樹莓多糖組分RPP-6的分離、結構表征及其體外免疫和抗氧化活性研究

陸杰 楊永晶 尹星星 王學紅 晁沐

摘 要 旨在對從樹莓粗多糖中分離純化出的樹莓多糖組分RPP-6進行結構表征及體外免疫活性和抗氧化活性研究。采用DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200對樹莓粗多糖進行分離純化。結合高效凝膠滲透色譜法（High-Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）、傅里葉紅外光譜法（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FT-IR）、氣相色譜-質譜聯用（Gas Chromatography and Mass Spectrometry，GC-MS）和甲基化等方法對RPP-6的結構進行表征。利用小鼠巨噬細胞RAW264.7和自由基清除試驗研究RPP-6的體外免疫與抗氧化活性。結果表明，RPP-6是一種酸性雜多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成，摩爾比為37.8∶30.8∶21.4∶6.0∶3.9 。RPP-6的峰位分子質量為7.645 ku、重均分子質量為7.769 ku、數均分子質量為6.310 ku。RPP-6中存在15種單糖連接方式，其中Araf-（1→、→4，6）-Glcp-? （1→、→4）-Galp-（1→和→4）-Xylp-（1→為主要連接方式，含量分別為20.64%、8.59%、24.04%和? 16.92%。RPP-6能明顯提高小鼠巨噬細胞RAW264.7的活力和吞噬能力，并促進細胞中TNF-α（Tumor Necrosis Factor，TNF）、IL-6（Interleukin-6，IL-6）、IL-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和NO（Nitric Oxide，NO）釋放。RPP-6對ABTS·+具有較高的清除作用，對DPPH·的清除作用不明顯。表明RPP-6是一種多支鏈的均一酸性雜多糖，具有顯著的免疫增強活性和一定的抗氧化活性。

關鍵詞 樹莓；結構表征；免疫活性；抗氧化活性

樹莓（Rubus idaeus L.）是薔薇科懸鉤子屬植物，又名懸鉤子、覆盆子、三月泡、山莓等，在中國東北、甘肅、青海、新疆和西藏等地均有分布［1-2］。樹莓為藥食同源植物，其果實鮮嫩多汁，酸甜可口，具有很高的營養價值和藥用價值以及悠久的用藥歷史［3］。古籍中記載覆盆子為“金玉之品”，味甘性平、無毒，具有益氣輕身、益腎固精、補肝明目和縮尿等功效［4］。現代藥理學研究發現，樹莓包含多種營養成分，如多糖、氨基酸、黃酮類、蛋白質、維生素等，具有補腎、保肝、抗腫瘤、降血壓、抗衰老等藥理活性，被譽為“黃金水果”［5］。研究表明，樹莓果實能夠制作成乳酸菌發酵飲料、葡萄酒飲品、果凍和糖果等食品；其葉細胞提取物還能夠通過改善皮膚的粗糙度和抑制皺紋的產生達到抗衰老和美白的效果［6-7］。可見，樹莓不僅能夠加工制成各種食品，在醫藥、保健品、化妝品等領域也有廣泛的開發利用前景。

多糖是生物體中必不可缺的物質之一，是由多個單糖分子縮合、失水形成的一類高分子碳水化合物［8］。天然多糖廣泛存在于植物、動物和微生物中。其中，植物是天然多糖的重要來源［9］。研究表明，植物多糖毒副作用低，具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗菌等諸多活性，其中免疫調節和抗氧化活性尤為顯著［10-13］。植物多糖能夠激活免疫系統中的T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞等各類免疫細胞，促進細胞因子的分泌，從多方面調節免疫［14］。例如，構樹葉多糖能夠提高環磷酰胺誘導的雌性小鼠ICR的脾臟系數、白細胞數量、血清蛋白和血清抗體水平，修復腸道及脾臟組織損傷，從而提高小鼠的免疫功能［15］。黃芪多糖通過提高小鼠巨噬細胞RAW264.7的吞噬能力，促進一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、腫瘤壞死因子（Tumour Necrosis Factor，TNF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor，GM-CSF）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）以及白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的分泌，表現出顯著的免疫增強活性［16］。此外，植物多糖還可以有效地清除各類自由基［12］。研究表明，艾葉粗多糖能夠有效清除羥基自由基（Hydroxyl Radical，·OH）和超氧陰離子自由基（Superoxide Radical，O2-·），具有顯著的抗氧化活性［17］。苦瓜粗多糖清除O2-·、? ·OH和DPPH自由基（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazy Radical，DPPH·），具有較好的抗氧化作用［18］。由此可見，植物多糖可以作為天然的免疫調節劑和抗氧化劑，有巨大的開發潛力。

