熱加工對3 種帶魚肌球蛋白功能特性的影響

鄭文雄，楊榕琳，水珊珊,*，嚴紅波,2，宋 佳，楊會成，張 賓,2,*

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316022；2.浙江海洋大學比薩海洋研究生學院，浙江 舟山 316022；3.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316021）

帶魚（Trichiurus haumela）作為我國四大海洋經濟魚類之一，年捕獲量約為110萬 t，是我國重要的海洋漁業捕撈資源，同時也是我國為數不多的仍能維持漁汛的海產之一[1-3]。依據捕撈方式不同，我國東海海域的帶魚品類主要為釣帶魚、雷達網帶魚和外洋帶魚，均屬于日本帶魚屬（T.japonicus）。其中釣帶魚是使用專用魚鉤捕獲、生活在離岸邊較近、較淺水域的帶魚。雷達網帶魚是利用雷達網捕獲、生活在50～100 m水深的帶魚。而與上述2 種在舟山內洋海域捕撈的帶魚不同，外洋帶魚在北海海域捕撈，其捕撈方式與雷達網帶魚相似。

帶魚營養價值高，富含蛋白質、維生素及多種礦物質[4-5]，且具有肉質細膩、魚身無細刺、腥味小和味道鮮美等特點，深受廣大消費者喜愛[6]。有報道顯示，帶魚中富含對苯二甲酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等多不飽和脂肪酸，且相較牛肉、豬肉和雞肉等畜禽肉，更易被人體吸收，對人體代謝和生長發育起重要作用[7-8]。不僅如此，帶魚中含有豐富的鎂元素，鎂具有保護心血管系統、預防高血壓和心肌梗塞等心血管疾病的作用，經常食用帶魚對人體健康十分有益[9]。因此，為更好地發揮帶魚的營養價值、提高帶魚附加值，科研工作者對帶魚制品的研發愈加重視。

熱處理是魚類及其制品最常用的加工方式之一，可以賦予產品不同的口感和風味。常見的熱加工方式有水煮法[10]、微波法[11]、熱水燙漂法[12]及蒸汽法等。熱處理過程中，魚肉易出現質構、風味劣變，以及脂質和蛋白質氧化、變性等問題[13]。在加熱作用下，肌肉組織內部結構發生變化，如肌細胞間隙增大、內裂紋增多。此外，有研究發現，加熱對肉的嫩度有雙重作用，加熱時間過長或加熱溫度過高可能導致肌肉組織變硬，肌肉蛋白發生變性而凝固，繼而影響產品感官和新型魚類蛋白制品的開發[14]。由此可見，合適的熱處理方式對魚類及其制品的品質有重要影響[15]。當前，關于熱加工對水產品品質影響的相關研究，以及對單一種類帶魚的蛋白質功能特性的變化研究相對較多，而對多種帶魚之間肌肉品質特性的比較研究仍鮮有報道。

基于此，本研究以釣帶魚、外洋帶魚和雷達網帶魚為研究對象，旨在分析不同水浴溫度處理對3 種帶魚肌球蛋白功能特性和組織微觀結構的影響，為帶魚熱加工提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釣帶魚、雷達網帶魚和外洋帶魚（身寬6～10 cm、身長1 m左右）購自舟山國際水產城。將冰鮮帶魚置于裝有碎冰塊的保溫箱內，并于0.5 h內運回實驗室，備用。

三羥基甲基氨基甲烷、碳酸氫鉀 阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、二甲苯、體積分數70%乙醇、溴酚藍、尿素、馬來酸、β-巰基乙醇、甲醛等 國藥集團化學試劑有限公司；以上所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2600 A 型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；BS124S型電子天平 德國賽多利斯公司；H1850R型冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；CF16RN型高速冷凍離心機 日本日立公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速勻漿機 德國IKA公司；HH-W420型電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組

樣品處理：將釣帶魚、外洋帶魚和雷達網帶魚（K值為3.4%～4.6%）去除頭部和內臟后，切成5～6 cm長的塊狀，用封口袋進行包裝，每袋3 塊樣品。將樣品分別在30、50、70、90 ℃水浴中加熱10 min，待冷卻至室溫后，取相同部位的3 種帶魚樣品進行后續指標測定。

1.3.2 帶魚肌肉蒸煮損失率測定

取相同質量的帶魚肌肉組織（m0/g）進行密封，水浴加熱后，冷卻至室溫，將多余水分去除，對加熱后的肌肉進行稱量（m1/g），按式（1）對肌肉蒸煮損失率進行計算。

1.3.3 帶魚肌肉持水力測定

稱取經過加熱冷卻的帶魚肌肉5.0 g，放入底部置有棉花的離心管中，稱質量（m2/g）。3 000×g離心5 min后，將肌肉取出，對離心管再次稱質量（m3/g），按式（2）對肌肉持水力進行計算。

