利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選玉米ZmPRR73的互作蛋白

王盼盼 王雷立 張嚴(yán)玲 劉青青 董柯清 李安然 王翠玲

摘 要 關(guān)鍵詞 玉米；酵母雙雜交； ZmPRR73；生物鐘；互作蛋白

生物鐘（Circadian clock）是生命體對(duì)地球一年四季的季節(jié)變化和一天內(nèi)24 h晝夜節(jié)律的長期適應(yīng)而演化產(chǎn)生的一種復(fù)雜的內(nèi)在計(jì)時(shí)器。生物鐘可以幫助生命體感知并響應(yīng)周圍環(huán)境的周期性變化，從而調(diào)控生物體的新陳代謝、生長發(fā)育和增加對(duì)逆境脅迫環(huán)境的適應(yīng)性[1-4]。PRRs（pseudo-response regulators）家族蛋白基因是生物鐘中央振蕩器的重要組成部分，與兩個(gè)編碼MYB蛋白的基因LHY（late elongated hypocoty1）和CCA1（circadian clock associated 1）一起組成轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)，三者在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的晝夜周期性變化維持了生物節(jié)律鐘的晝夜節(jié)律[5-7]。

目前關(guān)于PRRs蛋白的研究主要集中LHY、CCA1 和PRRs的轉(zhuǎn)錄反饋抑制調(diào)控環(huán)上，著重于上游基因結(jié)合在下游基因的啟動(dòng)子上抑制其表達(dá)，通過ChIP-Seq技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組分析，科學(xué)家對(duì)擬南芥PRR9、PRR7、PRR5和TOC1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行研究，結(jié)果表明PRRs家族轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控植物的生長、光信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫和光周期調(diào)控開花途徑[8-11]。研究顯示LHY、CCA1 和PRRs的相互抑制調(diào)控不是上游基因直接結(jié)合在下游基因的啟動(dòng)子上，而是與其他基因互作，形成復(fù)合體后結(jié)合在后者的啟動(dòng)子上抑制其表達(dá)，例如，TOC1 與TCP21（TEOSINTE BRANCHED1-CYCLOIDEA-PCF21）互作來抑制CCA1的表達(dá)[12]。PRR9、PRR7和PRR5蛋白能通過其EAR（ERF-associated amphiphilic repression）結(jié)構(gòu)域與TOPLESS和HDA6（histone deacetylase 6）形成一個(gè)復(fù)合體，結(jié)合到CCA1和LHY的啟動(dòng)子上從而抑制CCA1和LHY的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)生物鐘周期[13]。因此篩選生物鐘基因PRRs的互作蛋白，對(duì)研究這些基因的反饋調(diào)控機(jī)制具有非常重要的意義。

與擬南芥和水稻中各存在5個(gè)PRR基因家族成員不同的是，玉米中共鑒定到9個(gè)ZmPRR基因（ ?ZmPRR1-1、 ZmPRR1-2、 ZmPRR37-1、 ZmPRR37-2、 ZmPRR73、 ZmPRR59-1、 ZmPRR59-2、 ZmPRR95-1和 ZmPRR95-2），除 ZmPRR73外，這些基因中分別有兩個(gè)與擬南芥AtPRR或水稻OsPRR基因家族成員高度同源[14-15]。河南科技大學(xué)玉米分子育種課題組前期對(duì)調(diào)控玉米開花時(shí)間和光周期敏感性的主效QTL ?qDPS9進(jìn)行了精細(xì)定位，并克隆了候選基因 ZmPRR73，生物信息學(xué)分析表明 ZmPRR73基因編碼的蛋白屬于偽應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白PRRs家族成員，與擬南芥 AtPRR7基因同源性最高[16]。研究表明 PRR7及其同源基因在擬南芥、水稻、高粱、小麥、大麥等植物的開花時(shí)間的光周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17-19]。近期研究表明PRRs家族不但在生物鐘節(jié)律中起關(guān)鍵作用，在植物應(yīng)對(duì)寒冷、干旱、氧化應(yīng)激、病原體攻擊等生物鐘基因在脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)中也起著非常重要的作用[20-23]。? ?ZmPRR73基因作為玉米生物鐘中央振蕩器的重要組成部分，在玉米開花時(shí)間調(diào)控中的分子功能和參與玉米逆境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制尚未見 ?報(bào)道。

