響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)粉復(fù)合酶酶解工藝及多糖抗氧化性研究

陳坤林 李祥 何思思 康芳芳 胡宇軒 史靜怡 沈勇根

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.004

引文格式：陳坤林，李祥，何思思，等.響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)粉復(fù)合酶酶解工藝及多糖抗氧化性研究[J].中國調(diào)味品，2024，49（3）：20-27.

CHEN K L， LI X， HE S S， et al.Optimization of compound enzymatic hydrolysis process of Euryale ferox powder by response surface methodology and study on antioxidant activity of polysaccharides[J].China Condiment，2024，49（3）：20-27.

摘要：為確定復(fù)合酶法酶解芡實(shí)粉的最佳工藝及芡實(shí)多糖的抗氧化活性，以優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地的芡實(shí)粉為原料，通過單因素試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析研究復(fù)合酶添加量、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)水解程度（dextrose equivalent，DE值）的影響；并通過測定酶解后芡實(shí)多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，復(fù)合酶法酶解芡實(shí)粉的最佳工藝參數(shù)為復(fù)合酶（普魯蘭酶∶α-淀粉酶）的質(zhì)量比5∶6、酶添加量0.3%（以原料質(zhì)量為基準(zhǔn)）、pH 6.5、酶解溫度56 ℃、酶解時(shí)間45 min。該條件下生產(chǎn)的芡實(shí)粉基料水解度可達(dá)20.25%，且酶解后芡實(shí)多糖具有一定的抗氧化活性。該研究結(jié)果為芡實(shí)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)及方法基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芡實(shí)粉；復(fù)合酶酶解；響應(yīng)面法；酶解工藝；抗氧化性；DE值

中圖分類號(hào)：TS210.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A????? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）03-0020-08

Optimization of Compound Enzymatic Hydrolysis Process of Euryale ferox

Powder by Response Surface Methodology and Study on Antioxidant

Activity of Polysaccharides

CHEN Kun-lin1，2， LI Xiang1， HE Si-si1， KANG Fang-fang1，

HU Yu-xuan1， SHI Jing-yi1， SHEN Yong-gen1*

（1.School of Food Science and Engineering， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China;

2.Seed Service Center， Agriculture and Rural Bureau of Nanjing County， Zhangzhou City，

Zhangzhou 363600， China）

Abstract： To determine the optimal compound enzymatic hydrolysis process of Euryale ferox powder and the antioxidant activity of Euryale ferox polysaccharides， with Euryale ferox powder from high-quality places of origin as the raw material， the effects of the addition amount of compound enzymes， pH， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the hydrolysis degree （dextrose equivalent， DE value） are studied through single factor test， Box-Behnken test design and response surface analysis. After enzymatic hydrolysis， the antioxidant activity of Euryale ferox polysaccharides is evaluated by measuring their DPPH free radical scavenging capacity. The results show? that the optimal process parameters for enzymatic hydrolysis of Euryale ferox powder using compound enzymes method are as follows： the mass ratio of compound enzymes （pullulanase∶α-amylase） is 5∶6， the addition amount of enzymes is 0.3% （based on the mass of raw materials）， pH is 6.5， enzymatic hydrolysis

收稿日期：2023-09-04

基金項(xiàng)目：江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（YC2021-S369）；芡實(shí)相關(guān)地方標(biāo)準(zhǔn)的起草（2021JXAUHX08）；江西主栽食用菌貯藏保鮮及加工技術(shù)研究（JXXTCX2018-03-04）

作者簡介：陳坤林（1999—），男，碩士，研究方向：果蔬貯藏與加工。

*通信作者：沈勇根（1971—），男，教授，碩士，研究方向：果蔬貯藏與加工。

temperature is 56 ℃ and enzymatic hydrolysis time is 45 min. Under these conditions， the hydrolysis degree of Euryale ferox powder basic material can reach 20.25%， and after enzymatic hydrolysis， Euryale ferox polysaccharides have certain antioxidant activity. The research results have provided theoretical and methodological basis for the development and utilization of products related to Euryale ferox.