1.3.4 肌球蛋白提取制備

參照Gao Ruichang等[16]方法，并稍作修改。肌肉樣本溶解于4 倍體積0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）中，5 000×g條件下離心13 min，獲取上清液，即為提取的肌球蛋白溶液。采用雙縮脲法測定肌球蛋白質量濃度（g/L），然后將提取的肌球蛋白溶液稀釋為1 mg/L，置于4 ℃冰箱，3 d內測定后續指標。

1.3.5 肌球蛋白溶解度測定

將1.3.4節提取的肌球蛋白溶液在4 ℃、5 000×g條件下離心15 min，取上清液，用雙縮脲法分別測定離心前肌球蛋白溶液中蛋白質量濃度和離心后獲取的上清液中蛋白質量濃度（g/L）。按式（3）計算肌球蛋白的溶解度[17]。

1.3.6 肌球蛋白濁度測定

參照Jia Dan等[18]方法，并稍作修改。取5 mL上述提取的肌球蛋白溶液（4 ℃），在340 nm波長處測定其吸光度，測定值即為肌球蛋白溶液濁度。

1.3.7 肌球蛋白乳化能力測定

參照肖琨[19]、嚴紅波[17]等方法。取上述提取所得肌球蛋白溶液8 mL置于離心管中，加入2 mL大豆油，10 000 r/min離心1 min后，在距離心管底0.5 cm處吸取50 μL混合液。將混合液與5 mL 0.1 g/100 mL十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液混勻，于500 nm波長處測定吸光度（A0）。離心管靜置10 min后，再次在相同位置取50 μL混合液，添加到5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液中，混勻后測定其吸光度（A10）。其中，用0.1 g/100 mL SDS溶液作為空白對照。分別按式（4）、（5）計算乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）及乳化穩定性指數（emulsion stability index，ESI）。

式中：2.303為換算系數；ρ為乳液形成前水溶液中水解物蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為乳液油相體積分數（0.25）；L為光路長度/cm。

1.3.8 肌球蛋白起泡性（foaming capacity，FC）及泡沫穩定性（foaming stability，FS）測定

參照Foh等[20]方法。取上述提取所得肌球蛋白溶液40 mL（V），10 000 r/min均質1 min，將泡沫轉移至量筒中，測量泡沫和溶液總體積（V0/mL）。靜置10 min后，測量泡沫和溶液總體積（V10/mL）。分別按式（6）、（7）計算FC及FS。

1.3.9 肌球蛋白羰基含量測定

參照Jiang Wenxin等[21]方法并稍作修改。取上述提取的肌球蛋白溶液5 mL，加入5 mL含2 mol/L HCl溶液的10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液，室溫避光反應，每隔15 min搖勻1 次。1 h后，加入5 mL 20 g/100 mL三氯乙酸溶液，10 000×g離心5 min，取沉淀。在沉淀中加入5 mL乙酸乙酯-乙醇（V/V=1∶1）和10 mL 6 mol/L溶液鹽酸胍溶液，37 ℃水浴15 min，10 000×g離心3 min后，在370 nm波長處測定吸光度，即為肌球蛋白碳基含量。

1.3.10 帶魚肌肉組織結構觀察

參照馬紀兵等[22]方法。將3 種帶魚樣品置于10%（V/V）甲醛溶液浸泡48 h，再將其切割成1 cm×0.3 cm×0.3 cm的組織塊，并用水沖洗，體積分數70%乙醇溶液脫水過夜，二甲苯透明20 min后組織包埋，最后將獲得的包埋組織切成5 μm厚的切片，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，并用顯微鏡觀察帶魚肌肉組織結構。

1.4 數據處理

利用Origin 2022、SPSS 20軟件進行作圖及數據分析，結果表示為平均值±標準差（n＝3），并采用SNK法分析差異顯著性水平，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 熱加工對帶魚肌肉蒸煮損失率和持水力的影響