酵母雙雜交技術(shù)是一種檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白間互作的技術(shù)，不僅可以檢測到蛋白之間穩(wěn)定的相互作用，也能夠敏感地檢測到蛋白質(zhì)之間微弱或短暫的相互作用，成為目前高通量篩選互作蛋白的最常用的方法。許多研究者構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到很多非常重要的與誘餌蛋白相互作用的蛋白[24-26]。本研究旨在從長日照處理的熱帶玉米自交系的cDNA文庫中初步篩選與ZmPRR73互作的蛋白，進(jìn)一步揭示 ZmPRR73基因在玉米光周期反應(yīng)和環(huán)境脅迫應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)通路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

長日照誘導(dǎo)熱帶玉米自交系CML288的酵母雙雜交cDNA文庫和攜帶目的基因 ZmPRR73的PMD19T-ZmPRR73質(zhì)粒由河南科技大學(xué)玉米分子育種課題組構(gòu)建并保存。質(zhì)粒提取試劑盒和酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。酵母菌株Y2H Gold、酵母雙雜交載體pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T、pGBKT7等購自上海歐易公司。Infusion連接酶和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。酵母缺陷型培養(yǎng)基和X-α-Gal等購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2 誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73的構(gòu)建

根據(jù) ZmPRR73基因和pGBKT7載體序列設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物（ ZmPRR73-in-F：CATGGAGGCCGAATTCATGGGCAGTGCT-TGCCAAGCTGGC； ZmPRR73-in-R：GCAGGTCGACGGATCCTCATCTTTCTGAACCTT-GCGCTGT）。以PMD19T-ZmPRR73質(zhì)粒為模板使用高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收、純化并鑒定目的片段；同時(shí)使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ對(duì)pGBKT7載體進(jìn)行雙酶切，膠回收并純化線性化后的載體；然后按照Infusion試劑盒的方法，利用同源重組技術(shù)將 ZmPRR73基因CDS序列插入到pGBKT7載體的酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ之間，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73。

1.3 誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73毒性及自激活檢測

把pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽性對(duì)照，pGBKT7-Lam+pGADT7-T作為陰性對(duì)照， pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7作為自激活檢測組，將對(duì)照組與自激活檢測組載體分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞。分別挑取陽性單克隆接種到SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/ X-α-Gal /AbA營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，30? ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母菌落生長情況。

1.4 酵母雙雜交文庫篩選及陽性克隆的鑒定

制備新鮮的酵母感受態(tài)細(xì)胞，將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-ZmPRR73與pGADT7-cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/ X-α-Gal固體培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩，挑選藍(lán)色陽性單克隆菌，接種到SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)度篩選。30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，菌落生長至約2～3 mm，挑選藍(lán)色陽性克隆單菌落接種于SD/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中， ?30? ℃培養(yǎng)16～18 h。菌液PCR 驗(yàn)證，對(duì)陽性菌液提取酵母質(zhì)粒，用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，送陽性菌液至上海生工測序。

1.5 互作蛋白的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

將構(gòu)建好的pGBKT7-ZmPRR73質(zhì)粒與pGADT7-候選互作蛋白質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)于Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Leu/-Trp/-His平板中，培養(yǎng)3～5 d。挑取單菌落在YPDA 液體培養(yǎng)基中30 ℃恒溫培養(yǎng)至菌液OD600約為0.8時(shí)，將菌液分別稀釋10倍、100倍、1 000倍、 ?10 000倍，各取5 μL點(diǎn)樣在SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察共轉(zhuǎn)酵母質(zhì)粒的生長情況。以pGBKT7-53+pGADT7-T為陽性對(duì)照， pGBKT7-lam+pGADT7 和pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7為陰性對(duì)照，平行重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73的構(gòu)建

前期從熱帶玉米自交系CML288中克隆到 ZmPRR73基因的CDS序列，片段大小為2 298 bp（圖1-A），以PMD19T-ZmPRR73 質(zhì)粒為模板，用引物ZmPRR73-in-F / ZmPRR73-in-R 使用高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的片段并驗(yàn)證，片段大小和測序結(jié)果與目的基因完全一致（圖1-A）。在此基礎(chǔ)上，利用同源重組的方法將目的片段 ZmPRR73與線性化的pGBKT7載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，挑取單克隆菌落做菌液PCR，測序結(jié)果顯示 ZmPRR73已插入到序列的正確位置，重組載體讀碼框正確，無移碼突變，說明目的基因與載體融合，pGBKT7-ZmPRR73誘餌載體構(gòu)建成功（圖1-B）。

