嗜熱毛殼菌端粒酶的表達純化及酶學特性分析

尹虎 宋澤玉 奚緒光

摘 要 為進一步探究端粒酶的酶學特性，以嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum， Thermo）端粒酶為研究對象，通過生物化學、生物信息學等方法得到4種不同長度的Thermo端粒酶蛋白，分別與體外轉錄得到的Thermo端粒酶RNA進行組裝。通過端粒酶體外延伸試驗檢測組裝體的反轉錄活性，進一步分析影響其反轉錄活性的各種因素。結果表明，4種不同長度的Thermo端粒酶蛋白重組質粒經大腸桿菌表達系統(tǒng)誘導表達后均可得到相應的Thermo端粒酶蛋白，且純度均在90%以上；體外孵育試驗表明，在10 mmol/L HEPES-KOH（pH 8.0）、1 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、體積分數(shù)25% Glycerol、10?? units/μL Rnasin的條件下，端粒酶蛋白與RNA的摩爾濃度比達到1∶1及以上時，兩者能有效復合；端粒酶體外延伸試驗發(fā)現(xiàn)，結構完整的Thermo端粒酶組裝體具有很強的反轉錄活性，可使18nt-DNA引物反復延伸。TEN結構域不完整并未減弱Thermo端粒酶組裝體的反轉錄活性，說明其在反轉錄過程中未發(fā)揮顯著作用。? T-PK區(qū)或TWJ區(qū)缺失的組裝體均不能使18nt-DNA引物發(fā)生延伸，表明RNA結構的完整性是端粒酶發(fā)揮反轉錄功能的必要條件。

關鍵詞 Thermo端粒酶；蛋白表達純化；RNA體外轉錄；反轉錄活性

真核生物染色體存在末端保護與末端復制問題[1]，隨著DNA復制次數(shù)的迭加，染色體末端長度會不斷縮短[2]。為了保護染色體末端不受細胞內核酸酶的降解，同時避免不同的染色體末端發(fā)生相互融合，真核生物細胞內存在一種特殊的結構——端粒。端粒由端粒DNA和多種端粒結合蛋白組成[3]，正常的細胞復制過程會導致端粒長度不斷縮短，當其縮短至某一臨界值時會引發(fā)細胞衰老，這種現(xiàn)象稱之為復制性衰老[4]，并不會對機體造成損傷。但是當端粒長度異常縮短時，則會導致多種疾病的發(fā)生，例如早衰、再生障礙性貧血[5]、先天性角化不良[6]、特發(fā)性肺纖維化[7]等，這些疾病統(tǒng)稱為“短端粒綜合征”[8]。除此之外，端粒的異常延伸也會造成嚴重的后果，如導致腫瘤或癌癥的發(fā)生。因此，端粒的長度必須受到嚴格的調控。

端粒酶是真核生物細胞中負責維持端粒長度穩(wěn)定的酶，它由端粒酶逆轉錄酶（TERT）和端粒酶RNA（TER）兩部分組成，主要功能是以其自身攜帶的RNA為模板，通過反轉錄的方式延伸端粒DNA，以維持端粒長度的穩(wěn)定[9]。最新研究表明，在紫外線照射、毒性重金屬污染、氧化應激等不利因素的影響下，端粒酶活性會降低甚至完全喪失，進而引發(fā)多種致死性疾病[10]，如癌癥、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、范科尼貧血等[11-14]。

由于端粒酶具有多種重要的生理功能，越來越多的科研工作者聚焦于端粒酶的研究[15]，近些年也取得了豐碩的成果，成功解析了四膜蟲、赤擬谷盜、假絲酵母等多種生物的端粒酶晶體結構[16-21]。但是目前關于端粒酶的探索仍處于起步階段，端粒酶的純化方式仍然非常繁瑣、成本極高[22]，大大增加了端粒酶空間結構解析的難度。除此之外，關于端粒酶的酶學特性及活性的影響因素也鮮有報道，使得探索端粒酶工作機制的研究進程十分緩慢。2011年，Amlacher等[23]公布了嗜熱毛殼菌的基因組，這種真菌在60 ℃的高溫條件下仍可存活，其具有的極高熱穩(wěn)定性可為端粒酶的表達純化提供便利，但近些年來幾乎沒有任何關于嗜熱毛殼菌端粒酶的報道。鑒于此，本研究以嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum， Thermo）端粒酶為研究對象，通過大腸桿菌（E coli.）原核表達系統(tǒng)得到高純度的Thermo端粒酶蛋白，并將其與體外轉錄得到的Thermo端粒酶RNA進行組裝，深入研究了Thermo端粒酶的酶學特性及其活性的影響因素，為端粒酶純化提供了新的技術路線，為端粒酶酶學特性的深入研究及后續(xù)的晶體結構解析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材? 料