Key words： Euryale ferox powder; compound enzymatic hydrolysis; response surface methodology; enzymatic hydrolysis process; antioxidant activity; DE value

芡實(shí)（Euryale ferox）俗稱雞頭米、雞頭子，為睡蓮科（Nymphaeaceae）芡屬（Euryale Salisb.ex DC.）水生草本植物，在植物學(xué)上被稱為歐洲黑麥草、狐貍堅(jiān)果[1-3]。芡實(shí)含大量淀粉、多糖、脂肪油及鈣、磷、鐵、核黃素、維生素C等，氨基酸種類齊全[4-5]。芡實(shí)粉具有降低體內(nèi)自由基數(shù)量和細(xì)胞分裂時(shí)染色體損傷的作用，能夠防止氧化損傷，從而延長細(xì)胞壽命，具有抗衰老、抗氧化、抗疲勞等功效[6-8]。芡實(shí)粉還具有改善食品品質(zhì)的作用，如在面包中加入芡實(shí)粉可以減少面包中快消化淀粉（RDS）含量，提升慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）含量，有利于維持血糖的穩(wěn)定，適合糖尿病患者、肥胖癥患者和中老年人等特殊人群食用[9]。

在21世紀(jì)初期，我國芡實(shí)種植面積約為10 000 hm2，平均每公頃干芡米產(chǎn)量為330～350 kg。近年來，隨著芡實(shí)品種的引進(jìn)和不斷改良，我國芡實(shí)的栽培面積和產(chǎn)量逐步上升[10]。目前國內(nèi)芡實(shí)粉加工技術(shù)基本采用普通粉碎技術(shù)結(jié)合其他生產(chǎn)工藝生產(chǎn)干制品和初加工產(chǎn)品，而深加工產(chǎn)品較少，產(chǎn)品的附加值較低，嚴(yán)重限制了芡實(shí)的大規(guī)模生產(chǎn)加工[11]。并且由于芡實(shí)中特殊的淀粉結(jié)構(gòu)，初加工后的芡實(shí)粉沖調(diào)性能不佳，出現(xiàn)分層、結(jié)塊現(xiàn)象，食用后不易消化[12]；高溫高壓的加工過程會(huì)破環(huán)芡實(shí)粉自身的營養(yǎng)成分，極大地限制了芡實(shí)產(chǎn)品的發(fā)展。因此，通過適宜的處理方式改善芡實(shí)粉的品質(zhì)和性能尤為重要。同時(shí)，目前國內(nèi)對(duì)于芡實(shí)多糖的研究大多集中在提取方法及其抗氧化性，但對(duì)于加工處理后芡實(shí)的抗氧化性鮮有報(bào)道。

本研究選擇江西余干優(yōu)質(zhì)芡實(shí)粉為原料，使用α-淀粉酶和普魯蘭酶雙酶法對(duì)芡實(shí)粉進(jìn)行水解，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法對(duì)芡實(shí)粉的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測定芡實(shí)多糖的抗氧化活性。本研究旨在改善芡實(shí)粉的品質(zhì)，增強(qiáng)芡實(shí)粉單位體積的能量，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)過酶解后的芡實(shí)多糖具有抗氧化活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)芡實(shí)的綜合開發(fā)利用。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

芡實(shí)：由江西明湖農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；α-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、普魯蘭酶：南寧龐博生物工程有限公司；葡聚糖苷酶：邢臺(tái)萬達(dá)生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：合肥千盛生物科技有限公司；甲醛、乙醇、氫氧化鈉、氯化氫：均為國產(chǎn)分析純。

Q500B高速粉碎機(jī)? 永康市鉑歐五金制品有限公司；GL-20A型冷凍高速離心機(jī)? 上海市菲恰爾分析儀器有限公司；101-1BS電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)? 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JYC-1102C立式單開門恒溫?fù)u床? 上海錦玟儀器設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋? 深圳市國華電器有限公司；BS210S電子分析天平? 上海浦春計(jì)量儀器有限公司；SHP-250型智能生物培養(yǎng)箱? 上海鴻都電子科技有限公司；WFJ-2100型可見分光光度計(jì)? 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 芡實(shí)粉制備和酶解工藝