蒸煮損失率是反映魚類肌肉汁液流失、蛋白質變性和纖維蛋白收縮情況的重要參考指標[23]。由圖1A可知，隨著加熱溫度上升，3 種帶魚的蒸煮損失率均呈上升趨勢。其中，加熱溫度處于30～70 ℃時，外洋帶魚和雷達網帶魚的蒸煮損失率變化緩慢，而當加熱溫度由70 ℃升至90 ℃時，這2 種帶魚蒸煮損失率變化幅度加大，分別由4.65%和8.81%增至12.23%和14.63%。釣帶魚的蒸煮損失率在溫度低于50 ℃時變化不大；在50～90 ℃時，其蒸煮損失率上升速率顯著高于外洋帶魚和雷達網帶魚（P＜0.05），由8.48%增至25.54%。其原因可能是高溫使肌肉組織中蛋白質變性程度加大，生成小分子肽。這些小分子肽隨著水分、脂肪以及溶解的蛋白質等成分流失，使蒸煮損失率增加，進而導致水產品營養和質量降低，風味劣變[24-25]。同時，在加熱過程中，帶魚肌肉收縮，導致小分子肽溶出，這也是導致帶魚蒸煮損失率增加的重要原因[26]。此外，釣帶魚的蒸煮損失率及其變化幅度大于其他2 種帶魚，而雷達網帶魚蒸煮損失率變化幅度最小。說明雷達網帶魚在加熱時，其水分保持能力強于其他2 種帶魚，而釣帶魚則相反。

圖1 不同加熱溫度下3 種帶魚肌肉蒸煮損失率（A）和持水力（B）的變化Fig.1 Changes in cooking loss (A) and WHC (B) of muscle tissues of three kinds of hairtail under different heating temperatures

持水力是評價魚肉品質特性優劣的重要指標，對魚肉嫩度、風味和加工特性具有極其重要的作用[27-28]。由圖1B可知，隨著加熱溫度升高，3 種帶魚肌肉持水力均呈下降趨勢，其原因可能是加熱導致帶魚肌肉中蛋白質變性，使排列緊密的肌原纖維空隙變大，造成帶魚肌肉持水力下降[29]。其中釣帶魚肌肉持水力下降幅度最大，其次是外洋帶魚，而雷達網帶魚下降幅度最小。當加熱溫度升至90 ℃時，3 種帶魚持水力無顯著差異。不同帶魚蒸煮損失率和持水力的變化幅度可能與帶魚肌肉的肌纖維排列有關，釣帶魚和外洋帶魚肌纖維排列紊亂、疏松，導致肌原纖維結構疏水區域易暴露、肌肉細胞水分易流失；而雷達網帶魚肌纖維排列相對緊密、組織結構穩定性較高，能較好地保持肌肉細胞水分[30]，因此雷達網帶魚的肌肉品質特性較好。

2.2 熱加工對帶魚肌球蛋白溶解度的影響

肌球蛋白溶解性是衡量肌肉品質是否發生劣變的重要指標[31]。由圖2可知，隨著加熱溫度升高，3 種帶魚肌球蛋白溶解度降低。加熱溫度為30 ℃時，外洋帶魚、釣帶魚和雷達網帶魚肌球蛋白溶解度分別為41.2%、51.2%和33.3%，差異顯著（P＜0.05）。當加熱溫度升至90 ℃時，外洋帶魚、釣帶魚和雷達網帶魚肌球蛋白的溶解度分別下降13.70%、31.66%和15.90%，原因可能是帶魚肌肉在加熱過程中活性巰基暴露，并被氧化生成二硫鍵，同時還有一部分蛋白質變性，使結構解旋、肌球蛋白重鏈發生聚合，繼而導致其溶解度下降[32]。其中，釣帶魚肌球蛋白溶解度下降幅度明顯高于其他2 種帶魚，推測其原因是釣帶魚肌肉肌纖維排列疏松，使肌球蛋白裸露在外。裸露的肌球蛋白在加熱過程中更易受熱變性，造成更多疏水基團暴露，從而導致其溶解度下降幅度更大。

圖2 不同加熱溫度下3 種帶魚肌球蛋白溶解度的變化Fig.2 Changes in myosin solubility in muscle tissues of three kinds of hairtail under different heating temperatures