2.2 誘餌載體毒性及自激活分析

將陽性對(duì)照pGBKT7-53/pGADT7-T、陰性對(duì)照pGBKT7-Lam/pGADT7-T和pGBKT7-ZmPRR73/pGADT7分別轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在30? ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。結(jié)果顯示陽性對(duì)照pGBKT7-53/pGADT7-T在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上有克隆生長且變藍(lán)，陰性對(duì)照pGBKT7-Lam/pGADT7-T和誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73/pGADT7在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上有白色克隆生長，但不變藍(lán)，說明pGBKT7-ZmPRR73質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌株中，且誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73對(duì)宿主酵母菌無毒性（圖2）。

陽性對(duì)照pGBKT7-53/pGADT7-T在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA 培養(yǎng)基上藍(lán)色克隆生長，陰性對(duì)照pGBKT7-Lam/pGADT7-T和誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73/pGADT7在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基上無克隆生長，說明pGBKT7-ZmPRR73不存在自激活現(xiàn)象（圖2）。綜上所述，誘餌載體pGBKT7-ZmPRR73在和空AD質(zhì)粒pGADT7共轉(zhuǎn)時(shí)，在Y2H Gold酵母菌株中沒有自激活活性，可用于后續(xù)篩庫實(shí)驗(yàn)。

2.3 互作蛋白的篩選與分離

以pGBKT7-ZmPRR73為誘餌蛋白，與熱帶玉米自交系CML288的葉片和根組織等量混合構(gòu)建的cDNA文庫共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2H Gold，涂布到三缺培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal上進(jìn)行初篩，挑取直徑大于2 mm且生長健康的藍(lán)色克隆，接種到四缺培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA上進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)度篩選。結(jié)果顯示，在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal缺陷培養(yǎng)基篩選平板上共有44個(gè)克隆生長變藍(lán)，再次轉(zhuǎn)到四缺培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA篩選平板上復(fù)篩后，共獲得18個(gè)候選陽性克隆（圖3）。對(duì)陽性克隆菌落提取酵母質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再次培養(yǎng)后送大腸桿菌陽性菌液至上海生工測序，測序結(jié)果顯示除去重復(fù)序列后最終確定有12個(gè)互作陽性克隆。

2.4 互作蛋白的測序及比對(duì)分析

測序結(jié)果顯示除去重復(fù)序列后最終確定有12個(gè)互作陽性克隆。生物信息學(xué)分析表明這些基因功能涉及植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、電子傳遞鏈等多個(gè)方面（表1）。值得注意的是，第2號(hào)蛋白編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶，具有甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性，可能參與S-腺苷甲硫氨酸生物合成過程[27-28]。第3號(hào)蛋白編碼擬南芥鐵氧還蛋白Ferredoxin5（Fd5）的同源基因，具有電子轉(zhuǎn)移活性和金屬離子結(jié)合功能，可能參與電子傳遞鏈，對(duì)植物的生長發(fā)育至關(guān)重要[29]。第11號(hào)蛋白編碼擬南芥AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子EREB17的同源基因，可能參與下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在植物的生長發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[30]?；プ鞯鞍字羞€有4個(gè)未知蛋白，其可能的功能仍需進(jìn)一步探究。

2.5 互作蛋白的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證ZmPRR73與篩選得到的蛋白之間存在的互作關(guān)系，從中選取1號(hào)蛋白Zm00001eb210500和2號(hào)蛋白Zm00001eb354640的cDNA 插入序列轉(zhuǎn)化含有pGBKT7 或pGBKT7-ZmPRR73轉(zhuǎn)化子的酵母感受態(tài)中，進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證（圖4）。陰性對(duì)照pGBKT7-Lam+pGADT7-T、陽性對(duì)照pGBKT7-53+pGADT7-T、空載對(duì)照pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7以及pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7-Zm00001eb210500和pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7-Zm00001eb354640均能在SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上正常生長。在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上，只有陽性對(duì)照pGBKT7-53+pGADT7-T和pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7-Zm00001eb210500以及pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7-Zm00001- eb354640能正常生長且顯現(xiàn)藍(lán)色，而陰性對(duì)照pGBKT7-Lam+pGADT7-T和空載對(duì)照pGBKT7-ZmPRR73+pGADT7均未見菌斑，表明Zm00001eb210500蛋白和Zm00001eb354640蛋白與ZmPRR73在酵母體內(nèi)均能夠發(fā)生相互作用，排除了假陽性的干擾。

