升麻素通過NF-κB通路對支氣管上皮細胞過敏性炎癥反應的抑制作用

陳俊杰 楊道文 （.北京中醫(yī)藥大學，北京 0009；.中日友好醫(yī)院中醫(yī)肺病一部，北京 0009）

哮喘是一種常見的以氣道炎癥、嗜酸性粒細胞增多、黏液過度分泌、氣道重塑、氣道高反應性為主要特征的慢性炎癥性疾病，其患病率在全球范圍內(nèi)迅速上升［1-2］。哮喘作為一種復雜的疾病，其發(fā)病機制與遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用有關(guān)［3］。過敏性哮喘是最常見的哮喘表型，常見過敏原包括塵螨、花粉、香料等［4-5］。皮質(zhì)類固醇和β2受體激動劑的治療常伴有一系列不良反應并加重病情［6］。因此，開發(fā)新的治療藥物對于延緩哮喘進展、避免哮喘發(fā)作有重要意義。我國傳統(tǒng)中藥材防風具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理活性。YAO等［7］研究提示，黃芪防風可抑制過敏性哮喘氣道重塑。同樣，防風的主要成分升麻素（圖1）在過敏性炎癥中發(fā)揮抑制作用［8-9］。然而，升麻素在過敏性哮喘中的作用機制還未可知。

圖1 升麻素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of cimifugin

核因子-kappaB （nuclear factor-kappaB，NF-κB）是應對損傷或感染免疫和炎癥過程的主要調(diào)節(jié)因子［10］。有研究表明，NF-κB通路在哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［11-12］。然而，關(guān)于升麻素與NF-κB信號通路在哮喘發(fā)病機制中的關(guān)系探究卻鮮有報道。鑒于此，本研究重點探討升麻素對過敏性哮喘體外模型的具體影響并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 人支氣管上皮細胞系BEAS-2B由美國菌種保藏中心提供；DMEM培養(yǎng)基（11965092）、胎牛血清（FBS；10099141C）購自美國Gibco公司；屋塵螨（house dust mite，HDM；XPB82D3A2.5）購自北京博蕾德生物科技有限公司；升麻素（B21156）和地塞米松（dexamethasone，Dex；B25793）購自上海源葉生物科技有限公司；MTT試劑（C0009S）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑（KGA-701）購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA試劑盒（PC0020）、RIPA裂解液（R0010）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源Bcl-2（B cell lymphoma-2；ab32124）、Bax（Bcl-2-associated X；ab32503）、cleaved caspase-3（ab32042）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS；ab178945）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2；ab179800）、閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1；ab276131）、閉合蛋白（Occludin；ab216327）、緊密連接蛋白-4（Claudin-4；ab210796）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα；ab32518）、NF-κB p65（ab207297）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65；ab239882）、GAPDH抗體（ab9485）、山羊抗兔IgG-FITC（ab6717）、Alexa Fluor?594偶聯(lián)的二抗（ab150080）、IL-6（ab178013）、IL-1β（ab214025）和TNF-α試劑盒（ab181421）均購自美國Abcam；化學發(fā)光超敏顯色試劑盒（36208ES 60）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Transwell小室購自美國BD公司、FITC標記葡聚糖4 kDa（MS0901-0050MG；上海懋康生物科技有限公司）；分光光度計（上海美谷分子儀器有限公司）；伏特歐姆計（美國默克公司）；Varioskan熒光酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.1.2 實驗細胞株 人支氣管上皮細胞系BEAS-2B常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下進行孵育。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 分別用濃度為0.01、0.1、1、10 μmol/L的升麻素處理長滿單層的BEAS-2B細胞24 h，并設(shè)不加升麻素的空白對照組（Control）以及升麻素0.01、0.1、1和10 μmol/L組檢測升麻素對BEAS-2B細胞的最大無毒濃度。依據(jù)文獻對細胞分別進行不同濃度升麻素（0.01、0.1、1 μmol/L）或1 μmol/L Dex處理［13-14］。利用HDM建立過敏性哮喘體外模型［15］。將細胞暴露于300 ng/ml HDM中培養(yǎng)24 h。細胞分為空白對照組（Control）、HDM組、HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組，檢測藥物對暴露在HDM環(huán)境中BEAS-2B細胞活力的影響。實驗獨立重復3次。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 將BEAS-2B細胞接種于96孔板中進行培養(yǎng)（2×103個/孔）。經(jīng)升麻素或Dex處理后，將細胞暴露于HDM下，每孔加入10 μl 5%MTT試劑，37 ℃下孵育4 h。分光光度計檢測570 nm處吸光度值，每組設(shè)6個復孔。