2.3 熱加工對帶魚肌球蛋白濁度的影響

濁度可反映蛋白質溶液中懸浮顆粒粒徑和數量，用于表征蛋白質聚集程度[17]，并由此判斷帶魚肌肉品質變化情況。由圖3可知，隨著加熱溫度升高，3 種帶魚的肌球蛋白濁度不斷增大。當加熱溫度為30 ℃時，外洋帶魚、釣帶魚和雷達網帶魚肌球蛋白濁度分別為0.473、0.393和0.362，三者之間存在顯著差異（P＜0.05）。當加熱溫度升至90 ℃時，外洋帶魚、雷達網帶魚和釣帶魚肌球蛋白濁度分別增至0.512、0.507和0.559，原因可能是高溫導致肌球蛋白變性及其構象發生改變，繼而聚集形成不溶性沉淀，最終引起肌球蛋白濁度增加[33]。其中，在加熱溫度升高過程中，釣帶魚肌球蛋白濁度上升幅度最大，特別是當溫度達到90 ℃時，釣帶魚肌球蛋白濁度顯著高于其他2 種帶魚（P＜0.05）。推測其原因可能是釣帶魚肌原纖維排列松散、蛋白質暴露在外，在加熱后蛋白質更易因變性而相互聚集，使粒徑變大，導致濁度上升幅度增大[34]。

圖3 不同加熱溫度下3 種帶魚肌球蛋白濁度的變化Fig.3 Changes in turbidity of myosin from three kinds of hairtail under different heating temperatures

2.4 熱加工對帶魚肌球蛋白乳化能力的影響

乳化性是體現蛋白質對油脂乳化能力強弱的指標，主要包括蛋白質EAI和ESI，是蛋白質的重要功能特性[35]。由圖4可知，隨著加熱溫度升高，3 種帶魚肌球蛋白EAI和ESI均呈下降趨勢。當加熱溫度為30 ℃時，雷達網帶魚肌球蛋白EAI為2.51 m2/g，顯著高于其他2 種帶魚（P＜0.05）；此外，釣帶魚肌球蛋白ESI最高，達到85.09%，而外洋帶魚肌球蛋白EAI和ESI最低，分別為1.18 m2/g和71.34%。當加熱溫度升至90 ℃時，外洋帶魚、雷達網帶魚和釣帶魚肌球蛋白EAI分別下降至0.45，0.46、0.52 m2/g，同時ESI分別下降至27.41%、22.03%和18.83%。原因可能是高溫使肌球蛋白結構遭到破壞，造成肌球蛋白與脂肪結合能力減弱，最終導致3 種帶魚EAI及ESI降低。值得關注的是，隨著加熱溫度升高，釣帶魚和雷達網帶魚的肌球蛋白EAI及ESI下降幅度均比外洋帶魚大，這可能是在加熱過程中，釣帶魚和雷達網帶魚的疏水基團受到更大破壞，表面疏水性低于外洋帶魚，繼而造成蛋白質結構穩定性遭到破壞，蛋白質與脂肪顆粒的交聯能力減弱，使其不能形成穩定界面膜[34,36]，導致其EAI和ESI下降幅度增大。

圖4 不同加熱溫度下3 種帶魚肌球蛋白EAI（A）和ESI（B）的變化Fig.4 Changes in emulsifying activity index (A) and emulsion stability index (B)of myosin from three kinds of hairtail under different heating temperatures

2.5 熱加工對帶魚肌球蛋白FC和FS的影響

FC和FS指在特定條件下蛋白質與氣體形成泡沫和保持泡沫穩定的能力，是蛋白質的重要功能特性，在食品加工中有重要作用[17,37]。由圖5可知，3 種帶魚肌球蛋白FC和FS均隨加熱溫度升高而降低，且二者變化趨勢基本保持一致。加熱溫度為30 ℃時，3 種帶魚肌球蛋白FC存在顯著差異（P＜0.05），但外洋帶魚和雷達網帶魚的FS無顯著差異（P＞0.05）。加熱溫度升至90 ℃時，外洋帶魚、釣帶魚和雷達網帶魚肌球蛋白FC分別降低至80.00%，85.23%和88.23%，FS分別下降至85.22%、88.00%和89.41%。其原因可能是隨著加熱溫度升高，帶魚肌肉中肌球蛋白含量減少且變性程度加劇、空間結構發生變化，導致蛋白質分子之間的化學作用力以及氨基與羧基之間形成氫鍵的能力變弱，分子間的界面特性與擴散速率受到影響，繼而導致蛋白質泡沫形成能力和穩定性減弱[38-39]。其中，外洋帶魚肌球蛋白初始FC為86.7%，顯著低于其他2 種帶魚（P＜0.05），且在70～90 ℃，外洋帶魚肌球蛋白FC和FS亦顯著低于其他2 種帶魚（P＜0.05）。推測其原因可能是外洋帶魚組織排列疏松，在高溫下蛋白質中的氫鍵等化學鍵遭到大量破壞，其相對含量大幅降低，蛋白質分子間化學鍵形成能力減弱，故其FC和FS低于其他2 種帶魚。