1.1.1 質粒、載體及菌種 Thermo端粒酶蛋白編碼的基因序列（載體pUC-57-ThermoFL），由General Biosystems公司合成；表達載體pET-21a與pET-15b-sumo、大腸桿菌菌株C2566H均由西北農林科技大學生命科學學院奚緒光教授實驗室保存。

1.1.2 試劑及儀器 限制性內切酶NdeⅠ、? SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ購自Takara公司；T4 DNA連接酶、PageRulerTM Prestained Protein Ladder均購自Thermo Scientific公司；其余試劑均為進口或國產分析純；梯度基因擴增儀（PCR儀）購自美國ABI公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國UVP公司；疊放式低溫搖床購自瑞士? INFORS HT公司；紫外分光光度計購自北京普析通用公司；Avanti J-26XPI落地式離心機購自BECKMAN公司；超聲波破碎儀購自江南儀器廠；低溫高壓細胞破碎儀購自聚能生物公司；AKTA prime蛋白純化系統(tǒng)購自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 Thermo端粒酶蛋白的生物信息學分析 使用PSI-PRED工具（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）進行Thermo端粒酶的二級結構預測與序列無序性分析；使用Swiss-Model工具[SWISS-MODEL （expasy.org）]進行Thermo端粒酶結構預測，將Thermo端粒酶的氨基酸序列導入并進行同源建模，選擇最適模型下載。

1.2.2 Thermo端粒酶蛋白表達載體的構建 使用限制性內切酶NdeⅠ與SalⅠ對由General Biosystems公司合成的pUC-57-ThermoFL質粒進行雙酶切，將帶有粘性末端的基因片段經膠回收試劑盒純化后與表達載體pET-21a相連接，構建重組質粒pET-21a-ThermoFL。將連接產物轉化至E coli.2984感受態(tài)細胞中，進行菌落PCR鑒定并提取質粒測序。

以重組質粒pET-21a-ThermoFL為模板，使用不同的上下游引物分別構建3種不同長度的Thermo端粒酶截短蛋白基因片段（Thermo45-1125，Thermo309-1125，Thermo336-1125），引物序列信息如表1所示。將3種基因片段分別與表達載體pET-21a、pET-15b-sumo連接，構建重組質? 粒pET-21a-Thermo45-1125、pET-15b-sumo-Thermo309-1125、pET-15b-sumo-Thermo336-1125并進行菌落PCR鑒定，提取質粒。因為pET-21a載體酶切使用的限制酶Xho Ⅰ與目的基因酶切使用的Sal Ⅰ為同尾酶，兩者連接后無法再進行雙酶切檢測，所以只對重組質粒pET-15b-sumo-Thermo309-1125與pET-15b-sumo-Thermo336-1125進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切檢測。