3 討? 論

挖掘 ZmPRR73基因的互作蛋白是解析其功能及分子通路的關(guān)鍵。目前有關(guān)植物蛋白質(zhì)互作的研究方法有很多，包括酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system，Y2H）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）、pull-down技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（Protein chip）、親和純化-質(zhì)譜技術(shù)（AP-MS）和鄰近標(biāo)記技術(shù)（Proximity labeling）等[31]。其中酵母雙雜交技術(shù)是一種簡單易行、高通量、高靈敏度的檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，不論是對(duì)蛋白質(zhì)之間穩(wěn)定的相互作用還是微弱而短暫的相互作用均能夠敏感地檢測到。通過構(gòu)建不同處理?xiàng)l件下的酵母雙雜交文庫，將目的基因作為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與誘餌相互作用的蛋白，找到基因之間的聯(lián)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，建立蛋白連鎖圖，已經(jīng)成為解析重要基因的分子功能及信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑、分子通路的最常用的方法。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)挖掘出了 ZmPRR73基因的一些重要的互作蛋白，為進(jìn)一步解析 ZmPRR73基因的功能及作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。鑒于酵母雙雜交系統(tǒng)可能存在假陽性問題，需要繼續(xù)用雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)對(duì)互作蛋白進(jìn)行逐一驗(yàn)證，并通過互作蛋白之間的相互作用研究 ZmPRR73基因的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)通路。

本研究中篩選到12個(gè)與ZmPRR73相互作用的候選蛋白，包括外包膜孔蛋白24A、S-腺苷甲硫蛋氨酸合成酶1、鐵氧還蛋白5、富半胱氨酸/組氨酸C1結(jié)構(gòu)域家族蛋白、PTR 家族蛋白、核糖體蛋白、LBD轉(zhuǎn)錄因子、BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白、DUF3143家族蛋白、AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子17、DUF1997家族蛋白等。其中篩選到的2號(hào)基因（ Zm00001eb354640）編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶（ ZmSAMS1），是植物代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它催化ATP和L-甲硫氨酸反應(yīng)生成S-腺苷甲硫氨酸，在干旱、高溫、低溫、鹽和ABA等逆境脅迫環(huán)境下調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境的變化，對(duì)植物的適應(yīng)性具有重要意義[27-28]。本研究篩選鑒定到ZmSAMS1蛋白與生物鐘中央振蕩器核心元件ZmPRR73蛋白存在直接互作，表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶不但參與了干旱、高溫、低溫、鹽和ABA等逆境脅迫響應(yīng)，而且還與玉米的光周期反應(yīng)有關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 ?ZmSAMS1的啟動(dòng)子區(qū)域包含包括G-Box、AAGAA-motif、ATCC-motif、Box 4，Box-W1、GATA-motif、 ?I-box，chs-CMA2bGA-motif、GAG-motif、circadian等重要的光應(yīng)答元件，表明ZmSAMS基因的表達(dá)可能受光周期反應(yīng)的調(diào)控[28]。具體生物鐘基因 ZmPRR73如何影響S-腺苷甲硫氨酸的合成，或者S-腺苷甲硫氨酸合成酶 ZmSAMS1如何參與玉米的生物鐘反應(yīng)，深入研究二者相互作用的分子機(jī)制和生物學(xué)功能具有非常重要的意義。