1.2.3 TUNEL染色檢測細胞凋亡 經(jīng)升麻素或1 μmol/L Dex處理后，將暴露于HDM的BEAS-2B細胞接種于6孔板，利用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100分別對細胞進行固定和透化處理，添加TUNEL檢測液，嚴格按試劑盒說明書實驗步驟37 ℃避光反應45 min，采用DAPI對細胞核進行染色。熒光顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞凋亡情況。凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 Western blot 采用BCA試劑盒檢測RIPA裂解液提取的蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離等量蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并在5%脫脂牛奶中室溫封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜后，洗膜后再用HPR標記的羊抗兔二抗于室溫下孵育。加入化學發(fā)光超敏顯色試劑盒對蛋白條帶進行顯影，利用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）記錄灰度值，分析Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3/pro-caspase 3、ZO-1、Occludin、Claudin-4及iNOS、COX-2蛋白濃度。

1.2.5 ELISA檢測炎癥因子水平 向BEAS-2B細胞中加入細胞裂解液，充分裂解細胞，3 500 r/min離心5 min，取上清液，按照ELISA劑盒說明書檢測上清液中BEAS-2B細胞IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.2.6 TEER檢測上皮完整性 依據(jù)文獻［14］以3×105個/孔將細胞接種于Transwell室，并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞在聚碳酯膜上生長、分化，形成連續(xù)的單細胞層。培養(yǎng)細胞4～6 d至完全融合后，使用伏特歐姆計測量TEER值，確定細胞單層的緊密與完整性。當測定的TEER值達到穩(wěn)定后3 d或4 d，按照1.2.1實驗分組處理細胞，24 h后，測量TEER值。

1.2.7 FD-4評估細胞單層膜的滲透性 依據(jù)文獻［14］將細胞以3×105個/孔接種于Transwell室內(nèi)，形成單層膜細胞后，將10 μl FD-4（10 mg/ml）添加到上室，避光孵育2 h后，使用Varioskan熒光酶標儀檢測Transwell底層小室熒光強度（激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為520 nm）。

1.2.8 免疫熒光檢測NF-κB核易位 利用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100分別對處理后的BEAS-2B細胞進行固定和透化處理。經(jīng)5%牛血清白蛋白封閉后，25 ℃下與兔源NF-κB抗體孵育過夜，并與Alexa Fluor?594偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h。PBST洗滌后，DAPI于25 ℃下對細胞進行復染，并通過熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析 本研究采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析處理，實驗結(jié)果表示為±s，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 升麻素增強HDM誘導的BEAS-2B細胞活力與對照組相比，0.01、0.1、1 μmol/L升麻素對細胞活性無顯著影響；升麻素處理濃度為10 μmol/L時，細胞活性顯著下降（P＜0.05，圖2A）。由此，選擇0.01、0.1、1 μmol/L無毒濃度升麻素進行后續(xù)實驗。為驗證升麻素對過敏性哮喘的影響，BEAS-2B細胞經(jīng)HDM誘導后，成功建立過敏性哮喘體外模型。與對照組相比，HDM暴露顯著降低細胞活力（P＜0.001）；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組細胞活力顯著提高，且呈濃度依賴性（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖2B）。

圖2 不同濃度升麻素對BEAS-2B細胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of cimifugin on viability of BEAS-2B cells

2.2 升麻素抑制HDM誘導的BEAS-2B細胞凋亡與對照組相比，HDM暴露導致細胞凋亡率顯著升高；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組凋亡細胞數(shù)目顯著減少，且呈濃度依賴性（P＜0.001，圖3A）。此外，與對照組相比，HDM組抗凋亡Bcl-2表達下調(diào)，促凋亡Bax、Cleaved-caspase 3/pro-caspase 3表達上調(diào)（P＜0.001）；HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組較HDM組Bcl-2表達呈濃度依賴性增加，Bax、Cleaved-caspase 3/pro-caspase 3表達呈濃度依賴性下降（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖3B）。

圖3 升麻素降低HDM誘導的BEAS-2B細胞凋亡Fig.3 Cimifugin reduced HDM-induced apoptosis of BEAS-2B cells

2.3 升麻素抑制HDM誘導的BEAS-2B細胞分泌炎癥因子 與對照組相比，暴露于HDM的BEAS-2B細胞炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著提高（P＜0.001）；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組IL-6、IL-1β、TNF-α水平均呈濃度依賴性下降（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖4A）。與對照組相比，HDM組iNOS、COX-2蛋白水平明顯升高（P＜0.001）；HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組較HDM組iNOS、COX-2蛋白水平顯著降低，且顯示出量效關(guān)系（P＜0.01或P＜0.001，圖4B）。

圖4 升麻素抑制HDM誘導的BEAS-2B細胞炎癥反應Fig.4 Cimifugin suppressed HDM-induced inflammatory response in BEAS-2B cells