1.2.3 Thermo端粒酶蛋白的誘導表達與純化 將鑒定正確的重組質粒pET-21a-ThermoFL轉化到表達菌株E coli.C2566H的感受態(tài)細胞中，挑取單克隆菌落進行活化，以1∶1 000的體積比將活化后的菌株接種于1.5 L LB培養(yǎng)基中，? 37 ℃下160 r/min擴大培養(yǎng)至OD600為0.6左右。加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，18 ℃下140 r/min誘導14～16 h。離心收集菌體，以? 1∶10（質量∶體積）的比例加入預冷的細胞裂解緩沖液[20 mmol/L HEPES（pH 7.0），500 mmol/L NaCl，體積分數(shù)10% Glycerol，? 5?? mmol/L Imidazole]重懸菌體。使用低溫高壓細胞破碎儀對菌體進行裂解，然后使用超聲波破碎儀將殘留的DNA打斷。將超聲破碎后的裂解液高速離心后取上清液，經0.45 μm濾膜過濾后加載至抗EDTA-Ni柱進行純化。上樣完成后使用Wash Buffer[20 mmol/L HEPES（pH 7.0），20 mmol/L Imidazole，體積分數(shù)10% Glycerol，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT]除去非特異性結合的蛋白。最后，使用? Elute Buffer[20 mmol/L HEPES（pH 7.0），500 mmol/L NaCl，500 mmol/L Imidazole，體積分數(shù)10% Glycerol，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT]進行蛋白洗脫并收集樣品。使用預冷的無鹽緩沖液將蛋白樣品中的鹽離子濃度降至300 mmol/L，加載至Hi Trap SP HP柱并進行NaCl濃度梯度洗脫，收集洗脫樣品并使用10% SDS-PAGE電泳檢測。使用50 ku濃縮管將純化后的目的蛋白濃縮，濃縮后的蛋白樣品液氮速凍后置于-80 ℃保存。使用相同方法對Thermo45-1125、Thermo309-1125與Thermo336-11253種端粒酶截短蛋白進行誘導表達與純化。

1.2.4 Thermo端粒酶RNA的體外轉錄與純化 將完整的Thermo端粒酶RNA分為Template區(qū)、PK區(qū)以及TWJ區(qū)分別進行轉錄與純化，端粒酶RNA不同片段的轉錄與純化流程相同。通過PCR得到用于轉錄的DNA模板，然后制備轉錄體系，轉錄體系中包含轉錄模板、T7 RNA聚合酶以及10×轉錄Buffer、MgCl2、NTP、DTT等成分，其中DTT濃度固定為1 mmol/L，MgCl2和NTP的用量根據(jù)RNA片段的不同進行調整，通常MgCl2用量為25～35 mmol/L，NTP用量為? 4～8 mmol/L。各組分混勻后于37 ℃下轉錄? 3 h，轉錄得到的RNA樣品經高速離心后，將上清液加載到Mono Q柱上并進行NaCl濃度梯度洗脫，收集洗脫樣品進行Native-PAGE電泳檢測。若得到的樣品純度較高，則使用3 ku濃縮管進行濃縮，液氮速凍后置于-80 ℃?zhèn)溆茫蝗舻玫降臉悠芳兌容^低，則使用S200分子篩進行二次純化，純化后將RNA樣品濃縮、-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Thermo端粒酶蛋白與RNA的復合活性測定 使用體外孵育的方法將Thermo端粒酶蛋白與Thermo端粒酶RNA進行復合，反應體系各組分濃度為：10 mmol/L HEPES-KOH（pH?? 8.0），1 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，? 3 mmol/L KCl，體積分數(shù)25% Glycerol，10?? units/μL RNasin。在此體系中加入Thermo端粒酶蛋白與Thermo端粒酶RNA，為了檢測Thermo端粒酶蛋白的復合活性，分別以0.5∶1/1∶1/1.5∶1的蛋白和RNA摩爾比加入上述復合體系中，將各組分混合均勻，在室溫下孵育40 min。待反應結束后，進行10% Native-PAGE電泳檢測，觀察Thermo端粒酶蛋白與端粒酶RNA是否發(fā)生復合，進一步探索兩者發(fā)生復合的最適條件。

1.2.6 Thermo端粒酶組裝體的反轉錄活性測定 使用5′端標記有6-FAM熒光基團的18 nt DNA序列（5′-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3′）為引物進行Thermo端粒酶延伸試驗。將Thermo端粒酶蛋白與Thermo端粒酶RNA按照摩爾比1∶1.2的比例進行混合并于室溫下靜置40 min，得到濃度為10～20 μmol/L的Thermo端粒酶組裝體。配制端粒酶引物延伸體系：40 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L Spermidine，100 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，0.2 mmol/L dNTPmix，2 mmol/L Mg（AC）2，0.5 μmol/L Thermo端粒酶組裝體，1 mmol/L DNA引物。將延伸體系混合均勻后置于37 ℃避光反應1 h，之后加入10 μL 8 mol/L Urea終止反應。隨后將樣品置于PCR儀中，98 ℃反應10 min，將冷卻后的樣品進行15% Urea-PAGE電泳檢測。