多糖是樹莓的主要活性物質之一，也是樹莓含量較高的營養成分［5］。徐麗萍等［19］通過響應面法優化紅樹莓多糖提取工藝，多糖產率可以達到10.69%。前期研究發現，栽培于青藏高原的紅樹莓中多糖提取率高達11.75%［20］。可見，樹莓是多糖的理想來源材料。近年來，一些學者發現樹莓多糖具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、抗氧化、降血壓、抗衰老等多種功能［3， 5， 21］。如Zhang等［22］從懸鉤子果實和葉子中提取的粗多糖，能夠清除DPPH·，表現出良好的抗氧化活性；從樹莓果肉中提取的樹莓粗多糖RPP，能夠提高荷瘤小鼠血清中TNF-α、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和白介素-2（Interleukin-2，IL-2）的濃度，具有顯著的免疫增強活性［23］。隨著樹莓多糖研究的逐漸深入，一些具有生物活性的多糖組分不斷從樹莓粗多糖中分離純化出來。例如，懸鉤子果膠粗多糖經DEAE cellulose-52纖維柱和Sephacryl S300凝膠柱分離純化得到的果膠多糖組分RCHP-S在小鼠巨噬細胞RAW264.7中對IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平有顯著抑制作用，表現出明顯的免疫增強活性［24］；采用D4020樹脂柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱分離純化得到的樹莓多糖組分RCP-I和RCP-Ⅱ，能夠顯著地清除DPPH·和·OH，體現出較強的體外抗氧化作用［25］。綜上所述，樹莓多糖在免疫調節劑和抗氧化劑的開發和應用方面具有極大的前景。

本研究對樹莓粗多糖進行分離純化，獲得多糖組分RPP-6并研究其結構特征。通過小鼠巨噬細胞RAW264.7模型和自由基清除試驗研究RPP-6的體外免疫調節和體外抗氧化活性，以期為樹莓多糖組分的進一步研究奠定試驗基礎，也為樹莓多糖的開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹莓冷凍果購自青海樹莓農業產業化有限公司（青海湟源）；小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院細胞庫；RAW264.7細胞專用培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；單糖標準品：鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖購自上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司；氯化鈉、三氟乙酸、乙酸均購自賽默飛世爾科技公司；硼氘化鈉、高氯酸、甲醇均購自默克生命科學有限公司；乙酸酐、醋酐、氫氧化鈉均購自上海滬試實驗器材股份有限公司；碘甲烷、二甲基亞砜、氫化鈉均購自上海阿達瑪斯試劑有限公司；乙酸乙酯購自北京沃凱生物科技有限公司；磷酸緩沖液（PBS）購自青海萊茵爾生物科技有限責任公司；DEAE-瓊脂糖凝膠（DEAE-Sepharose Fast Flow），葡聚糖凝膠Superdex G-200，甲基化試劑盒均購自揚州博瑞糖生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay，ELISA）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；NO測定試劑盒購自武漢生物技術有限公司；Phagocytosis Assay Kit（IgG FITC）購自Cayman化工公司；過硫酸鉀購自上海廣諾化學科技有限公司；抗壞血酸（VC）購自上海展云化工有限公司；DPPH、ABTS購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 設備與儀器

