高效液相色譜法測(cè)定肝復(fù)顆粒中6 種成分含量

吳國軍，徐惠玲，龔艷珍（通信作者）

江西省人民醫(yī)院 （江西南昌 330006）

肝復(fù)顆粒是一種中成藥，主要由虎杖、冷水花、吉祥草、苦參、黃柏、丹參、梔子等7 味藥材組成, 具有疏肝利膽、活血化瘀、清熱解毒等功效，主要用于治療氣滯血瘀、肝膽濕熱所致的急慢性肝炎。方中虎杖的主要成分為虎杖苷和大黃素，具有護(hù)肝的作用[1-2]；梔子的有效成分為梔子苷和西紅花苷類，具有保肝、抗癌等作用[3-4]；丹參中丹參酮類成分主要具有保護(hù)肝臟、抗菌消炎的作用[5-6]。

《中國藥典》[7]的原有標(biāo)準(zhǔn)收載中記載了梔子苷的定量限定，但是關(guān)于其他成分測(cè)定的相關(guān)研究較少。研究證實(shí)，復(fù)方中藥成分復(fù)雜，其療效由方中藥材獨(dú)立或相互作用決定，各藥材所占比例將影響整個(gè)藥方的療效[7-10]。因此，評(píng)價(jià)復(fù)方中藥的療效需多成分測(cè)定。本研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定肝復(fù)顆粒中6 種成分（虎杖苷、西紅花苷Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、梔子苷）的含量，以期全面、客觀地評(píng)價(jià)肝復(fù)顆粒的藥效成分，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀（山東魯創(chuàng)分析儀器股份有限公司，型號(hào)：LC-500）；高精度電子天平（上海贊維衡器有限公司，型號(hào)：ZA505AS）；恒溫水浴鍋（常州國宇儀器有限公司，型號(hào)：HH-s6）；數(shù)控超聲波清洗器（北京東南儀誠實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，型號(hào)：KQ5200DV）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品梔子苷（批號(hào)：110749-201919）、虎杖苷（批號(hào)：111575-201603）、隱丹參酮（批號(hào)：110852-201807）、丹參酮Ⅰ（批號(hào)：110867-201607）、丹參酮ⅡA（批號(hào)：110766-202022）均購自中國食品藥品檢定研究院，西紅花苷Ⅰ（上海澤葉生物科技有限公司，批號(hào)：ZY67302SD），色譜純乙腈（上海優(yōu)試化工有限公司，批號(hào)：20200322），色譜純甲醇（廣州浩盈化工科技有限公司，批號(hào)：20200310）。肝復(fù)顆粒共12 批，生產(chǎn)廠家為貴州君之堂制藥有限公司（批次分別為：200201、200202、200203、200204、020401、200402、200403、200404、200701、200702、200703、200704）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：COSMOSIL C18（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）。流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）。以0.8 ml/min 流速梯度洗脫（0～10 min，A：2%→16%；10～15 min，A：16% →16%；15～20 min，A：16%→50%；20～23 min，A：50%→70%；23～26 min，A：70% →2%；26～30 min，A：2%），檢測(cè)波長為205 nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 配制對(duì)照溶液

同一25 ml 容量瓶中放入適量的虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷為對(duì)照品，加甲醇溶解制成每毫升含虎杖苷0.28 mg、隱丹參酮0.36 mg、丹參酮Ⅰ0.44 mg、丹參酮ⅡA 0.14 mg、西紅花苷Ⅰ 0.22 mg、梔子苷0.12 mg 的混合溶液，備用。

2.3 配制供試品溶液

取肝復(fù)顆粒研磨成均勻細(xì)粉，稱量0.5 g，放入具塞錐形瓶中，添加色譜純甲醇溶解，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）提取30 min 取出、放冷，加色譜純甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后得所需濾液。

2.4 配制陰性供試品溶液

按照顆粒制備工藝，分別制備小樣虎杖、丹參及梔子陰性顆粒，并按“2.3”方法分別制備陰性溶液。

圖1 各樣品高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)

2.5.1 線性試驗(yàn)

采用甲醇按比例稀釋“2.2”中混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別稀釋2、10、50、100 倍。按色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算對(duì)照品的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表1。

表1 6 種成分的線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn)

根據(jù)“2.1”方法色譜條件將混合對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積、保留時(shí)間，虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard devition，RSD）分別為0.22%、0.42%、0.83%、0.17%、0.31%及0.24%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性

