痛風基因表達譜的差異基因表達及免疫細胞浸潤分析

陳鋒 李華南 章曉云 黃慧蓮 陳躍平 任國武 （.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院骨科，南寧 500；.江西中醫藥大學附屬醫院，南昌 0006；.江西中醫藥大學，南昌 0004）

痛風是人類最常見的代謝性風濕病之一，其特征為單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體慢性沉積，導致反復發作的痛風性關節炎、痛風石、腎結石和痛風性腎?。?］。流行病學證據表明，從1990年到2017年，痛風在中國的患病率和發病率分別增長了6.88%和6.16%，其變化幅度遠高于全球水平，但具體發病機制尚不清楚［2］。隨著免疫學機制在骨科疾病中的應用，越來越多研究發現免疫系統與骨骼之間存在共享分子和相互作用。研究表明，關節滑膜組織中除了滑膜細胞還包含巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞，在痛風性關節炎的發病機制中這些免疫細胞的異?；罨瘯龠M關節炎癥和MSU晶體的形成［3-4］。因此，深入研究痛風潛在的免疫細胞作用機制，發現安全有效的診療靶點非常重要。

本研究從基因表達數據集（gene expression omnibus，GEO）下載痛風患者的基因表達譜數據，進行差異基因表達和信號通路分析，再通過免疫細胞浸潤分析各免疫細胞在痛風患者及健康對照者中的表達情況，最后分析痛風差異基因、信號通路與免疫細胞間的作用關系，為研究痛風發病的相關免疫機制提供新的見解，并確定痛風的預期靶點。

1 資料與方法

1.1 篩選痛風的相關芯片 以“Gout”“Human”“Peripheral blood”為關鍵詞，在GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索痛風的相關芯片，獲得編號為GSE160170的芯片矩陣文件和編號為GPL21827的平臺文件。該芯片中共納入12例樣本，其中6例為痛風患者外周血，6份為健康對照者外周血。

1.2 重注釋比對 將平臺文件中的探針核酸序列整理為fasta格式，在Gencode數據庫（https：//www.gencodegenes.org/）下載人類染色體上所有轉錄物的核苷酸序列文件，運用R語言（版本4.1.1）將探針核酸序列與人類染色體上所有轉錄物的核苷酸序列文件進行比對，得到含有基因名的探針文件。

1.3 芯片數據分析 運用Perl語言（版本5.34.0）將矩陣文件與探針文件比對，獲得痛風患者和健康對照者的基因表達譜數據集。然后利用R語言的limma包對數據進行校正，再進行差異分析。以P＜0.05和|log2fold change （FC）|＞1.2作為過濾條件，篩選出存在差異表達的基因，最后運用R語言的pheatmap繪制差異基因聚類熱圖。

1.4 蛋白互作網絡構建 為進一步探究痛風的蛋白質相互作用關系，將差異基因導入蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析數據庫STRING（https：//string-db.org/）中，設定研究物種為“Homo Sapiens”，并設置連接評分＞0.98，獲得PPI網絡。將所得結果導入Cytoscape軟件中（版本3.7.2），利用“NetworkAnalyzer”工具進行可視化處理，并利用“CytoHubba”工具根據度值篩選出關鍵基因。

1.5 關鍵基因的功能富集分析 使用R語言的clusterProfiler包對關鍵基因進行基因本體論（Gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，研究痛風發生發展的主要生物功能及相關信號通路，最后運用R語言的ggplot2包繪制GO及KEGG富集分析氣泡圖。

1.6 免疫細胞分析法 利用R語言CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/）包中的反卷積算法及其提供的22種免疫細胞轉錄特征矩陣，對痛風患者血清的基因表達譜數據進行1 000次模擬，計算各樣本中不同免疫細胞占比，并分析痛風患者外周血和健康對照組中免疫細胞的差異性，從而獲得免疫細胞浸潤及分布情況；然后用R語言的barplot、pheatmap、corrplot、vioplo及ggplot2包分別繪制免疫細胞分布柱狀圖、免疫細胞聚類熱圖、免疫細胞間的相關性熱圖、小提琴圖以及主成分分析（principal components analysis，PCA）圖。