圖5 不同加熱溫度下3 種帶魚肌球蛋白FC（A）和FS（B）的變化Fig.5 Changes in foaming capacity (A) and foam stability (B) of myosin from three kinds of hairtail under different heating temperatures

2.6 熱加工對帶魚肌球蛋白羰基含量的影響

肌肉羰基含量可用于判斷蛋白質在自由基作用下的氧化程度[40]。由圖6可知，當加熱溫度由30 ℃升至90 ℃，3 種帶魚肌球蛋白羰基含量分別增加0.95、1.04、1.2 nmol/mg。可能是因為高溫催化帶魚肌球蛋白氧化反應加劇，促使羰基基團生成，繼而導致肌球蛋白羰基含量上升[41]。其中，當溫度為30、50、90 ℃時，雷達網帶魚肌球蛋白羰基含量顯著低于其他2 種帶魚（P＜0.05），這可能是由于雷達網帶魚促氧化成分（如自由基）含量較低[37,42]，因此在加熱過程中，雷達網帶魚肌球蛋白氧化緩慢，其羰基含量雖有所增加但始終最低。

圖6 不同加熱溫度下3 種帶魚肌球蛋白羰基含量的變化Fig.6 Changes in myosin carbonyl content of three kinds of hairtail under different heating temperatures

2.7 熱加工對帶魚肌肉微觀結構的影響

HE染色石蠟切片中呈紅色的是細胞質和細胞外基質[43]。由圖7可知，3 種帶魚肌纖維被染成粉紅色，肌內膜將其分成參差不齊的塊狀，肌漿把肌纖維細胞的肌原纖維分成不同的肌纖維束。當溫度為50 ℃時，雷達網帶魚肌纖維是規則的塊狀，肌纖維之間緊密且間隙較小，粉紅色的肌原纖維分布均勻，在肌纖維內分布緊密，該結構能防止肌肉組織汁液流失，維持帶魚肌肉嫩度。然而，釣帶魚和外洋帶魚魚肉肌纖維排列較為紊亂、疏松。其中，外洋帶魚魚肉肌纖維斷裂現象嚴重。這可能與3 種帶魚的不同生存環境和捕撈方式有關。雷達網帶魚生活在水深50～100 m處，通過雷達網捕獲，其組織結構更加致密，而釣帶魚和外洋帶魚的組織結構相對疏松。當溫度繼續升高至90 ℃時，3 種帶魚肌纖維束均出現不同程度的溶解斷裂現象，并且肌纖維間隙越來越大。由此說明加熱溫度越高，帶魚微觀結構的完整性被破壞程度越大，但在相同加熱溫度下，雷達網帶魚的組織結構完整性最好。以上結果與2.1節蒸煮損失率和持水力測定結果相一致，即隨著加熱溫度的上升，3 種帶魚的肌纖維間隙不斷增大、排列逐漸疏松，同時蒸煮損失率隨之增大、持水力隨之減小。其中雷達網帶魚的肌纖維相對緊密，持水力和蒸煮損失率變化幅度最小。

圖7 不同加熱溫度下3 種帶魚肌肉組織HE染色圖Fig.7 HE staining of muscle tissues in three kinds of hairtail under different heating temperatures

3 結論

研究熱加工對釣帶魚、外洋帶魚和雷達網帶魚肌球蛋白和組織微觀結構的影響。結果表明：隨著加熱溫度升高，帶魚肌肉蒸煮損失率增加、持水力降低，說明熱加工會導致3 種帶魚的水分和營養物質流失，肌肉品質下降；同時，3 種帶魚肌球蛋白的濁度和羰基含量增加，溶解度、EAI、ESI、FC及FS降低，說明溫度上升會使帶魚肌球蛋白變性程度增加、功能特性下降；觀察肌肉組織微觀結構發現，隨著加熱溫度升高，3 種帶魚肌肉組織中肌纖維和肌纖維束間隙也隨之增大，且出現不同程度斷裂，表明升溫會導致帶魚肌肉組織被破壞、結構完整性下降；然而，在3 種帶魚中，雷達網帶魚的持水力、溶解性下降幅度，濁度上升幅度均比釣帶魚和外洋帶魚小，且其肌肉組織微觀結構的完整性最好，表明在熱加工下，雷達網帶魚肌球蛋白功能特性和肌肉品質最佳。綜上可知，隨著加熱溫度升高，3 種帶魚的肌球蛋白功能特性均不斷降低，帶魚組織微觀結構完整性下降，其中雷達網帶魚肌肉蛋白質的品質穩定性和組織結構完整性最好。