具體工藝流程：優(yōu)質(zhì)芡實(shí)（干品）→挑選→反復(fù)清洗去雜質(zhì)→蒸煮（150 ℃，30 min）→勻漿處理→按料液比1∶10（g/mL）加水→添加復(fù)合酶酶解、調(diào)節(jié)pH→置于智能生化培養(yǎng)箱中充分酶解（調(diào)控溫度、時(shí)間）→沸水浴滅酶15 min→烘箱干燥（75 ℃，6 h）→粉碎過篩（80目）→芡實(shí)粉基料。

1.2.2? 水解度的測定

DE值也稱為葡萄糖值，代表糖化液中還原糖（以葡萄糖計(jì)算）占干物質(zhì)的百分比，工業(yè)上表示為淀粉的水解程度或糖化程度[13]。 DE值越高，則淀粉的水解程度越完全，糖漿質(zhì)量也越高[14]。本試驗(yàn)采用DNS法測定還原糖含量，準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品稀釋50倍，使樣品中的還原糖濃度為0.1～1.0 mg/mL。取1 mL稀釋溶液于25 mL試管中，加入1.5 mL二硝基水楊酸試劑，在540 nm波長處測得吸光度A，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線中還原糖含量，求得DE值（X）[15]，公式如下：

X=m1×V×NVS×m×1 000×100%。

式中：m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖質(zhì)量，mg；V為樣品提取液的總體積，mL;N為樣品提取液的稀釋倍數(shù)；VS為測定時(shí)所取樣品提取液的體積，mL;m為樣品的質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

1.2.3? 不同種類酶對(duì)芡實(shí)水解度的影響

基于盧美娟等[16]的試驗(yàn)研究以及實(shí)際生產(chǎn)用酶，選取α-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、普魯蘭酶和葡聚糖苷酶5種酶，在酶添加量0.3%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間50 min、pH 6的條件下，測定其水解后的DE值，從中篩選出2種最適的酶，進(jìn)行下一步復(fù)合酶質(zhì)量比的確定。

1.2.4? 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)芡實(shí)水解度的影響

在酶添加量0.3%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間50 min、pH 6的條件下，測定在不同復(fù)合酶的質(zhì)量比下水解后的DE值，其中芡實(shí)與水的比例為1∶10（g/mL），篩選出最優(yōu)的復(fù)合酶質(zhì)量比。

1.2.5? 酶解芡實(shí)粉生產(chǎn)工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以芡實(shí)粉的DE值為指標(biāo)，固定酶解溫度為55 ℃、酶解時(shí)間為50 min、pH為6，分析酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對(duì)芡實(shí)粉水解度的影響；固定酶添加量為0.3%、酶解時(shí)間為50 min、pH為6，分析酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）對(duì)芡實(shí)粉水解度的影響；固定酶添加量為0.3%、酶解溫度為55 ℃、pH為6，分析酶解時(shí)間（30，40，50，60，70 min）對(duì)芡實(shí)粉水解度的影響；固定酶添加量為0.3%、酶解溫度為55 ℃、酶解時(shí)間為50 min，分析pH（4，5，6，7，8）對(duì)芡實(shí)粉水解度的影響。

1.2.6? 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解芡實(shí)粉生產(chǎn)工藝

通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳芡實(shí)粉復(fù)合酶酶解工藝參數(shù)。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、pH（D）為影響因素，以DE值為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，見表1。

1.2.7? DPPH自由基清除率的測定

當(dāng)芡實(shí)與水的比例為1∶10 （g/mL）、復(fù)合酶（普魯蘭酶∶α-淀粉酶）的質(zhì)量比為5∶6時(shí)，以原料質(zhì)量為基準(zhǔn)，設(shè)置酶添加量為0.3%、pH為6.5、酶解溫度為56 ℃，酶解45 min后提取酶解液，并將酶解液中提取的多糖[17]配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的芡實(shí)多糖溶液，分別先加入0.1 mL芡實(shí)酶解液，再加入3.9 mL 0.04 mmol/L的DPPH-乙醇溶液。充分混合后在37 ℃下水浴加熱并且在避光條件下存放1 h。最后測定每個(gè)樣品在517 nm波長處的吸光度，平行測定3次。