HF100三氣培養箱（上海力申科學儀器有限公司），AC2-4S8-CN生物安全柜（太倉藝思高醫療器械科技有限公司），Multiskan MK3酶標儀和D-37520 離心機（中國賽默飛世爾科技公司），CPA225D電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），R-1001VN旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司），UGC-24M 氮吹儀和101-1BS真空干燥箱（力辰科技有限公司），MS7-H550-Pro磁力攪拌器（無錫德凡儀器有限公司），RI-502 SHODEX示差折光檢測器（日本昭和電工基團），RID-10A FRC-10A高效液相色譜儀和GCMS-QP201氣相質譜聯用儀（日本島津公司），BSZ-100自動收集器、BRT105-104-102串聯凝膠柱和多糖凝膠純化系統（揚州博瑞糖生物技術有限公司），FT-IR650傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發展股份有限公司），SYNERGY LX 多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.3 樹莓多糖的分離純化

1.3.1 樹莓粗多糖的提取 采用水提醇沉法制備樹莓粗多糖［26］。樹莓冷凍果置于55 ℃干燥箱中除去水分，將其粉碎并篩除形狀完好的樹莓籽，得到樹莓果粉。稱取100 g樹莓果粉，加入石油醚（m∶V=1∶4），并置于磁力攪拌器中攪拌除脂。收集并風干濾渣，加入80%乙醇（m∶V=? 1∶4），于60 ℃加熱回流除去色素、單糖和寡糖，重復2次。風干濾渣后，加入水（m∶V=1∶5），于60 ℃超聲提取1 h。離心取上清，利用Sevag法除蛋白［27］，此操作重復3次。收集除去蛋白的提取液，60 ℃條件下經旋轉蒸發濃縮至原體積的? 1/4后加入4倍體積95%乙醇，4 ℃過夜后離心獲得沉淀，冷凍干燥后獲得淡粉色粉末即為樹莓粗多糖。

1.3.2 多糖分離純化 利用DEAE-Sepharose Fast Flow對樹莓粗多糖進行極性分離［28］。稱取1 g樹莓粗多糖溶于蒸餾水配置成100 mg/mL的樹莓粗多糖溶液，經DEAE-Sepharose Fast Flow（7.5 cm × 60 cm）柱層析時分別采用蒸餾水以及不同濃度（0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.8 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L）的氯化鈉溶液作為洗脫液，流速為15 mL/min，每個濃度沖洗3～4個柱體積。按5 mL/管收集洗脫液，并采用苯酚硫酸法檢測多糖含量［29］。收集洗脫組分，冷凍干燥后配置成100 mg/mL的多糖水溶液。采用配有Sephadex G-200葡聚糖凝膠層析柱（2.6 cm × 60 cm）的多糖凝膠純化系統進一步純化，以0.5 mL/min流速的蒸餾水洗脫，結合RI-502示差折光檢測器在線檢測多糖含量，將收集到的餾分濃縮、冷凍干燥后用于后續研究。

1.4 樹莓多糖組分RPP-6結構表征

1.4.1 分子質量測定 采用高效凝膠滲透色譜（High-Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）法檢測樹莓多糖組分的純度并測定其分子質量［30］。將樹莓多糖組分配制成5 mg/mL溶液，12 000 r/min離心10 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾后使用配有BRT105-104-102串聯凝膠柱（8 mm×300 mm）和RI-502示差折光檢測器的LC-10A HPLC系統測定RPP-6的分子質量。將柱溫維持在40 ℃，以0.6 mL/min的0.05 mol/L氯化鈉溶液作為流動相。以不同分子質量的右旋糖酐（5、11.6、23.8、48.6、80.9、148、273、409.8和670 ku）作為標準品繪制標準曲線，并根據校準曲線計算樹莓多糖組分的分子質量。