篩選到的3號(hào)蛋白與擬南芥鐵氧還蛋白Ferredoxin5（Fd5）同源，有研究報(bào)道在植物光合過程中，光合型鐵氧還蛋白作為唯一的可溶性電子受體，可將來自光系統(tǒng)I的電子傳輸?shù)较掠胃鞣N代謝過程，將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，是光合電子向葉綠素代謝、碳氮同化、光敏色素合成、脂肪酸合成等生物學(xué)途徑分配的中樞元件，對(duì)植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。水稻鐵氧還蛋白I突變后會(huì)造成水稻光合電子傳遞受阻，光合碳同化過程被破壞，從而引起突變體內(nèi)源光合產(chǎn)物合成不足，導(dǎo)致突變體快速褪綠并致死的表型[29]。篩選到的5號(hào)蛋白（Zm00001eb251540）編碼植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1/PTR FAMILY 8.3，植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Nitrate transporter，NRT）是植物氮素營養(yǎng)系統(tǒng)的關(guān)鍵生物大分子之一，在吸收和感知外界硝酸鹽及信號(hào)調(diào)控方面有著重要的作用。NRT1/PTR FAMILY 8.3是二肽轉(zhuǎn)運(yùn)體，在氮循環(huán)中很活躍的，可以影響信號(hào)傳導(dǎo)過程和次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)過程，干旱促進(jìn)NRT1/PTR FAMILY 8.3基因的表達(dá)，隨著干旱程度的增加，其表達(dá)量顯著上調(diào)[32]。有文獻(xiàn)表明硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)活性受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[33-34]，但是其相關(guān)分子機(jī)制迄今未見報(bào)道，本研究鑒定到生物鐘元件ZmPRR73蛋白與玉米硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Zm00001eb251540存在互作，進(jìn)一步深入研究二者的互作機(jī)制，將為探索硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的晝夜節(jié)律表達(dá)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。11號(hào)蛋白編碼AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白EREB17，研究表明AP2-EREBP家族蛋白家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與了植物的細(xì)胞分化、激素調(diào)控、病源反應(yīng)以及生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)等各個(gè)生命過程，在植物的生長發(fā)育以及逆境脅迫應(yīng)答等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[30，35]。以上這些互作蛋白的發(fā)現(xiàn)，表明 ?ZmPRR73基因除了維持生物鐘節(jié)律外，還廣泛參與玉米生長發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、氮素營養(yǎng)調(diào)控、光合電子傳遞等重要的生理生化過程。

因此在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展玉米ZmPRR73與候選互作蛋白EREB17、SAMS1、Protein NRT1/ PTR FAMILY 8.3和FDX5的互作關(guān)系研究，對(duì)深入了解玉米 ZmPRR73基因的功能及其參與逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制有重要意義。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 謝啟光，徐小冬.植物生物鐘與關(guān)鍵農(nóng)藝性狀調(diào)控[J].生命科學(xué)，2015，27（11）：1336-1344.

XIE Q G，XU X D.Circadian clock and the control of key agronomic traits in higher plants[J].Chinese Bulletin of Life Sciences，2015，27（11）：1336-1344.

[2] 王 晗.生物鐘生物學(xué)及其研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2015，27（11）：1313-1319.

WANG H.Circadian biology and its recent progresses[J].Chinese Bulletin of Life Sciences，2015，27（11）：1313-1319.

[3] YAN J，KIM Y J，SOMERS D E.Post-Translational Mechanisms of Plant Circadian Regulation [J].Genes，2021， ?12（3）：325.

[4] 謝啟光，徐小冬.作物生物鐘的研究進(jìn)展與前瞻[J].植物生理學(xué)報(bào)，2022，58（1）：39-51.

XIE Q G，XU X D.Progress and prospects of circadian clock in agriculture[J].Plant Physiology Journal，2022，58（1）：39-51

[5] SHIM J S，KUBOTA A，IMAIZUMI T.Circadian clock and photoperiodic flowering in Arabidopsis：Constans? is a? hub for signal? integration[J].Plant Physiology，2017，173（1）：5-15.

[6] NOHALES M A，KAY S A.Molecular mechanisms at the core of the plant circadian oscillator[J].Nature Structural & Molecular Biology，2016，23（12）：1061-1069.

[7] 魏 華，王 巖，劉寶輝，等.植物生物鐘及其調(diào)控生長發(fā)育的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2018，53（4）：456-467.

WEI H，WANG Y，LIU B H， et al.Deciphering the underlying mechanism of the plant circadian system and its regulation on plant growth and development[J].Chinese Bulletin Botany，2018，53（4）：456-467

[8] HUANG W，PREZ-GARCA P，POKHILKO A，et al.Mapping the core of the Arabidopsis circadian clock defines the network structure of the oscillator[J].Science，2012，336（6077）：75-79.