DPPH自由基清除率（%）=1-AiA0×100%。

式中：Ai為測定樣品管的吸光度；A0為以乙醇作為空白對(duì)照管的吸光度。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert 11.0進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)的優(yōu)化，使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，整理分析后通過Origin 2019進(jìn)行圖形的繪制。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同種類酶對(duì)芡實(shí)水解度的影響

注：不同小寫字母表示有顯著性差異（P<0.05），下圖同。

由圖1可知，α-淀粉酶和普魯蘭酶對(duì)芡實(shí)DE值的影響程度比纖維素酶、果膠酶和葡聚糖苷酶高，芡實(shí)淀粉分子結(jié)構(gòu)中，直鏈淀粉和支鏈淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.37%～23.06%和37.66%～48.30%，支鏈淀粉與直鏈淀粉的比值為1.63～2.55[18]。普魯蘭酶作用于支鏈分子的α-1，6糖苷鍵，酶解后產(chǎn)支鏈淀粉的分支數(shù)顯著降低，同時(shí)產(chǎn)生大量的短直鏈分子[19-20];α-淀粉酶可以從淀粉分子內(nèi)部切開α-1，4糖苷鍵，生成糊精和還原糖[21]。普魯蘭酶與α-淀粉酶對(duì)芡實(shí)粉的酶解效果明顯，酶解后的DE值比其他酶類酶解的DE值高。因此選取α-淀粉酶和普魯蘭酶進(jìn)行復(fù)合配比，研究復(fù)合酶對(duì)芡實(shí)DE值的影響。

2.2? 不同復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)芡實(shí)水解度的影響

在復(fù)合酶適宜的條件下酶解植物淀粉底物，植物淀粉被復(fù)合酶通過各自的作用機(jī)制酶解[22]。由圖2可知，隨著普魯蘭酶比例的下降及α-淀粉酶比例的上升，復(fù)合酶對(duì)芡實(shí)的酶解效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中，復(fù)合酶質(zhì)量比達(dá)到5∶6時(shí)，復(fù)合酶對(duì)芡實(shí)酶解效果的影響最大，DE值達(dá)到16.62%；當(dāng)超過這一比例時(shí)，DE值開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)普魯蘭酶含量過多時(shí)，普魯蘭酶的各亞位點(diǎn)區(qū)域關(guān)鍵的底物結(jié)合位點(diǎn)分別與α-淀粉酶的相對(duì)應(yīng)酶切結(jié)合點(diǎn)相結(jié)合，從而阻礙酶與底物分子的結(jié)合[23]，抑制α-淀粉酶的活性，導(dǎo)致芡實(shí)短直鏈分子釋放減少，DE值降低；當(dāng)α-淀粉酶含量增多時(shí)，會(huì)抑制普魯蘭酶的活性，從而影響酶解效率，使得DE值降低。因此，當(dāng)普魯蘭酶與α-淀粉酶的比例達(dá)到5∶6時(shí)，能得到較好的酶解效果。

2.3? 酶解芡實(shí)粉生產(chǎn)工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1? 酶添加量對(duì)DE值的影響

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，DE值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量達(dá)到0.3%時(shí)，DE值為19.04%，此后再增大酶添加量，DE值呈緩慢下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵诘孜镆欢ǖ臈l件下，增加酶的使用量可以有效提高反應(yīng)速率。而當(dāng)?shù)孜锊粩啾幻阜纸夂螅孜餄舛冉档停附馑俾试鲩L較慢[24]。當(dāng)達(dá)到某一個(gè)平衡點(diǎn)時(shí)，酶的濃度達(dá)到飽和狀態(tài)，反應(yīng)速率達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)DE值處于較高水平。李楊等[25]研究復(fù)合酶水解玉米粉工藝優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著酶用量的增加，DE值先上升后下降，與本試驗(yàn)結(jié)果基本相同。因此，酶的最適添加量為0.3%。