1.4.2 單糖組成分析 采用高效陰離子交換色譜法（High-performance anion exchange chromatography，HPAEC）分析多糖樣品的單糖組成［30］。將樹莓多糖組分和單糖標準品乙酰化，具體方法如下：取2 mg多糖，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸，120 ℃下水解90 min。使用旋轉蒸發儀蒸干后加入2 mL雙蒸水，用100 mg硼氫化鈉還原，加入冰醋酸中和，旋蒸，110 ℃烘干。再加入1 mL乙酸酐于100 ℃反應1 h，冷卻后加入3 mL甲苯，減壓濃縮蒸干。重復以上步驟4～5次以除去多余的乙酸酐，獲得乙酰化衍生物。使用配有CarboPacTMPA-20分析柱（3 mm × 150 mm）和脈沖電流檢測器的Dionex ICS-5000系統測定乙酰化衍生產物。采用等體積的250?? mmol/L氫氧化鈉溶液洗脫10 min，再用500 mmol/L含有50 mmol/L氫氧化鈉的醋酸鈉洗脫30 min，流速為0.3 mL/min，洗脫溫度為? 30 ℃。通過與各標準品的保留時間和峰面積對比最終確定樹莓多糖組分的單糖組成。

1.4.3 FT-IR分析 取樣品2 mg和溴化鉀200 mg，混合后壓成粉末，置于FT-IR650傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描記錄，掃描波長為400～? 4 000? cm-1。

1.4.4 甲基化分析 稱取2 mg樹莓多糖組分，加入1 mL無水二甲基亞砜，快速加入甲基化試劑A液，封閉，經超聲溶解后，再加入甲基化試劑B液，在水浴30 ℃的條件下反應60 min，最后加入2 mL超純水終止甲基化反應。甲基化產物加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸水解90 min，然后采用60 mg硼氫化鈉還原水解物8 h，加入冰醋酸中和，旋蒸，101 ℃烘箱烘干，再加入1 mL乙酸酐于100 ℃反應1 h，冷卻后加入甲苯減壓濃縮蒸干。重復上述步驟4～5次，除去多余的乙酸酐，獲得乙酰化產物。將乙酰化產物用3 mL二氯甲烷進行萃取，二氯甲烷層以適量的無水硫酸鈉干燥。采用配有RXI-5 SIL MS色譜柱（30 m×?? 0.25 mm×0.25 μm）的GC-MS測定乙酰化產物。GC-MS條件如下：起始溫度為120 ℃，以? 3 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；以氦氣為載氣，流速為1 mL/min；進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃。

1.5 樹莓多糖組分RPP-6的體外免疫活性

1.5.1 RAW264.7細胞培養 將RAW264.7巨噬細胞用含15% FBS的RAW264.7細胞專用培養基于37 ℃、5% CO2的三氣培養箱中培養，定期更換培養基。

1.5.2 RAW264.7細胞活力 待細胞密度為80%左右時，將RAW264.7細胞以1.0×104? 個/孔的濃度接種至96孔板中。在37 ℃、5% CO2三氣培養箱中培養12 h，棄去舊培養液，加入不同質量濃度的樹莓多糖組分溶液（20、40、80、160?? μg/mL）和5 μg/mL的陽性對照脂多糖（Lipopolysacchatide，LPS）溶液，以不含樹莓多糖組分和LPS的孔作為空白對照組，每個濃度設置6個復孔，于三氣培養箱中培養24 h后每孔加入10 μL? CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2三氣培養箱孵育1 h，使用酶標儀于450 nm處測定吸光值。

1.5.3 RAW264.7細胞吞噬能力鑒定 RAW264.7細胞培養及處理同“1.5.2”，在每孔細胞中加入0.2? μL Latex Beads-Rabbit IgG-FITC Complex，于37 ℃ 5% CO2的三氣培養箱中培養4 h后，每孔加入10? μL的臺盼藍溶液（1 ×）固定1～2 min，經緩沖溶液清洗后，使用熒光酶標儀在ex/em 485 nm/535 nm處測定熒光強度，評估RAW264.7細胞的吞噬能力。

1.5.4 NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量測定 RAW264.7細胞培養及處理同“1.5.2”，收集細胞培養上清液。根據NO測定試劑盒和ELISA試劑盒說明書測定RAW264.7細胞上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

1.6 樹莓多糖組分的體外抗氧化活性

1.6.1 DPPH·自由基清除能力測定 配置不同質量濃度的樹莓多糖組分樣品溶液（5、10、20、40、80、160、320 μg/mL），分別取2 mL置于試管中，隨后加入2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，搖勻，于37 ℃避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度，并按照以下公式計算? DPPH·[JP4]清除率［31］。以抗壞血酸（VC）作為陽性對照。

