貴州南瓜蒂藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

傅 建 趙燕云 劉艷飛 李美位 張前飛*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，貴州 貴陽 550081

南瓜蒂(CucurbitamoschataDuchesne ex Poir)始載于《本草綱目拾遺》[1]，書中言“凡瓜熟皆蒂落，惟南瓜其蒂堅(jiān)牢不可脫”。南瓜蒂味苦，微甘，性平，歸肺、肝經(jīng)。有解毒消腫、利水、清熱安胎等功效，主要用于治療癰瘍，疔瘡，燙傷，也可用于瘡潰不斂，水腫腹水，保胎等證[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[3-5]表明南瓜蒂中的葫蘆素B和E具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗肝癌、抗胃癌、保肝及提高機(jī)體免疫力等。南瓜蒂收載于《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 (1994年版)[6]和《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 (2003年版)[7]。由于制定年代較早、基礎(chǔ)研究較為薄弱，只記載了其性狀、顯微鑒別等少數(shù)質(zhì)量檢查項(xiàng)，已無法滿足當(dāng)前的臨床用藥。為深入了解貴州南瓜蒂的物質(zhì)基礎(chǔ)，提升其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，筆者對南瓜蒂水分、總灰分、酸不溶性灰分和豆甾醇進(jìn)行定性和定量研究，為提升貴州南瓜蒂的地方標(biāo)準(zhǔn)，提高用藥安全奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫，Agilent Technologies 1260 InfintyⅡ)；蒸發(fā)光散射檢測器(美國格雷斯奧泰，Alltech 3300 ELSD)；超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，型號：sk8200H)；紫外儀(上海金達(dá)生化儀器有限公司)；電子天平(十萬分之一，島津，型號：AUW120D；萬分之一，上海菁海儀器有限公司，型號：FA2204N)。

1.2 材料 甲醇(色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；無水乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；硅膠板GF254(青島海洋化工)；鹽酸(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯、二氯甲烷(分析純，上海申博化工有限公司)；石油醚(分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司)；磷鉬酸(分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司)；豆甾醇(上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，大于等于98%)；12批南瓜蒂藥材均采自貴州省不同區(qū)域，開陽、德江、江口、綏陽、扎佐、貴陽，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室孫慶文教授鑒定為葫蘆科植物南瓜(CucurbitamoschataDuchesne ex Poir)的瓜蒂。1～12批次分別用S1～S12表示，藥材信息見表1。12批南瓜蒂批號為：20170901、20170902、20170903、20170904、20170905、20170906、20170907、20170908、20170909、20170910、20170911、20170912。

表1 南瓜蒂飲片產(chǎn)地信息一覽表

2 方法與結(jié)果

本文分別對上述12批次的南瓜蒂進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分、薄層色譜定性鑒別和HPLC-ELSD定量研究。

2.1 水分含量測定 按照2020版《中國藥典》四部(通則0832)的水分測定法第二法(烘干法)[8]。取供試品約2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，開啟瓶蓋在 105 ℃ 干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量(%)。結(jié)果見表2。

表2 南瓜蒂酸不溶性的測定

2.2 總灰分和酸不溶性灰分 按《中國藥典》2020版第四部(通則2302)的灰分測定法進(jìn)行測定，對總灰分、酸不溶性灰分進(jìn)行考察。測定用的南瓜蒂粉碎，通過二號篩，混合均勻后，取供試品約3.0 g，置熾灼恒重的坩堝中，稱定重量(精確至0.01 g)，緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至550 ℃，使完全灰化并至恒重，根據(jù)殘?jiān)亓浚?jì)算供試品總灰分含量(%)。取上述灰分置于坩堝中，緩慢加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水域上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液放入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘?jiān)盟从跒V紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓浚?jì)算供試品中算不溶性灰分的含量(%)。結(jié)果見表2。

2.3 豆甾醇定性分析(薄層色譜法)