以上述Thermo端粒酶延伸體系為基礎，通過控制變量法依次分析RNase、端粒酶RNA結構完整性及端粒酶蛋白TEN結構域完整性對反轉錄活性的影響。

2 結果與分析

2.1 Thermo端粒酶蛋白的生物信息學分析

由圖1-A可知，Thermo端粒酶蛋白的二級結構中存在大量的α-螺旋與無規(guī)卷曲結構，其中無規(guī)卷曲主要在前500個氨基酸中形成，大量無規(guī)卷曲結構的存在使得Thermo端粒酶蛋白在結構上排列松散，導致其在晶體形成及空間結構解析方面存在極大困難。根據(jù)圖1-B所示結果，可以得知Thermo端粒酶蛋白的無序區(qū)主要集中在1～50、250～350以及800～900個氨基酸之間，無序區(qū)所占比例很大。

Thermo端粒酶蛋白的Swiss-Model同源建模結果如圖1-C所示，發(fā)現(xiàn)Thermo端粒酶蛋白主要由4個結構域組成，其中TEN結構域中柔性區(qū)所占比重很大，使得Thermo端粒酶蛋白的TEN結構域較為松散。

2.2 Thermo端粒酶蛋白載體構建與表達純化

2.2.1 Thermo端粒酶全長蛋白載體構建與表達純化 ThermoFL經菌落PCR鑒定，得到3.4 kb的片段（圖2-A），與預期片段大小一致。挑選其中的陽性單菌落，提取質粒。將重組質粒pET-21a-ThermoFL轉入表達菌株E coli.C2566H的感受態(tài)細胞中，經誘導表達得到Thermo端粒酶全長蛋白（126.8 ku），結果顯示目的蛋白在沉淀與上清液中均有出現(xiàn)（圖2-B），上清液樣品經抗EDTA-Ni柱和Hi Trap SP HP柱純化后，目的蛋白的純度得到極大提升（圖2-B，2-C），濃縮后得到的Thermo端粒酶全長蛋白分子質量與理論值一致且純度在95%以上（圖2-D）。

2.2.2 Thermo端粒酶截短蛋白載體構建與表達純化 將Thermo45-1125、Thermo309-1125與Thermo336-1125分別進行菌落PCR鑒定，依次得到3.2 kb、2.5 kb、2.4 kb的片段（圖3-A，3-B，3-C），與預期片段大小一致。挑選其中的陽性單菌落，提取質粒并進行雙酶切鑒定。重組質粒pET-15b-sumo-Thermo309-1125與pET-15b-sumo-Thermo336-1125經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后，所得片段大小與預期一致（圖3-D）。3種不同長度的Thermo端粒酶截短蛋白均可以成功誘導表達，使用的純化方法及流程同Thermo端粒酶全長蛋白。最終濃縮得到3種純度大于90%的Thermo端粒酶截短蛋白，并且3種蛋白的分子質量與理論值一致（圖3-E）。

2.3 Thermo端粒酶RNA的體外轉錄與純化

Thermo端粒酶RNA由Template區(qū)、PK區(qū)及TWJ區(qū)組成，以體外轉錄的方式分別得到各部分RNA片段，以Template區(qū)的轉錄與純化結果為例進行分析，PK區(qū)與TWJ區(qū)的純化流程及結果同Template區(qū)。由圖4-A可知，在6 mmol/L NTPs、30 mmol/L MgCl2的條件下，Template區(qū)的轉錄效果最為理想，以此條件進行Template區(qū)的大樣轉錄，得到大量純度較低的Thermo端粒酶RNA-Template區(qū)樣品（圖4-B泳道1），隨后經Mono Q柱及S200分子篩純化，目的片段的純度得到明顯提高（圖4-B，4-C），最終濃縮得到高純度的Thermo端粒酶RNA-Template區(qū)片段（圖4-D）。