2.3.2? 酶解溫度對(duì)DE值的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，DE值變化明顯。當(dāng)酶解溫度為30～50 ℃時(shí)，DE值隨著溫度的升高而增大，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大，為16.38%。當(dāng)酶解溫度超過50 ℃后，隨著溫度的繼續(xù)升高，DE值明顯下降。原因在于溫度能明顯影響酶的活性和酶解效率，最適溫度范圍決定了酶的活性形式和可逆失活形式之間的平衡，在最適溫度范圍內(nèi)，逐漸升高溫度，反應(yīng)能量增加，單位時(shí)間內(nèi)的有效碰撞數(shù)增加，反應(yīng)速度加快[26-27]。且酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度過高或者過低時(shí)，酶活性降低或失活且酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生改變，反應(yīng)速率降低，酶解不充分。因此，當(dāng)酶解溫度處于50 ℃左右時(shí)，能夠有效提高復(fù)合酶的酶解效率。丁霄霄等[28]在利用復(fù)合酶提取靈芝多糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)在30～50 ℃的酶解溫度下，多糖的提取率逐漸上升，而高于50 ℃時(shí)多糖的提取率下降，分析可能是溫度過高導(dǎo)致酶變性并失活，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。綜上，選擇酶解溫度為50 ℃較適宜。

2.3.3? 酶解時(shí)間對(duì)DE值的影響

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的增加，DE值出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，DE值達(dá)到最大值，為15.53%，此時(shí)為反應(yīng)初期，增加酶解時(shí)間能夠促進(jìn)酶與底物充分反應(yīng)；但此后再延長酶解時(shí)間，反而使得DE值下降。可能是由于當(dāng)反應(yīng)達(dá)到最大時(shí)，酶解底物消耗充分并且一部分酶的活性逐漸降低，反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)酶活性有一定的抑制作用，這也說明酶解時(shí)間越長，復(fù)合酶酶解底物的效率不一定越高。裴若楠等[29]通過響應(yīng)面試驗(yàn)，在利用復(fù)合酶對(duì)石花菜粗多糖提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在采用復(fù)合酶酶解石花菜的前120 min，多糖提取率逐漸增加，但當(dāng)酶解時(shí)間延長至120 min后，多糖提取率不升反降，推測可能是在酶解120 min時(shí)多糖得到最大程度的溶出，而酶解時(shí)間過長，底物充分消耗且酶活性下降，致使多糖提取率下降。因此，選擇酶解時(shí)間為50 min較適宜。

2.3.4? 酶解pH對(duì)DE值的影響

由圖6可知，隨著pH的增大，DE值呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH達(dá)到6時(shí)，DE值達(dá)16.21%，此后再增大pH值，DE值大幅度降低。普魯蘭酶和α-淀粉酶屬于溫和酶類，當(dāng)pH過低或過高時(shí)，等電點(diǎn)偏離，影響復(fù)合酶的酶活性和底物的空間結(jié)構(gòu)，從而影響DE值[30]。蔣德旗等[31]通過響應(yīng)面法進(jìn)行金果欖多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為3～5時(shí)，金果欖多糖得率逐漸升高，當(dāng)pH高于5時(shí)，金果欖多糖得率逐漸降低，分析原因可能是pH值過高或過低會(huì)影響酶活性，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。綜上，選擇酶解pH為6較適宜。

2.4? Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以芡實(shí)酶解后的DE值作為響應(yīng)值[32]，考察酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、pH（D）4個(gè)因素對(duì)水解程度DE值（Y）的影響，得出最優(yōu)的試驗(yàn)方案。Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

運(yùn)用響應(yīng)面軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)回歸擬合分析，得到芡實(shí)酶解DE值回歸方程：Y=21.79＋0.28A＋1.42B＋0.46C－1.95D＋0.31AB＋1.97AC＋0.42AD－0.33BC－0.55BD－2.04CD－2.61A2－1.90B2－4.82C2－1.83D2。

