基于網絡藥理學探討甘草瀉心湯治療白塞病的作用機制

宋書珍，王旭光，宋世娜，孫萬晶，胡國冰*

德州市人民醫院，1 藥劑科，2 中醫科，德州 253000

白塞病（Behcet's disease，BD）是一種系統性炎癥疾病，以非特異性血管炎為主要病理損害［1］。臨床以復發性口腔潰瘍、生殖器潰瘍、皮膚損害及眼部虹膜炎為主要特征，也可累及血管、神經、心、肺、腎等全身多個組織/器官［2］。由于BD 臨床表現多樣，極易造成漏診和誤診。當BD 累及血管、神經、眼部等時，不僅診斷和治療的難度較大，其致殘率和致死率也較高。然而，目前臨床尚無有效的治療方法。西醫多依賴于生物制劑、免疫抑制劑和激素等控制患者的病情，但不良反應較大，且停藥后患者易復發［3］。近年來，中醫藥在治療BD 方面發揮了較好的優勢。研究表明［4］，中藥或中西醫結合治療BD 可提高治療總有效率、降低復發率。

甘草瀉心湯源于《傷寒論》，由炙甘草四兩、黃芩三兩、干姜三兩、半夏（洗）半升、大棗（擘）十二枚和黃連一兩組成［5］。中醫學認為，BD 屬于“狐惑病”范疇。“狐惑”作為中醫病名，首見于《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病脈證治第三》：“狐惑之為病，狀如傷寒，默默欲眠，目不得閉，臥起不安，蝕于喉為惑，蝕于陰為狐，不欲飲食，惡聞食臭，其面乍赤、乍黑、乍白，蝕于上部則聲喝，甘草瀉心湯主之”［6］。《金匱要略》中甘草采用生甘草，其清熱解毒力盛［7］。濕熱毒瘀互結為BD 發病的病理基礎，并貫穿該病始終［8］。因此，本研究中甘草采用生甘草。研究證實甘草瀉心湯治療BD療效確切［9-10］。然而，甘草瀉心湯的活性成分復雜。因此，甘草瀉心湯的作用機制研究具有較大的難度，且目前尚無甘草瀉心湯治療BD 的機制研究。

網絡藥理學是一門新興學科，通過系統藥理學、分子生物學和計算機網絡等方式從系統層次和生物網絡的整體角度出發，解析藥物與疾病之間的分子關聯規律，為中藥復雜體系研究提供了新思路，為臨床合理用藥、新藥研發等提供了新的科技支撐［11］。本研究通過網絡藥理學探索甘草瀉心湯的有效活性成分和BD 的潛在治療靶點，以期為甘草瀉心湯治療BD 的后續深入研究提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 甘草瀉心湯活性成分及對應靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“半夏”“干姜”“黃芩”“甘草”“大棗”“黃連”為關鍵詞，檢索甘草瀉心湯中所有活性成分，根據各成分的代謝、吸收、分布、排泄等藥動學參數以及口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選并獲取每味中藥的活性成分及對應靶點。

1.2 BD 相關靶點獲取

以“Behcet's disease”為檢索詞，通過人類基因綜合分析數據庫（ GeneCards，http：//www.genecards.org）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//omim.org）、遺傳藥理學和藥物基因組學數據庫 （PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org）、生物信息學和化學信息學數據庫（DrugBank，https：//go.drugbank.com/） 收 集BD 相關靶點。運用R 4.1.0 軟件提取GeneCard、OMIM、PharmGkb 及DrugBank 數據庫中的所有靶點，所得并集即為BD 相關靶點。

1.3 甘草瀉心湯治療BD 的網絡可視化分析

將篩選的甘草瀉心湯活性成分靶點與BD 相關靶點取交集，分別導入Cytoscape 3.8.2 軟件中，構建藥物-疾病靶點相互作用網絡。通過基因/蛋白質相互作用檢索工具（ STRING 11.5，https：//stringdb.org）數據庫（最低要求交互得分＞0.40，并隱藏網絡中斷開連接的節點），構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，并導入 Cytoscape 3.8.2 軟件中，運用CytoNCA插件，以度中心性（degree centrality，DC）、介數中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網絡中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（local average connectivity-based method，LAC）為篩選條件，選擇大于中位值的數據，經2 次篩選后得到甘草瀉心湯治療BD 的核心靶點。