2.4 Thermo端粒酶蛋白與RNA的復合活性測定

使用Native-PAGE檢測Thermo端粒酶蛋白與RNA的復合情況，若兩者發(fā)生復合，復合物的分子質量變大，在凝膠中的遷移速度變慢，電泳后的條帶向上偏移。根據(jù)圖5所示結果，ThermoFL、Thermo45-1125、Thermo309-1125與Thermo336-11254種不同長度的端粒酶蛋白均可與端粒酶RNA有效復合，說明Thermo端粒酶蛋白結合RNA的區(qū)域分布在336個氨基酸之后；根據(jù)Thermo端粒酶蛋白與RNA復合的摩爾濃度梯度試驗，發(fā)現(xiàn)當Thermo端粒酶蛋白與Thermo端粒酶RNA的摩爾比達到1∶1時，兩者就能達到很好的復合效果；而當端粒酶蛋白與RNA的摩爾比達到1.5∶1時，幾乎所有RNA均可結合到蛋白上，說明通過原核表達系統(tǒng)得到的Thermo端粒酶蛋白具有很強的RNA復合活性。

2.5 Thermo端粒酶組裝體的反轉錄活性測定及影響因素分析

通過端粒酶體外延伸試驗檢測反轉錄活性，結果如圖6-A所示，Thermo端粒酶組裝體使DNA引物在原有長度的基礎上發(fā)生了明顯的延伸，說明結構完整的Thermo端粒酶逆轉錄酶與RNA經體外復合組裝后，具有很強的反轉錄活性。圖6-B顯示，ThermoFL與Thermo45-1125端粒酶組裝體均可使DNA引物反復延伸，且兩者的延伸活力無明顯差別，說明Thermo端粒酶逆轉錄酶TEN結構域的完整性對于其反轉錄活性可能不是必需的。由圖6-C可知，當有RNase存在時，無論Thermo端粒酶組裝體結構是否完整，均無反轉錄活性，說明Rnase會抑制端粒酶的反轉錄活性。圖6-D與6-E顯示，當TWJ區(qū)與T-PK區(qū)均缺失時，端粒酶無反轉錄活性，泳道中僅有DNA引物條帶；當TWJ或T-PK片段有任意一部分缺失時，端粒酶反轉錄活性很弱；而當TWJ與T-PK結構域均完整時，端粒酶表現(xiàn)出極強的反轉錄活性，說明端粒酶RNA結構的完整性是其發(fā)揮反轉錄活性的必要條件。

3 討 論

端粒酶是一種具有特殊反轉錄活性的酶[24]，由端粒酶RNA（TER）和端粒酶逆轉錄酶（TERT）兩部分組成，主要功能是以其自身攜帶的RNA為模板，以細胞中游離的dNTP為原料，按照5′→3′方向反復延伸端粒DNA，從而解決染色體末端復制問題。本研究系統(tǒng)地構建了Thermo端粒酶蛋白的原核表達體系，得到了純度大于90%的Thermo端粒酶蛋白，并與Thermo端粒酶RNA在體外復合成了具有反轉錄活性的端粒酶組裝體。端粒酶逆轉錄酶在進化上具有高度的保守性，研究嗜熱毛殼菌端粒酶的酶學特性及空間結構對于探索人源端粒酶的工作機制具有很高的參考價值。目前獲得端粒酶的方式仍以內源蛋白純化為主，如四膜蟲、赤擬谷盜的端粒酶均通過Pull-down 實驗直接從細胞裂解液中獲得，純化成本高且純度、活性低[16-19，22]，本研究使用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功獲得了純度與活性都較高的端粒酶蛋白，打破了之前關于原核表達系統(tǒng)能否表達端粒酶的爭議，大大降低了端粒酶的純化成本。同時對Thermo端粒酶蛋白進行了無序區(qū)的預測，根據(jù)預測結果成功得到了3種Thermo端粒酶截短蛋白，為后續(xù)Thermo端粒酶的晶體結構解析奠定了基礎。