[9] NAKAMICHI N，KIBA T，KAMIOKA M，et al.Transcriptional repressor PRR5 directly regulates clock-output pathways [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（42）：17123-17128.

[10] LIU T，CARLSSON J，TAKEUCHI T，et al.Direct regulation of abiotic responses by the Arabidopsis circadian clock component PRR7[J].The Plant Journal，2013， ?76（1）：101-114.

[11] CERVELA-CARDONA L，YOSHIDA T，ZHANG Y，et al.Circadian control of? metabolism by the clock component TOC1 [J]. Frontiers in Plant Science，2021，12：683516.

[12] NAKAMICHI N.The transcriptional? network in the Arabidopsis circadian clock system[J]. Genes（Basel），2020，11（11）：1284.

[13] WANG L，KIM J，SOMERS D E.Transcriptional corepressor TOPLESS complexes with pseudoresponse regulator proteins and histone deacetylases to regulate circadian transcription [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013， ?110（2）：761-766.

[14] WANG C L，WANG L L，LIU Q Q， et al.Genome-wide? identification and characterization of PRR gene family and their diurnal rhythmic expression? profile in? maize[J].International Journal of Genomics，2022，2022：6941607.

[15] LAI X，BENDIX C，YAN L，et al.Interspecific analysis of diurnal gene regulation in panicoid grasses identifies known and novel regulatory motifs[J].BMC Genomics，2020，21：428.

[16] 趙淑靚.玉米偽應(yīng)答調(diào)節(jié)基因 ZmPRR73的克隆與表達(dá)分析[D].河南洛陽：河南科技大學(xué)，2018.

ZHAO SH J.Gene cloning and expression analysis of? ?ZmPRR73 in Zea mays[D].Luoyang Henan：Henan University of Science and Technology，2018.

[17] WANG L，SUN S，WU T，et al.Natural variation and CRISPR/Cas9-mediated mutation in GmPRR37 affect photoperiodic flowering and contribute to regional adaptation of soybean[J].Plant Biotechnology Journal，2020， ?18（9）：1869-1881.

[18] 梁力文.水稻CCT家族基因OsPRR73和OsCO3調(diào)控抽穗期的分子機(jī)制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

LIANG L W.Study on the molecular mechanisms of rice CCT family genesOsPRR73 and OsCO3 in regulating heading date[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University，2020.

[19] ZHANG W，ZHAO G，GAO L，et al.Functional studies of? heading date-related gene TaPRR73，a? paralog of Ppd1 in common wheat[J].Frontiers in Plant Science，2016，7：772.

[20] YANG M，HAN X，YANG J，et al.The Arabidopsis circadian clock protein PRR5 interacts with and stimulates ABI5 to modulate abscisic acid signaling during seed germination[J].The Plant Cell，2021，33（9）：3022-3041.

[21] ZHANG Y，PFEIFFER A，TEPPERMAN J M，et al.Central clock components modulate plant shade avoidance by directly repressing transcriptional activation activity of PIF proteins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2020，117（6）：3261-3269.

[22] LI N，ZHANG Y，HE Y， et al.Pseudo response regulators regulate photoperiodic hypocotyl growth by repressing PIF4/5 transcription [J].Plant Physiology，2020，183（2）：686-699.

[23] 李劍峰，李 婷，賈小平.PRRs家族功能基因的研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2019，20（6）：1399-1407.

LI J F，LI T，JIA X P.Advances on unlocking the functional basis of PRRs family genes[J].Journal of Plant Genetic Resources，2019，20（6）：1399-1407.

[24] 鄭 凱，曲延英，倪志勇，等.海島棉纖維均一化酵母雙雜交文庫的構(gòu)建與GbTCP5互作蛋白的篩選[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，33（10）：1928-1939.

ZHENG K，QU Y Y，NI Z Y，et al.Construction of yeast two-hybrid? normalized cDNA? library and screening of? interaction? proteins of GbTCP5 in Gossypium barbadense? fiber[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2019，33（10）：1928-1939.

[25] 劉永惠，沈 一，沈 悅，等.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選花生AhMYB44互作蛋白[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2020， ?21（1）：201-207.