1.4 基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

分別通過R 4.1.0 軟件和OmicShare 平臺（https：//www.omicshare.com/tools/）對甘草瀉心湯活性成分-BD 進行GO 和KEGG 富集分析，并將結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 甘草瀉心湯中活性成分和對應靶點篩選

截至2021 年11 月，在 TCMSP 數據庫中篩選出甘草活性成分92 個，半夏活性成分13 個，干姜活性成分5 個，黃芩活性成分36 個，大棗活性成分29 個，黃連活性成分14 個，共189 個活性成分，去掉重復活性成分后共174 個。此外，174 個活性成分對應靶點共3225 個，去掉重復靶點，得到甘草瀉心湯靶點共247 個。

2.2 甘草瀉心湯活性成分靶點與BD 相關靶點交集

應用Genecard、OMIM、PharmGkb、DrugBank 4 個數據庫檢索并取交集，共得到1006 個BD 相關靶點（圖1）。對藥物有效成分靶點與BD 相關靶點取交集，共得到60 個交集靶點（圖2）。

圖1 BD 靶點整合

圖2 甘草瀉心湯活性成分與BD 交集靶點韋恩圖

2.3 甘草瀉心湯活性成分-BD 靶點網絡構建

將所得的甘草瀉心湯活性成分靶點及交集靶點導入 Cytoscape 3.8.2 軟件中，構建甘草瀉心湯活性成分-BD 靶點相互作用網絡（圖3）。通過CytoNCA 插件分析網絡關系中DC≥10 的活性成分，發現甘草瀉心湯中與BD 關系最為密切的活性成分為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、刺槐素（表1）。

表1 甘草瀉心湯的主要活性成分

圖3 甘草瀉心湯活性成分-BD 靶點相互作用網絡

2.4 PPI 網絡構建

設置交互得分＞0.40，得到 PPI 網絡（圖4）。包含57 個節點，726 條邊，平均DC 為25.5。將互作網絡關系導入Cytoscape 3.8.2 軟件中，篩選得到甘草瀉心湯治療BD 核心靶點20 個，包括HMOX1、IFNG、CAT、EGF、VEGFA、PTGS2、CXCL8、TP53、IL1B、STAT3、SERPINE1、MPO、CCL2、SELE、ICAM1、VCAM1、MMP9、CASP3、NFKBIA、IL1A（圖5 和表2）。提示這些蛋白可能是甘草瀉心湯治療BD 的關鍵靶點。

表2 甘草瀉心湯治療BD 的核心靶點

圖4 甘草瀉心湯治療BD 靶點PPI 網絡

圖5 甘草瀉心湯治療BD 的核心靶點PPI 網絡

2.5 GO 富集分析及 KEGG 通路分析

應用R 4.1.0 軟件進行GO 富集分析，得到條目共1697 個，其中生物過程（biological process，BP）1561 個， 細胞組分（cellular component，CC）26 個，分子功能（molecular function，MF）110 個，并對Q值排序后前 10 名進行分析（圖6）。甘草瀉心湯活性成分治療BD 的相關靶點主要涉及對脂多糖的反應、對細菌來源的分子反應、外源性凋亡信號通路、負向調節凋亡信號通路、負向調節外源性凋亡信號通路、活性氧的代謝過程、對藥物的反應、細胞對生物刺激的反應等生物過程；細胞組分分析表明，靶點主要與膜筏、膜微域、陷窩、囊腔、細胞質膜筏、細胞質囊腔、分泌顆粒內腔、細胞器外膜等組分有關；分子功能分析表明，靶點主要涉及血紅素結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性、氧化還原酶活性、受體配體活性、信號受體激活因子活性、單加氧酶活性等，提示甘草瀉心湯可通過參與這些過程來發揮治療作用。

