管生成的分泌性脂肪因子[17]。已被發(fā)現(xiàn)在肝癌[18]、大腸癌[19]等多種實體腫瘤中高表達且與不良預(yù)后相關(guān)。在血液腫瘤中，已被證實在多發(fā)性骨髓瘤患者的血清或者組織中高表達[20]。Cagnetta 等[21]發(fā)現(xiàn)，硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤患者中，NAMPT 高表達與不良預(yù)后相關(guān)。此外，NAMPT 抑制劑FK866 和硼替佐米聯(lián)用可增強NAD+消耗，激活caspase 3、caspase 8、caspase 9 和ADP 核糖聚合酶，從而產(chǎn)生誘導(dǎo)細胞凋亡的協(xié)同效應(yīng)，增加骨髓瘤細胞對硼替佐米的敏感性。Bong 等[22]也證實，在多發(fā)性骨髓瘤細胞中通過特異性siRNA 敲除NAMPT 可抑制增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。但NAMPT 在MDS 中的作用鮮見報道。綜上提示，NAMPT 高表達可能參與到MDS 的發(fā)生和進展，其表達水平可提示患者預(yù)后。

本研究MDS 患者預(yù)后分析中，LEP＜0.2 ng/mL是MDS 患者PFS 和OS 的獨立危險因素。LEP 是脂肪細胞產(chǎn)生的多能細胞因子[23]。有研究發(fā)現(xiàn)其具有促腫瘤作用，當骨髓瘤細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)時，LEP可激活A(yù)KT/STAT3 通路，增加Bcl-2 水平，抑制caspase 3 酶活性，抑制腫瘤細胞凋亡，進而導(dǎo)致骨髓瘤化療耐藥，并增強骨髓瘤細胞的增殖和遷移能力[24]。LEP 也可通過MAPK/ERK1/ERK2 和PI3K 等信號通路，激活髓系和淋系腫瘤細胞的相關(guān)受體，刺激細胞增殖和細胞因子分泌，并抑制細胞凋亡[25]。但也有部分研究發(fā)現(xiàn)LEP 在腫瘤中的發(fā)揮抑制作用。血清LEP 水平與乳腺癌發(fā)病風險呈負相關(guān)[26]，并可通過p38-MAPK 依賴性信號通路抑制體外肝癌細胞生長[27]。此外，低LEP 水平也與胰腺內(nèi)分泌腫瘤相關(guān)[28]。脂肪細胞中LEP 的合成及分泌受能量代謝平衡、胰島素水平、微環(huán)境炎癥狀態(tài)等多因素影響[29]。結(jié)合以往研究提示，在MDS 發(fā)生過程中，LEP 可能發(fā)揮腫瘤抑制作用，低LEP 水平可能參與MDS 的疾病進展。

綜上所述，骨髓微環(huán)境中的脂肪細胞因子，與MDS 患者一般特征、基因突變以及患者預(yù)后均密切相關(guān)，提示其在MDS 發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用，為進一步研究骨髓微環(huán)境脂代謝重編程在血液腫瘤發(fā)病中的作用提供借鑒。

本文無影響其科學性與可信度的經(jīng)濟利益沖突。