LIU Y H，SHEN Y，SHEN Y， et al.Yeast? two-hybrid screening of the? proteins? interacting with AhMYB44 from? peanut[J].Journal of Plant Genetic Resources，2020， ?21（1）：201-207.

[26] 范延艮，王 域，劉富浩，等.茶樹Cs HIPP26.1互作蛋白的篩選與驗(yàn)證[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，55（8）：1630-1641.

FAN Y G，WANG Y，LIU F H， et al.Screening and verification of CsHIPP26.1? interaction? protein in tea? plant[J].Scientia Agricultura Sinica，2022，55（8）：1630-1641.

[27] SUN F，MA J，WANG P， et al.Genome-wide? identification of the SAMS gene family in? upland cotton（Gossypium hirsutum? L.） and expression? analysis in drought stress treatments[J].Genes，2022，13（5）：860.

[28] 余愛麗，趙晉鋒，王高鴻，等.玉米SAMS家族基因鑒定及其在逆境脅迫下的表達(dá)分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016， ?32（8）：30-36.

YU A L，ZHAO J F，WANG G H，et al.Identification of SAMS genes from? maize and? its expression? under? adversity stresses[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2016，32（8）：30-36.

[29] HE L，LI M，QIU Z， et al.Primary leaf-type ferredoxin 1 participates in photosynthetic electron transport and carbon assimilation in rice [J].The Plant Journal，2020， ?104（1）：44-58.

[30] YU F，LIANG K，F(xiàn)ANG T，et al.A group VII ethylene response factor gene， ?ZmEREB180，coordinates waterlogging tolerance in maize seedlings[J]. Plant Biotechnology? Journal，2019，17（12）：2286-2298.

[31] QIN W，CHO K F，CAVANAGH P E，et al.Deciphering molecular interactions by proximity labeling [J].Nature Methods，2021，18（2）：133-143.

[32] CORRATG-FAILLIE C，LACOMBE B.Substrate（un）specificity of Arabidopsis NRT1/PTR FAMILY（NPF） proteins[J].Journal of Experimental Botany，2017， ?68（12）：3107-3113.

[33] 賈宏昉，張洪映，劉維智，等.高等植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能及其調(diào)控機(jī)制[J].生物技術(shù)通報(bào)，2014（6）：14-21.

JIA H F，ZHANG H Y，LIU W ZH，et al.Function and regulation mechanisms of? nitrate transporters in? higher? plants[J]. Biotechnology Bulletin，2014（6）：14-21.

[34] 徐海榮，谷俊濤，路文靜，等.水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 OsTNrt2.1的編碼蛋白特征和表達(dá)[J].作物學(xué)報(bào)，2007，33（5）：723-730.

XU H R，GU J T，LU W J，et al.Characterization and expression of? nitrate transporter gene ??OsTNrt2.1? in rice（Oryza sativa L.） [J].Acta Agronomica Sinica，2007， ?33（5）：723-730.

[35] JISHA V，DAMPANABOINA L，VADASSERY J，et al.Overexpression of an AP2/ERF type transcription factor ??OsEREBP1? confers biotic and abiotic stress tolerance in rice [J].PloS One，2015，10（6）：e0127831.

Screening of Proteins Interacting with ZmPRR73 in Maize Using Yeast Two-hybrid System

Abstract To elucidate its biological function，the bait vector PGBKT7-ZMPRR73 was constructed，and the proteins interacting with ZmPRR73 was screened from the yeast cDNA library of a tropical maize inbred line induced by long-day photoperiod treatment，using yeast two-hybrid technique.The results showed that the bait vector pGBKT7-ZmPRR73 exhibited no toxicity to yeast strains and did not activate the reporter gene on its own.A total of 12 candidate proteins that interacted with ZmPRR73 were identified.Bioinformatics analysis showed that these candidate interacting proteins were involved in various pathways，such as plant transcription regulation，ion transmembrane transport regulation，signal transduction and electron transport chain.This suggests that ZmPRR73 may participate in multiple signal transduction and metabolic pathways by interacting with the identified interaction proteins.The results enhance our understanding of the signal transduction and the regulatory pathways associated with ZmPRR73 and provide molecular evidence for further investigations into its molecular function and regulatory mechanism as a core component of circadian clock in maize.

Key words Maize; Yeast two-hybrid system; ?ZmPRR73; Circadian; Interacting protein