圖6 GO 富集分析柱狀圖（排名前10 位）

2.6 KEGG 信號通路富集分析結果

應用OmicShare 平臺對共同靶點進行 KEGG信號通路富集，Q值≤0.05 的富集結果共114 個，主要涉及血液流變學、病毒感染、炎癥因子、免疫調節等。對Q值排序后前20 名進行分析（圖7）。KEGG 富集最顯著的10 條通路分別為糖尿病并發癥AGE-RAG 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路（fluid shear stress and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、 腫瘤通路（pathways in cancer）、白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、麻疹通路（measles）、甲型流感通路（influenza A）、丙肝通路（hepatitis C）、恰加斯病通路（chagas disease）、弓形體病通路（toxoplasmosis）。這些結果提示甘草瀉心湯可能通過抑制炎性反應、調節內分泌水平、抗病毒及調控惡性腫瘤中蛋白多糖信號通路等方面發揮治療作用。

圖7 KEGG 信號通路富集結果（排名前20 位）

3 討論

甘草瀉心湯具有益氣和胃、消痞止痢、調和寒熱的功效，對治療BD 具有較好的臨床療效。國明俊等［12］運用甘草瀉心湯治療27 名BD 患者，3 個療程后共治愈26 例，治愈率達96.3%。此外，未治愈1 例，經中西醫結合治療后痊愈。半年內未復發，半年后復發5 例，且經治療后痊愈。本研究通過數據庫共檢索到甘草瀉心湯中主要活性成分174 個，其中槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、刺槐素可能是治療BD 的主要活性成分。藥理研究發現［13-15］，槲皮素屬于黃酮類化合物，大量存在于蔬菜、水果以及中草藥中，具有抗炎、抗氧化等作用，可有效減輕葡萄膜炎［16］。此外，山柰酚［17］、漢黃芩素［18］、黃芩素［19］、β-胡蘿卜素［20］、刺槐素［21］也具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等藥理活性，對于BD 所致的器官損害具有治療潛力。

本研究中，甘草瀉心湯治療BD 的PPI 網絡分析得到HMOX1、IFNG、CAT、EGF、VEGFA、PTGS2、CXCL8、TP53、IL1B、STAT3、SERPINE1、MPO、CCL2、SELE、ICAM1、VCAM1、MMP9、CASP3、NFKBIA、IL1A 等核心靶點，蛋白類型涉及趨化因子、血管生成因子、過氧化氫酶等。IFNG基因編碼一種可溶性細胞因子，為 Ⅱ型干擾素類的成員，其突變與病毒、細菌和寄生蟲感染以及幾種自身免疫性疾病的易感性增加有關［22-23］。STAT3基因可在調節宿主對病毒和細菌感染的反應中發揮作用，該基因的突變與多系統自身免疫疾病有關［24］。研究表明［25］，CAT基因可在體內發揮抗氧化作用，對維持氧化-抗氧化平衡至關重要。VEGFA 是一種具有促進血管內皮細胞增殖作用的細胞因子，其可激活胞外信號調節激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，促進血管細胞的生長、增殖［26］。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）具有促進表皮生長、增加細胞再生能力的作用［27］。劉洋等［28］通過建立大鼠胃潰瘍模型，發現甘草瀉心湯可減輕乙酸型胃潰瘍大鼠的胃黏膜損傷，這可能是通過升高EGF 和前列腺素E2，降低胃蛋白酶活性、抑制胃泌素分泌而發揮作用。以上結果在一定程度上證實了PPI 網絡分析核心靶點的可靠性，提示其可為進一步研究甘草瀉心湯治療BD 的機制研究提供思路。

GO 富集分析結果表明甘草瀉心湯主要通過活性氧代謝、藥物代謝、細胞對生物刺激的反應、免疫炎癥反應等生物過程影響疾病病理過程。KEGG信號通路富集分析結果顯示，甘草瀉心湯治療BD可能通過參與糖尿病并發癥 AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17 信號通路、丙肝病毒信號通路以及TNF 信號通路等。王國慶等［29］研究發現甘草瀉心湯可使潰瘍性結腸炎患者的IL-17、IL-23 表達水平下調。陳浩等［30］研究發現在潰瘍性結腸炎患者中，與單純美沙拉嗪治療相比，美沙拉嗪聯合甘草瀉心湯進一步降低了患者TNF-α、IL-8、IL-17、IL-23 的表達水平。這些研究結果在一定程度上與本研究結果相一致。

綜上所述，本研究從網絡藥理學角度系統分析了甘草瀉心湯治療BD 的分子機制，共獲得174 個活性成分，60 個靶點，表明甘草瀉心湯可通過多靶點、多通路治療BD，為深入揭示其作用機制提供了生物信息學基礎。