2.4 升麻素對HDM誘導的BEAS-2B細胞屏障保護作用 與對照組比較，HDM刺激導致BEAS-2B細胞TEER值顯著降低，F(xiàn)D-40通量升高（P＜0.001），提示HDM誘導單層BEAS-2B細胞通透性增加，細胞屏障功能受損；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組TEER值濃度依賴性升高，F(xiàn)D-40通量濃度依賴性減少（P＜0.001，圖5A、B）。與對照組比較，HDM組中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4表達顯著降低（P＜0.001）；經(jīng)不同濃度（0.01、0.1、1 μmol/L）升麻素或1 μmol/L Dex處理后，ZO-1、Occludin、Claudin-4蛋白表達呈濃度依賴性升高（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖5C、D）。

圖5 升麻素對HDM誘導的BEAS-2B細胞的屏障保護作用Fig.5 Protective role of cimifugin in epithelial barrier of HDM-induced BEAS-2B cells

2.5 升麻素抑制HDM誘導的BEAS-2B細胞中NFκB及相關(guān)蛋白活化 免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，HDM暴露下NF-κB在細胞核內(nèi)含量明顯增加；與HDM組相比，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組NF-κB進入細胞核內(nèi)的含量顯著減少，并顯示出明顯的量效作用（圖6A）。同樣，升麻素或Dex處理能增加IκBα蛋白表達，下調(diào)p-NF-κB p65蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖6B）。

圖6 升麻素抑制HDM誘導的BEAS-2B細胞中NF-κB及相關(guān)蛋白活化Fig.6 Cimifugin inhibits HDM-induced activation of NF-κB and related proteins in BEAS-2B cells

3 討論

哮喘是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重威脅患者健康［16-17］。大量研究表明，哮喘發(fā)作期間會引發(fā)炎癥反應，釋放促炎細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等［18］。此外，細胞凋亡也參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展，抑制細胞凋亡可有效改善哮喘［19］。氣道上皮是抵御外來物質(zhì)，如吸入性過敏原、空氣傳播顆粒的一線宿主屏障，與哮喘發(fā)病機制密切相關(guān)［20］。氣道上皮屏障的破壞可能導致過敏原致敏風險增加，從而引發(fā)過敏性哮喘的慢性炎癥［21］。HDM是一種普遍存在的氣源性過敏原，是哮喘患者過敏原的主要來源［22］。HDM暴露和氣道上皮細胞的相互作用可直接導致氣道上皮功能障礙［23］。因此，本研究利用HDM對人支氣管上皮細胞BEAS-2B進行誘導，構(gòu)建過敏性哮喘體外模型。

升麻素是中藥防風中色原酮的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學研究證明其具有抗腫瘤、抗炎等作用［24］。研究報道，升麻素可通過恢復上皮屏障緊密連接從而改善過敏性炎癥進展［8-9］。本研究利用不同濃度升麻素處理BEAS-2B細胞，發(fā)現(xiàn)中低濃度（0.01、0.1、1 μmol/L）升麻素對BEAS-2B細胞活性無顯著影響，而高濃度（10 μmol/L）升麻素可顯著降低細胞活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，暴露于HDM的BEAS-2B細胞活性顯著下降，凋亡細胞數(shù)目增加，抑癌基因Bcl-2蛋白表達下調(diào)，促進原癌基因Bax、Cleaved caspase-3/pro-caspase 3蛋白表達上調(diào)；不同濃度升麻素可提高HDM誘導的BEAS-2B細胞活性，減少細胞凋亡，促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax、cleaved caspase-3/pro-caspase 3蛋白表達。HDM刺激可導致實驗細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加，并促進炎癥因子iNOS、COX-2蛋白表達，這與CAI等［25］的研究結(jié)果一致；升麻素處理可降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平并減少iNOS、COX-2蛋白表達。研究報道HDM可直接破壞氣道上皮細胞之間的緊密連接以及屏障結(jié)構(gòu)［26］。本研究同樣檢測上皮完整性、細胞單層膜滲透性及緊密連接蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDM暴露可導致細胞TEER值顯著下降，F(xiàn)D-40通量升高，同時緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4表達下調(diào)，提示HDM能誘導單層BEAS-2B細胞通透性增加，屏障功能紊亂，并破壞上皮細胞間的緊密連接；經(jīng)升麻素處理后，TEER值上升，F(xiàn)D-40通量減少，ZO-1、Occludin、Claudin-4蛋白表達增加，且呈濃度依賴性，與文獻報道結(jié)果一致［8-9］。

NF-κB信號傳導通過協(xié)調(diào)炎癥反應參與哮喘的發(fā)生發(fā)展［27-28］。此外，升麻素可通過抑制NF-κB信號傳導，從而抑制疾病中的炎癥反應［13，29-30］。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，HDM暴露能誘導BEAS-2B細胞NFκB發(fā)生核易位，IκBα蛋白表達減少，p-NF-κB p65蛋白表達增加；升麻素處理后能明顯抑制細胞NFκB核易位，并濃度依賴性地降低p-NF-κB p65蛋白表達，促進IκBα蛋白表達。

綜上所述，升麻素可減輕HDM誘導的人支氣管上皮細胞過敏性炎癥損傷并保護細胞屏障，其機制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。