2 結果

2.1 痛風差異基因的分析 利用perl和R語言等工具對芯片進行重注釋后，再對其進行分析。結果顯示，與健康對照組相比，痛風患者共存在858個明顯改變的基因，其中496個基因表達上調，362個基因表達下調。選取差異表達最顯著的20個基因（表達上調和表達下調的基因中各選取10個）繪制聚類熱圖，見圖1。

圖1 痛風患者與健康對照組差異基因的聚類熱圖Fig.1 Clustering heat map of differential genes between gout patients and healthy controls group

2.2 PPI網絡 借助STRING數據庫對差異基因進行分析，并將結果導入Cytoscape軟件繪制PPI網絡，同時篩選出關鍵基因，見圖2。圖中共涉及25個節點，47條邊。度值排名前6的蛋白基因為IL-6、IL-1β、TNF、CCL3、CXCL8和CXCL1，在整個網絡中發揮關鍵作用，可能是痛風發生發展的關鍵基因，基本信息見表1。

表1 關鍵基因的基本信息Tab.1 Basic information of key genes

圖2 PPI網絡Fig.2 PPI network

2.3 GO和KEGG富集分析 GO富集分析關鍵基因功能的過程中，共確定了915個條目；KEGG富集分析關鍵基因共得到60條信號通路，根據富集的基因數排序，選取富集基因數最多的10個條目以氣泡圖的形式展現（P＜0.05），見圖3。分析結果顯示，痛風發生發展的生物過程主要包括細胞對脂多糖、細菌來源分子及生物刺激的反應；主要涉及IL-17、Toll樣受體、NOD樣受體、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等信號通路。

圖3 GO和KEGG富集分析氣泡圖Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis bubble plot

2.4 免疫細胞浸潤分布情況 本研究共涉及22種免疫細胞的類型，包括初始B細胞、記憶性B細胞、漿細胞、CD8＋T細胞、初始CD4+T細胞、未活化的CD4+記憶T細胞、活化的CD4+記憶T細胞、濾泡輔助性T細胞、調節性T細胞、γδT細胞、未活化的NK細胞、活化的NK細胞、單核細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、未活化的樹突狀細胞、活化的樹突狀細胞、未活化的肥大細胞、活化的肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞。在R語言中，用barplot包繪制柱狀圖，可見不同免疫細胞在各個樣本中的具體占比情況，見圖4。然后用pheatmap包對免疫細胞與樣本的矩陣數據繪制熱圖：未活化的CD4+記憶T細胞、γδT細胞、未活化的NK細胞、未活化肥大細胞在健康對照組中表達相對較高；記憶性B細胞、活化的CD4+記憶T細胞、活化的NK細胞、單核細胞、活化的樹突狀細胞、活化的肥大細胞、嗜酸性粒細胞在痛風患者中表達相對較高，見圖5。

圖4 免疫細胞在不同樣本中的分布柱狀圖Fig.4 Histogram of distribution of immune cells in different samples

圖5 免疫細胞在不同樣本中的表達水平Fig.5 Expression levels of immune cells in different samples

2.5 免疫細胞間的相關性分析 本研究通過分析免疫細胞間的相關性發現，濾泡輔助性T細胞與活化的肥大細胞相關系數最高，為0.91，即在同一樣品中濾泡輔助性T細胞與活化的肥大細胞呈正相關。而在同一樣品中，未活化的NK細胞與單核細胞相關系數最低，為-0.87，即在同一樣品中未活化的NK細胞和單核細胞表達呈負相關，見圖6。

圖6 免疫細胞間的相關性熱圖Fig.6 Heat map of correlations between immune cells

2.6 免疫浸潤差異分析 運用R語言的vioplot包繪制小提琴圖，通過分析痛風患者與健康對照組間免疫浸潤細胞差異，發現未活化的NK細胞、未活化的肥大細胞在健康對照中顯著表達，而記憶性B細胞、活化的NK細胞、活化的樹突狀細胞、活化的肥大細胞、嗜酸性粒細胞在痛風患者中顯著表達（P＜0.05，圖7）。