DPPH·清除率=［A0-（A1-A2）］/A0 × 100%

式中：A0為2 mL DPPH-乙醇與2 mL無水乙醇混合溶液的吸光值；A1為2 mL樹莓多糖組分樣品與2 mL無水乙醇混合溶液的吸光值；A2為2 mL樹莓多糖組分樣品與2 mL DPPH-乙醇混合溶液的吸光值。

1.6.2 ABTS·+自由基清除能力測定 將5 mL濃度為7 mmol/L的ABTS·+溶液與等體積濃度為2.45 mmol/L過硫化鉀溶液混合，4 ℃避光保存16 h，用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光值為0.70±0.02。取不同濃度的多糖溶液與ABTS·+工作液各1.5 mL，充分混勻后，避光反應6 min后于734 nm處測定吸光度，以VC為陽性對照，計算ABTS·+清除率［32］。

ABTS·+清除率= （A0-A1）/A0×100%

式中：A0為空白（無水乙醇）的吸光值；A1為RPP-6樣品的吸光值。

1.7 數據分析

對數據采用IBM SPSS統計軟件（第26版）進行統計學分析。試驗數據均以“平均值±標準偏差”表示，采用ANOVA單因素方差分析進行組間比較。P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 多糖的分離與純化

如圖1-A所示，在DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱上經不同濃度氯化鈉（0? mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.8 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L）溶液洗脫后獲得6種組分，分別命名為組分1、組分2、組分3、組分4、組分5和組分6。其中，組分1為中性多糖，組分2～6均為酸性多糖。收集組分6（2.0 mol/L氯化鈉洗脫），利用Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱進一步純化。由圖1-B可知，經水洗脫后在163.447 min只出現一個對稱峰，說明該組分具有較好的分子質量均一性，并命名為RPP-6。

2.2 RPP-6的結構特性分析

2.2.1 RPP-6的分子質量分析

樹莓多糖組分RPP-6的HPGPC色譜圖如圖2所示，由圖可知，在保留時間為43.315 min處出現一個對稱多糖峰（保留時間為46.708 min處為流動相峰），由此也可以看出RPP-6是分子質量均一的多糖組分。根據標準品校準曲線，得出RPP-6的峰位分子質量為7.645 ku、重均分子質量為7.769 ku、數均分子質量為6.310 ku。

2.2.2 RPP-6的單糖組成分析 利用GC-MS分析各單糖標準品及樹莓多糖組分RPP-6的乙酰化衍生物，根據保留時間確定RPP-6的單糖種類，通過峰面積計算得出各單糖的摩爾百分比。由圖3可見，RPP-6由阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）和甘露糖（Man）組成，摩爾比為37.8∶30.8∶21.4∶? 6.0∶ 3.9。其中，阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的含量較高。

2.2.3 RPP-6的紅外光譜分析 如圖4所示，在紅外光譜中吸收帶為3 600～3 200 cm-1是-OH的伸縮振動吸收峰，這個區域的吸收峰是糖類的特征峰［33］。具體如下：3 428 cm-1是O-H的伸縮振動吸收峰，是糖類的特征峰［34］；在1 633 cm-1處有一個吸收峰，歸屬于結合水［35］；1 413 cm-1有吸收峰，歸屬于C-O伸縮振動［36］；1 143 cm-1處為C-O的伸縮振動峰［37］；在871 cm-1處有特征峰，可能為端基差向異構C-H以外的赤道鍵的C-H變角振動［38］。