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取10 mg豆甾醇對照品，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，制成1 mg/mL的豆甾醇溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取不同批號的南瓜蒂打粉后，過三號篩，分別精密稱取1.000 g置于具塞三角瓶中，分別加入20 mL甲醇，超聲1 h，補(bǔ)足減失的重量。精密量取續(xù)濾液25 μL，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓ㄈ葜?0 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 定性分析 取上述制備好的對照品溶液與供試品溶液，分別點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外儀下觀察后，噴以5%磷鉬酸試劑，用熱風(fēng)槍加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。觀察供試品與對照品斑點(diǎn)的位置。結(jié)果圖1所示，豆甾醇與南瓜蒂藥材在相同的Rf值處顯示對應(yīng)的斑點(diǎn)。初步確定南瓜蒂藥材及飲片中含有豆甾醇，為了進(jìn)一步證實(shí)，接下來將采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.豆甾醇對照品；2.貴州扎佐；3.貴州綏陽；4.貴州江口；5.貴州貴陽；6.貴州貴陽；7.貴州貴陽；8.貴州開陽；9.貴州開陽；10.貴州開陽；11.貴州德江；12貴州德江；13.貴州德江

2.4 豆甾醇含量測定(高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法)

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱定，豆甾醇對照品2.58 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 按照“2.3.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備供試品。

2.4.3 色譜條件 InertustainC18色譜柱(4.6 nm×250 nm，5 μm)，檢測器為ELSD，流動相為甲醇-水(90∶10)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，漂移管溫度80 ℃，氣體體積流量1.5 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。色譜圖如圖2所示。

注：上圖為對照品色譜圖；下圖為供試品色譜圖

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取不同體積的對照品2 μL、5 μL、10 μL、12 μL、15 μL、18 μL、20 μL，按照“2.4.3”項(xiàng)色譜條件下測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=2.0×107X-855.48 (r=0.9994)。結(jié)果表明進(jìn)樣量在0.050×10-3～0.500×10-3mg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。如圖3所示。

圖3 線性關(guān)系圖

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積。結(jié)果：對照品峰面積的RSD為1.6%(n=6)，說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定樣品6份，每份5.0 g，分別按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述“2.4.3”項(xiàng)色譜條件測定其峰面積。結(jié)果6份供試液含量的RSD為1.67%(n=6)，含量平均值為0.0444 μg/g，說明樣品重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性 按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)行測定其峰面積。結(jié)果表明供試品的峰面積的RSD為1.22%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已測得含量的樣品6份，每份2.5 g，分別精密加入一定體積的對照品溶液，再根據(jù)供試品制備的方法制備，按“2.4.3”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明6份的平均回收率為98.95%，RSD為2.29%，回收率良好。結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品含量測定 按照上述“2.3.2”供試品制備方法和“2.4.3”色譜條件下測定貴州不同地區(qū)南瓜蒂的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果

采用HPLC-ELSD法測定了來自于貴州省12批南瓜蒂藥材中豆甾醇的含量。結(jié)果顯示貴州南瓜蒂中均含有豆甾醇，但是含量差別較大。

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道南瓜蒂中安胎的主要成分是葫蘆素B[9]，所以本文首先對貴州不同地區(qū)南瓜蒂的葫蘆素B進(jìn)行研究，但是通過TLC和HPLC檢測，并未從貴州南瓜蒂中檢測到葫蘆素B。與此同時(shí)，報(bào)道南瓜蒂中也含有β-谷甾醇[10]，同樣通過TLC和HPLC-ELSD測定，也未從上述12批次貴州南瓜蒂中檢測到β-谷甾醇。因此最終選擇豆甾醇作為檢測對象。

3.2 薄層色譜法 分別考察了豆甾醇不同的展開劑系統(tǒng)，如氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯，最后確定二氯甲烷-乙酸乙酯為最佳展開系統(tǒng)，并對不同的比例(4∶1，8∶1，20∶1)進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明比例在20∶1時(shí)，Rf值適中。

3.3 高效液相色譜法 豆甾醇結(jié)構(gòu)中不含共軛系統(tǒng)，在紫外下不顯示熒光，故在TLC檢測時(shí)采用5%磷鉬酸顯色。ELSD是萜類、皂苷類等化合物較為適宜的檢測器[11]，因此本試驗(yàn)選用ELSD器對其進(jìn)行測定，方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可作為本品質(zhì)量控制方法之一。

綜上，本研究增加南瓜蒂藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中水分、灰分檢查，采用TLC定性分析豆甾醇，并首次采用HPLC-ELSD法測定貴州南瓜蒂中豆甾醇含量，完善南瓜蒂藥材質(zhì)量控標(biāo)準(zhǔn)，所建立的檢查限度合理，含量測定方法專屬性較強(qiáng)，精密度較高，重復(fù)性較好，為提升南瓜蒂藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。