圖7 痛風患者與健康對照組間免疫細胞的對比情況Fig.7 Comparison of immune cells between gout patients and healthy controls group

2.7 PCA 通過對痛風患者與健康對照組中免疫細胞的浸潤情況行PCA，發現痛風患者與健康對照組中的免疫細胞的主成分不交叉，區分度較好。該免疫細胞浸潤分析能夠很好地將痛風患者與健康對照組區分開，見圖8。

圖8 免疫細胞PCAFig.8 PCA of immune cells

3 討論

痛風作為一種慢性炎癥性疾病，其反復發作的痛風性關節炎嚴重影響人們的生活質量，且痛風及其并發癥風險隨年齡的增長而增加。此外，痛風明顯增加了肥胖、心血管疾病、慢性腎臟疾病、靜脈血栓栓塞等亞健康或疾病風險［5］。目前認為痛風最主要的發病機制是MSU沉積誘發的損傷，并引起炎癥反應和免疫功能紊亂［6］。然而，痛風發病的相關分子機制和免疫機制仍有待研究。隨著生物信息技術的興起，該研究使得研究人員能夠探測和研究痛風的基因變化［7］。因此本研究從GSE160170芯片中提取數據，并在痛風患者和健康對照組之間鑒定出496個上調和362個下調的基因。PCA結果證實，這些基因可以很好地區分痛風患者與健康對照組。為探尋痛風的關鍵基因、信號通路與免疫細胞作用機制，篩選了蛋白互作網絡中的關鍵基因，并對其進行富集分析。結果顯示IL-6、IL-1β、TNF、CCL3、CXCL8和CXCL1在痛風患者的血清中均上調，主要富集在IL-17、Toll樣受體、NOD樣受體和NF-κB信號通路上，其生物過程主要涉及細胞對脂多糖、細菌來源分子及生物刺激的反應。

下述將針對關鍵基因、信號通路與免疫細胞間的關系展開討論：①炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF與CD4+T細胞、巨噬細胞：輔助性T細胞（helper T cells，Th）又稱為CD4+T細胞，研究發現MSU晶體能夠以非抗原依賴的方式直接激活CD4+T細胞，使其表面NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NFκB ligand，RANKL）高表達，并通過與單核巨噬細胞表面的NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）進行細胞間接觸，進而誘導破骨細胞分化，最終產生骨質破壞［8-10］。此外，在MSU晶體誘導的急性痛風性關節炎大鼠中，CD4+T細胞向Th17細胞分化顯著增多，而Th17細胞分泌的IL-17不僅能促進破骨細胞分化，還可誘導巨噬細胞產生IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子加劇痛風的炎癥反應［11-14］；②趨化因子CCL3、CXCL8、CXCL1與中性粒細胞、巨噬細胞：CCL3通過與CCR1、CCR4和CCR5等受體結合而在炎癥中發揮作用。研究表明，痛風關節滑膜組織中CCL3表達升高并介導中性粒細胞募集［15］。CXCL8編碼的蛋白通常為IL-8，主要由單核巨噬細胞和中性粒細胞產生。而MSU晶體會刺激滑膜內皮細胞產生IL-8，進而激活中性粒細胞向炎癥部位聚集，加重炎癥反應［16］。CXCL1與IL-8的作用相似，主要由受到IL-1β刺激的中性粒細胞和單核巨噬細胞產生，其同樣會介導中性粒細胞的募集。而通過運動療法能夠降低MSU晶體對IL-1β、CXCL1的誘導作用［17-18］；③Toll、NOD樣受體信號與巨噬細胞：Toll樣受體屬于模式識別受體，激活前需要形成異源或同源二聚體。研究表明，痛風患者外周血單核細胞表面的TLR2、TLR4識別MSU晶體后會募集IκB激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）/NF-κB信號，最終誘導 IL-1β等炎癥因子的表達［19-20］。巨噬細胞的NOD樣受體3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）受到MSU晶體激活后會與 caspase-1組成蛋白復合體（NLRP3炎癥小體），進而釋放IL-1β并引起炎癥反應［21-22］。基于所篩選的基因、信號通路與痛風免疫細胞的作用機制分析可見，影響痛風發病機制的關鍵基因和其調控的生物過程及信號通路均與免疫細胞的介導相關。