2.2.4 RPP-6的甲基化分析 將RPP-6的乙酰化產物經過GC-MS分析，得出如圖5所示15個主峰，根據Complex Carbohydrate Structure Database（https：//www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe）數據庫分析得出RPP-6中糖殘基的15種連接方式，見表1。其中，阿拉伯糖存在5種甲基化產物，即2，3，5-Me3-Araf、2，3，4-Me3-Arap、2，5-Me2-Araf、2，3-Me2-Araf和2，4-Me2-Arap，呋喃型阿拉伯糖占26.98%，吡喃型阿拉伯糖占4.37%。表明RPP-6中阿拉伯糖主要以呋喃環的形式存在，其連接方式以Araf-（1→，→5）-Araf-（1→為主，分別約占20.64%和? 5.31%；葡萄糖存在5種甲基化產物，均以吡喃環的形式存在，即2，3，4，6-Me4-Glcp、2，3，6-Me3-Glcp、2，6-Me2-Glcp、4，6-Me2-Glcp和2，3-Me2-Glcp，這些糖殘基的連接方式主要為→4，6）-Glcp-（1→、→4）-Glcp-（1→，→3和4）-Glcp-（1→，占比約為? 8.59%、4.41%和4.31%；半乳糖存在4種甲基化產物，分別為2，3，4，6-Me4-Galp、2，3，6-Me3-Galp、2，4，6-Me3-Galp和2，4-Me2-Galp，這些糖殘基表明RPP-6中半乳糖以吡喃環的形式存在，其連接方式主要由→4）-Galp-（1→和→3，6）-Galp-（1→組成，分別約占24.04%和3.77%；木糖只出現1種以吡喃環的甲基化產物，即2，3-Me2-Xylp，其連接方式為→4）-Xylp-（1→，約占16.92%。以上結果表明，RPP-6是具有多支鏈結構的雜多糖。

2.3 RPP-6的免疫調節活性

2.3.1 RPP-6對RAW264.7細胞活力的影響 如圖6所示，與空白對照組（圖中用0 μg/mL表示）相比，RPP-6在20～160? μg/mL極顯著增強RAW264.7細胞的細胞活力（P<0.01），且具有明顯的劑量依賴性。

2.3.2 RPP-6對RAW264.7細胞吞噬能力的影響 如圖7所示，與空白對照組（圖中用0 μg/mL表示）相比，經20? μg/mL RPP-6處理后，RAW264.7細胞的吸光值極顯著升高（P

2.3.3 RPP-6對RAW264.7細胞產生NO、TNF-α、IL-6以及IL-1β的影響 如圖8-A和8-B所示，經20～160? μg/mL的RPP-6處理后，與空白對照組（圖中用0 μg/mL表示）相比，RAW264.7細胞中NO和TNF-α的含量均極顯著升高（P<0.01），并呈現出明顯的劑量依賴性；圖8-C結果顯示，當RPP-6為40～160? μg/mL時，與空白對照組相比，RAW264.7細胞中IL-6的含量均極顯著升高（P<0.01）；圖8-D所示，RAW264.7細胞經40～160? μg/mL的RPP-6處理后，其IL-1β的含量與空白對照組相比顯著升高，當RPP-6為40? μg/mL時，RAW264.7細胞的IL-1β含量極顯著升高（P<0.01）。因此，RPP-6可以明顯刺激巨噬細胞產生NO，并分泌TNF-α、IL-6以及IL-1β。

2.4 RPP-6的體外抗氧化活性

如圖9-A所示，陽性對照VC為20～320??? μg/mL時對DPPH·清除率均在96%左右。樹莓多糖組分RPP-6的質量濃度大于40 μg/mL時，隨著其質量濃度升高，DPPH·清除率逐漸增強，當RPP-6為320? μg/mL時，DPPH·清除率為36%。

圖9-B結果顯示，VC為10～320? μg/mL時ABTS·+清除率均維持在90%左右，RPP-6對ABTS·+的清除能力與其質量濃度呈正相關，隨著質量濃度增大，清除自由基能力越強，且當RPP-6為320? μg/mL時，ABTS·+清除率達到86%，與VC在此質量濃度下的清除率接近，說明RPP-6具有較強的清除ABTS·+能力。