本研究利用體外轉錄的方式得到了Thermo端粒酶RNA，并與Thermo端粒酶蛋白成功組裝。試驗發(fā)現(xiàn)無論是Thermo端粒酶全長蛋白，還是3種截短蛋白，均可與Thermo端粒酶RNA較好地復合，說明TEN結構域在端粒酶蛋白與RNA的結合過程中無明顯作用，端粒酶蛋白與RNA相互作用的區(qū)域可能分布在336個氨基酸之后。同時發(fā)現(xiàn)當端粒酶蛋白與RNA的摩爾比達到1∶1以上時，兩者就能發(fā)生有效的復合，說明使用原核表達系統(tǒng)也能得到具有復合活性的端粒酶蛋白。

最后，本研究通過Thermo端粒酶體外延伸試驗，發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍捉Y構與RNA結構均保持完整時，Thermo端粒酶具有很強的反轉錄活性，而當RNA的T-PK區(qū)或TWJ區(qū)缺失時，端粒酶無反轉錄活性，說明RNA結構的完整是維持其反轉錄活性的必要條件。這一結論在脊椎動物及纖毛蟲中均可得到印證[25]，但在假絲酵母中，僅僅需要模板區(qū)的存在就能催化端粒 DNA 的合成，并不需要 TWJ、PK 等結構元件的協(xié)助[20-21]。說明端粒酶對TWJ和PK等結構元件的依賴性具有物種特異性，具體作用機制尚不清楚；除此以外，目前對于端粒酶蛋白的TEN結構域是否在端粒的反復延伸過程中發(fā)揮重要作用存在一定爭議[26]，例如在四膜蟲中，TEN結構域并未直接與端粒DNA或端粒酶RNA相互作用，而是通過TRAP-motif間接地調控反轉錄過程。而在赤擬谷盜的端粒酶晶體結構中，甚至沒有發(fā)現(xiàn)TEN結構域的存在[19]。因此本研究使用ThermoFL與Thermo45-1125兩種TEN結構域完整度不同的蛋白分別與RNA復合，發(fā)現(xiàn)兩者均可表現(xiàn)出很強的反轉錄活性。表明在嗜熱毛殼菌中，TEN結構域的完整性對于其反轉錄活性并不是必需的。

綜上所述，本研究為端粒酶純化提供了新的思路與研究方向，大大降低了端粒酶純化的成本，為端粒酶的晶體結構解析奠定了基礎。同時對端粒酶活性及其影響因素進行了一定程度的探索，為TEN結構域在反轉錄過程中是否發(fā)揮重要作用這一爭論提供了一定的參考，對于進一步解析端粒酶的工作機制具有重要意義。

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Expression and? Purification of Telomerase from Chaetomium?thermophilus and Analysis of Its Enzymatic Properties

Abstract To further investigate the enzymatic properties of telomerase，using Chaetomium thermophilum （Thermo） telomerase as the object，four different lengths of Thermo telomerase proteins were obtained by biochemistry and bioinformatics，and assembled with Thermo telomerase RNA obtained by? in vitro transcription.The reverse transcription activity of the assemblies was detected by telomerase in vitro extension assay，and various factors affecting their reverse transcription activity were further analyzed.The results showed that the recombinant plasmids of four different lengths of Thermo telomerase proteins could obtain the corresponding Thermo telomerase proteins after induction and expression by the E.coli expression system，and the purity of all of them was above 90%.The in vitro incubation assay showed that the molar concentration ratio of telomerase protein to RNA reached 1∶1 and under the conditions of 10 mmol/L HEPES-KOH （pH 8.0），1 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，25% Glycerol by volume，10 units/μL Rnasin above，the two can complex effectively;in vitro telomerase extension assay revealed that the structurally intact Thermo telomerase assemblies had strong reverse transcription activity and could make the 18nt-DNA primers extend repeatedly.The incomplete TEN domain did not diminish the reverse transcription activity of the Thermo telomerase assemblies，indicating that they did not play a significant role in the reverse transcription process.

Key words Thermo telomerase; Protein expression and purification; RNA transcription in vitro; Reverse transcriptional activity