為進一步探究痛風免疫細胞間的作用機制，進行免疫細胞間的相關性分析。結果顯示，濾泡輔助性T細胞 （T cells follicular helper，Tfh）與活化的肥大細胞呈正相關，未活化的NK細胞和單核細胞表達呈負相關。①HUANG等［23］研究發現，痛風患者外周血中Tfh細胞傾向于Tfh2細胞的極化，且Tfh2/Tfh1細胞比值與痛風衰老呈正相關。DALBETH等［24］通過鑒定痛風患者痛風石的研究發現，肥大細胞大量分布于電暈區和纖維血管區，且表達出大量IL-1β。表明活化的肥大細胞參與痛風石、血管炎癥的病變過程。相關細胞功能研究表明Tfh細胞能促進IgE抗體的產生，進而與肥大細胞IgE受體結合，促進肥大細胞釋放炎癥介質（組胺、前列腺素、IL-1β等）［25］；②NK細胞在痛風患者關節中以擴增式形成，且高尿酸患者經過低嘌呤飲食后能降低血清中NK細胞數量［26］。痛風發作時單核細胞進入炎癥組織，并分為成熟的巨噬細胞以提高對MSU晶體的吞噬能力；此外，成熟的巨噬細胞會分泌IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-18（IFN-γ誘導因子）等多種炎癥因子介導關節、腎臟等組織的炎癥［27］。目前尚缺少痛風病變中NK細胞與單核細胞的共培養研究，但單核細胞分泌的IL-2、IL-18能夠刺激NK細胞增殖分化并產生IFN-γ、TNF-α，而IFN-γ、TNF-α又能反向促進單核細胞分化為成熟的巨噬細胞［28-29］。痛風患者血清生物因子的調查研究也支持這一觀點，相較于健康人，痛風患者血清中IL-1β、IL-2、IL-18、IFN-γ、TNF-α明顯升高［30］。因此，痛風疾病中NK細胞與單核細胞存在相互介導活化作用，反而言之，未活化的NK細胞與單核細胞則具有負相關關系。

免疫浸潤差異分析結果顯示：活化的肥大細胞、活化的NK細胞、活化的樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、記憶性B細胞在痛風患者中顯著表達。上文已討論活化的肥大細胞、NK細胞免疫浸潤介導高尿酸、痛風性關節炎的發展。樹突狀細胞是抗原呈遞細胞，不依賴于特定細胞表面受體模式而是通過晶體-脂質接觸方式與MSU晶體相互作用，當其活化后會釋放IL-1β介導炎癥反應［31-32］；MSU與嗜酸性粒細胞共培養研究表明，MSU晶體會迅速誘導嗜酸性粒細胞分泌ATP到細胞外環境中，并誘導IL-1β、IL-6、CXCL8、CCL2、CCL3等多種炎癥因子或趨化因子表達［33］。而記憶B細胞尚缺少在痛風模型中的實驗驗證，未來仍待進一步研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學篩選并論述了痛風中關鍵基因和相關通路在免疫細胞中的作用機制、痛風免疫細胞的浸潤情況以及免疫細胞之間的相關性，可為痛風的基礎研究提供理論支持。此外本研究尚存在一定局限性：首先，GEO數據集中有關痛風的樣本量較??；其次，痛風疾病中免疫細胞代謝和反應受諸多因素影響，存在風險偏倚。但利用生物信息技術，綜合并分析各數據庫的相關研究，能夠更加系統、全面地預測痛風分子機制與免疫細胞的關聯性，并為理解痛風免疫機制及發現新的診療靶點提供更全面的視角。