3 討論與結論

本研究對樹莓多糖組分RPP-6進行分子質量、單糖組成、傅里葉紅外光譜和甲基化分析，其結構特征如下：由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖5種單糖組成，摩爾比為37.8∶30.8∶21.4∶6.0∶3.9；峰位分子質量為7.645 ku、重均分子質量為7.769 ku、數均分子質量為? 6.310 ku；糖鏈中共含有15種糖殘基的連接方式，其中Araf-（1→、→4，6）-Glcp-（1→、→4）-Galp-（1→和→4）-Xylp-（1→為其主要的單糖連接方式。研究表明，來源于東北農業大學園藝站的樹莓果實粗多糖經D4020樹脂柱和Sephadex?G-100葡聚糖凝膠柱分離純化后獲得多糖組分RCP Ⅱ。RCP Ⅱ的分子質量為3.9? ku，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為1∶2.07∶0.72∶0.85∶3.54［25］。Sahragard等［24］從樹莓根部提取并分離純化得到一種雜多糖RAPS-1，由葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸組成，摩爾比為6.2∶1.0∶1.2，分子質量為7.9? ku。RAPS-1的主鏈由→4）-Glcp-（1→構成，分支由α-D-Galp-（1→和α-D-GlcAp構成。Yu等［39］利用D4020柱和Sephadex G-100柱純化得到的樹莓多糖組分RCP-II由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為? 1.00∶0.55∶1.19∶0.52∶0.44∶1.90，分子質量為4.013 ku。本研究采用的樹莓冷凍果源自青海湟源，經DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200凝膠柱分離純化得到的樹莓多糖組分RPP-6的分子質量、單糖組成以及連接方式與上述其他多糖相比存在一定的差異。可見，不同的樹莓品種、提取部位、提取方式和條件可能是造成樹莓多糖結構差異的主要原因［30， 39-40］。

多糖的生物活性與其結構特征密切相關，如分子質量、單糖組成以及連接方式的特征等［41］。研究發現，無論是低分子質量多糖還是高分子質量多糖均具有不同的免疫調節作用［30］。低分子質量的多糖結構簡單，跨膜阻力小，有利于其免疫活性的發揮［42］。相比之下，一些高分子質量的多糖由于存在更多的受體，也顯示出較強的免疫調節作用［43］。本研究結果顯示，RPP-6的峰位分子質量為7.645 ku、重均分子質量為7.769 ku、數均分子質量為6.310 ku，其分子質量介于低分子質量與高分子質量之間，利于其免疫增強活性的發揮。除分子質量外，單糖組成也是影響多糖免疫活性的重要因素。研究表明，阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖的含量越高，多糖增強巨噬細胞免疫活性的能力越強［44］。例如，牽牛子多糖組分PNP-5能夠抑制小鼠脾淋巴細胞增殖能力，具有免疫增強活性，PNP-5主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖構成，其摩爾百分比為32.3%、17.4%、13.7%、13.7%、9.9%和5.3%［45］。單糖組成對抗氧化活性也有一定影響。茯苓多糖由葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸組成，其摩爾百分比為99.24%、0.41%和0.35%，其中葡萄糖的含量最高，具有一定的抗氧化活性［46］。RPP-6中阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖含量較高，提示RPP-6可能具有較強的免疫增強活性和抗氧化活性。此外，連接方式也是影響多糖生物活性的因素之一。脹果甘草酸性多糖具有免疫增強活性，其多糖組分Gi P-B1的主要連接方式由1，5-Araf、1，4-GalpA、1-Araf和1，3-Galp構成［47］。孫延平等［45］發現牽牛子多糖組分PNP-5具有顯著的抗氧化能力，其糖殘基連接方式主要為1，2-Rhap、1，4，6-Manp和1，3，6-Galp。本研究中，RPP-6也存在1，4-Galp、1-Araf、1，5-Araf，1，3，6-Galp和1，3-Galp，說明RPP-6可能具有增強免疫和抗氧化作用。