稱量6 份顆粒粉末，按供試品制備方法制得樣品 6 份，根據(jù)“2.1”方法色譜條件測(cè)定，記錄保留時(shí)間、峰面積，計(jì)算虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷的平均含量分別為1.7427 、1.3941 、1.2448 、0.7967 、0.4481 mg/g，RSD 分別為1.31%、0.26%、1.55%、0.38%、1.31%及0.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性

根據(jù)“2.1”方法色譜條件分別對(duì)制備后 0、2、4、8、12、24 h 試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積、保留時(shí)間，計(jì)算虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷的RSD 分別為0.34%、1.28%、1.37%、0.61%、1.28% 及1.23%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率

在具塞錐形瓶中放入已知含量的樣品0.5 g，6 份，按100%加入6 個(gè)對(duì)照品，按照“2.3”實(shí)驗(yàn)方法制成供試品溶液，測(cè)定溶液中成分的含量并計(jì)算回收率，同時(shí)以溶液檢測(cè)時(shí)的信噪比S/N ≥3 作為最低檢測(cè)限，見表2。

表2 加樣回收率結(jié)果

2.5.6 系統(tǒng)適應(yīng)性

參照《中國藥典》[7]2015 年版第4 部“0512 高效液相色譜法”中系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)進(jìn)行考察，結(jié)果其柱效、分離度、靈敏度、重現(xiàn)性等均符合規(guī)定，故可用于含量測(cè)定。

2.6 樣品含量測(cè)定

取12 批次樣品，分別按“2.3”方法制備供試品溶液各3 份，每個(gè)溶液按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定2 次，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算虎杖苷、西紅花苷Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、梔子苷的含量，見表3。

2.7 數(shù)據(jù)分析

將表3 中的定量數(shù)據(jù)采用SIMCA 13.0 軟件進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）分析，結(jié)果如圖2 所示，12 個(gè)批次的肝復(fù)顆粒分為3 類，通過不同月份的生產(chǎn)批次區(qū)分，其成分含量差異與不同月份顆粒樣品的相對(duì)應(yīng)。

圖2 PCA 和OPLS-DA 分析結(jié)果

此外，定量數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 的聚類分析和因子分析后，結(jié)果見圖3，12 批次的顆粒樣品可分為3 類，均與月份樣品相對(duì)應(yīng)。此結(jié)果與PCA 的分析一致。因子分析中，以特征值>1，方差貢獻(xiàn)率>80%為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)成分1 和2 為主要的影響成分。由碎石圖和方差累積值（表4）可知，梔子苷和西紅花苷Ⅰ是影響差異的主要成分。

表4 解釋的總方差

圖3 聚類分析和因子分析結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定肝復(fù)顆粒中6 種成分，將乙腈作為有機(jī)相是由于色譜峰的基線平穩(wěn)和洗脫；選擇水相流動(dòng)相時(shí)，加入磷酸，在一定程度上可以調(diào)節(jié)峰的平滑度和峰形的對(duì)稱性。由于磷酸具有一定黏度，因此選擇柱溫為40 ℃、流速為0.8 ml/min，以便溶劑流動(dòng)相良好。在選擇上述參數(shù)的情況下，整個(gè)系統(tǒng)柱壓運(yùn)行平穩(wěn)，說明此提取條件可行。

因待測(cè)化合物具有不同的最大吸收波長，逐一選擇最大吸收波長對(duì)后期計(jì)算不便，因此綜合考慮選擇205 nm 為檢測(cè)波長，各化合物有一定的吸收強(qiáng)度。配制樣品時(shí)，需考察不同濃度溶劑對(duì)提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)采用70%甲醇作為提取溶劑時(shí)，各組分的含量處于一個(gè)整體，較其他溶劑（水、乙醇、50%甲醇、70%乙醇等）提取水平高。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，不同批次的6 種成分存在一定的差異，如丹參酮Ⅰ、虎杖苷在不同批次中含量差異波動(dòng)>50%，可能是由于生產(chǎn)投料時(shí)原藥材含量質(zhì)量差異所致，因此在選擇原藥材時(shí)，應(yīng)規(guī)范藥材產(chǎn)區(qū)，以維持成分含量的平穩(wěn)。且定量數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理后，篩查出影響差異的主要因素是梔子苷和西紅花苷Ⅰ，為相應(yīng)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

另外，本實(shí)驗(yàn)保證批次樣品間的穩(wěn)定性，縮小了批次間的差異性，建立了梔子苷和西紅花苷Ⅰ的定量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC 法對(duì)肝復(fù)顆粒6 種成分含量的測(cè)定以及質(zhì)量控制，對(duì)比較不同批次的樣品及藥效評(píng)價(jià)提供了一定的數(shù)據(jù)參考。