由表3可知，二次多項(xiàng)回歸模型的P<0.01，結(jié)果顯著，失擬項(xiàng)的P=0.089 4>0.05，結(jié)果不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型結(jié)果差異性小，擬合度高。回歸模型的R2=0.986 0，RAdj2=0.972 1，說明模型的擬合程度優(yōu)良，預(yù)測值與試驗(yàn)值高度相關(guān)。殘差是由隨機(jī)誤差引起的，故可以用該模型進(jìn)行理論分析和預(yù)測。一次項(xiàng)B、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2，交互項(xiàng) AC、BD、CD影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)C、交互項(xiàng) AD影響顯著（P<0.05），一次項(xiàng)A，交互項(xiàng) AB、BC影響不顯著。由此可得出，影響DE值的因素主次順序?yàn)閜H>酶解溫度>酶解時(shí)間>酶添加量。

2.5? 各因素交互作用和響應(yīng)面分析

由Design-Expert 12.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面圖的繪制，通過3D響應(yīng)面圖能較直觀地反映出各因素之間的交互作用對(duì)復(fù)合酶酶解芡實(shí)粉DE值的影響。響應(yīng)面和等高線分析結(jié)果見圖7。

響應(yīng)曲面越陡峭，顏色越深，表明該因素對(duì)酶解后DE值的影響越大。在三維曲面圖中，坡面陡峭程度越大，表明兩因素的交互作用越強(qiáng)；在等高線圖中，等高線越密集且呈橢圓形時(shí)交互作用越強(qiáng)。因此，各因素對(duì)復(fù)合酶酶解芡實(shí)DE值的影響程度為pH>酶解溫度>酶解時(shí)間>酶添加量。

2.6? 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 12.0軟件，得出最佳工藝參數(shù)為pH 6.59、酶添加量0.34%、酶解溫度56.50 ℃、酶解時(shí)間45.18 min。該條件下DE預(yù)測值為20.64%。對(duì)優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，為便于操作，將工藝參數(shù)調(diào)整為pH 6.5、酶添加量0.3%、酶解溫度56 ℃、酶解時(shí)間45 min，在該條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，測得酶解后的DE平均值為20.25%，與模型預(yù)測值無明顯差異，說明該模型優(yōu)化得到的芡實(shí)粉復(fù)合酶酶解工藝參數(shù)可靠。

2.7? 抗氧化性結(jié)果分析

選擇普魯蘭酶和α-淀粉酶在最佳酶解條件下對(duì)熟化后的芡實(shí)進(jìn)行酶解，獲得芡實(shí)多糖，芡實(shí)多糖的DPPH自由基清除能力見圖8。

由圖8可知，隨著芡實(shí)多糖濃度的增加，DPPH自由基清除率呈增大趨勢(shì)。在0.2～0.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率快速增加。然而，在0.4～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，可能是由于酶解后芡實(shí)多糖的濃度升高，分散性降低，抑制了電子的轉(zhuǎn)移，使清除率的增長速率上升緩慢[30]。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到了61.43%，說明酶解后的芡實(shí)多糖具有良好的抗氧化活性。

3? 結(jié)論

通過復(fù)合酶酶解技術(shù)酶解優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地的芡實(shí)粉，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，從而獲得最優(yōu)工藝參數(shù)：在復(fù)合酶（普魯蘭酶∶α-淀粉酶）的質(zhì)量比為5∶6、酶添加量為0.3%（以原料質(zhì)量為基準(zhǔn)）、pH為6.5、酶解溫度為56 ℃、酶解時(shí)間為45 min的條件下，生產(chǎn)的芡實(shí)粉基料水解度可達(dá)20.25%，說明復(fù)合酶酶解技術(shù)有效增強(qiáng)了單位體積的能量;體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，酶解后芡實(shí)多糖能顯著清除DPPH自由基，具有一定的抗氧化活性。酶解后的芡實(shí)多糖有更好的抗氧化活性，可以廣泛用于食品添加劑及保健食品中[33]，該研究也為芡實(shí)多糖的生產(chǎn)制備與醫(yī)藥應(yīng)用提供了相關(guān)的理論和數(shù)據(jù)依據(jù)[34]。

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