巨噬細胞是趨化因子、基質金屬蛋白酶和其他炎癥介質的重要來源，在免疫調節中發揮著吞噬細菌、識別病原體、激活其他免疫細胞等作用［48］。TNF-α、IL-6、IL-1β等細胞因子和NO在炎癥反應和免疫反應的調節中也發揮重要作用［49］。TNF-α主要由激活的單核巨噬細胞產生，可以通過激活中心粒細胞和淋巴細胞，促使其他細胞因子的合成和釋放，同時，TNF-α還可以誘導巨噬細胞纖維化，促進組織修復［50］；IL-1β是由炎癥小體介導激活的細胞因子，能夠激活中心粒細胞和巨噬細胞吞噬病原體，在免疫反應中至關重要［51］；IL-6是由巨噬細胞產生的關鍵細胞因子之一，與免疫細胞的調節、增殖和分化等密切相關［52］；NO是參與免疫反應和炎癥反應的重要物質，具有促進巨噬細胞免疫調節活性的作用［53］。研究發現，很多植物多糖是通過影響巨噬細胞的功能來發揮其免疫調節作用［54］。本研究通過巨噬細胞RAW264.7的細胞活力和吞噬能力以及細胞中NO和相關細胞因子的分泌來評估RPP-6的免疫調節活性。結果表明，RPP-6能夠明顯提高RAW264.7細胞的活力和吞噬能力，并促進細胞中NO和細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的產生，說明RPP-6具有顯著的免疫增強活性。自由基是外部軌道中含有一個或多個不成對電子的化學物質，可以作為分子信號激活有益的應激反應，但過量的自由基會引起組織的氧化損傷和功能障礙［55］。DPPH·和ABTS·+自由基是評估抗氧化活性最常用的指標之一，它們已廣泛應用于天然產物的清除活性研究中［32， 56］。體外抗氧化試驗結果表明，RPP-6清除DPPH·能力不強，但對ABTS·+清除率高達86%，說明RPP-6可能通過清除ABTS·+發揮其抗氧化活性。

綜上所述，樹莓多糖組分RPP-6是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成的一種多支鏈的酸性雜多糖，具有顯著的免疫增強活性和一定的抗氧化活性，在功能性食品、化妝品、食品添加等方面有廣泛的開發前景。

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Isolation， Structural Characterization， Immunoregulatory and Antioxidant Activity of Raspberry Polysaccharide RPP-6 in Vitro

Abstract In the present study， the raspberry polysaccharide RPP-6 was isolated from raspberry pulp，and its structural characteristics，immunomodulatory and antioxidant activities were studied in vitro. RPP-6 was isolated and purified by DEAE-Sepharose Fast Flow and Sephadex G-200 chromatography and thestructural characteristics of RPP-6 were studied by high-performance gel permeation chromatography （HPGPC）， Fourier-transform infrared spectroscopy （FT-IR）， gas chromatography-mass spectroscopy （GC-MS） and methylation. RAW264.7 macrophages and free radical scavenging tests were conducted to evaluate the immunomodulatory and antioxidant activities of RPP-6.The results showed that? RPP-6 was composed of arabinose， glucose， galactose， rhamnose and mannose at a molar ratios of 37.8∶30.8∶21.4∶6.0∶3.9，respectively. The? peak molecular mass， average molecular mass? and number average molecular mass were 7.645? ku，7.769? ku， and 6.310? ku， respectively. RPP-6 was composed of 15 glycosyl linkages patterns， among which Araf-（1→， →4，6）-Glcp-（1→， →4）-Galp-（1→ and →4）-Xylp-（1→ were the main connection modes of sugar residues， accounting for?? about 20.64%， 8.59%， 24.04%， and 16.92%， respectively. RPP-6 significantly promoted the proliferation and phagocytosis of RAW264.7 cells and increased the release of tumor necrosis factor （TNF）-α， interleukin （IL）-6， IL-1β， and nitric oxide （NO） in RAW264.7 cells. RPP-6 exhibited? strong ABTS·+? radical scavenging ability，but exhibited no DPPH· free radical scavenging ability. In conclusion， RPP-6 is a homogeneous acidic heteropolysaccharide with a complex multi-branched structure， and has significant immune-enhancing activity and certain antioxidant activity.

Key words Raspberry polysaccharide; Structural characterization; Immune activity; Antioxidant activity