蒙醫三種基本體質人群腸道菌群結構差異研究

阿如熱，蘇如那，于紅珍，白 麗，付明海

（1.國家藥監局中藥（蒙藥）質量控制重點實驗室，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古 通遼 028043；3.海南醫學院藥學院，海南 海口 571199；4.中央民族大學藥學院，北京 100081）

蒙醫學是一門古老而具有豐富理論體系和實踐經驗的優秀傳統醫學，也是蒙古民族長期在醫療實踐中與疾病斗爭的經驗總結。體質是由先天遺傳和后天獲得所形成的，是指在先天稟賦和后天獲得的基礎上所形成的生理功能和心理狀態。人的體態、相貌、胖瘦、胃火、消化功能、智慧、舉止、性格等各有差異，因此各有特性［1-3］。體質特性取決于父母先天特性、環境影響以及體內赫依、希拉、巴達干所含的比例。蒙醫理論認為，將人體體質分為赫依型、希拉型、巴達干型、赫依希拉混合型、赫依巴達干混合型、希拉巴達干混合型、聚合型（赫依、希拉、巴達干三根聚合）等七種類型，其中尤以聚合型體質最佳。體質特性與父母的體質特性遺傳密切相關，并且與胚胎發育過程中母親的飲食生活條件有著緊密聯系［4-5］，即以赫依、希拉、巴達干三者的哪個為主，其秉性特征表現就可突出體現于人體上，例如，赫依型體質特性者主要表現為體態瘦小、膚色青灰、胃火不平、多言、行動輕盈，嗜好甘、酸、咸、辛味和熱性飲食；希拉型體質特性者表現為體態中等、膚色及毛發微黃、胃火銳、耐寒、消化功能強、反應敏銳、多汗等，嗜好甘、苦、澀味及涼性飲食；巴達干型體質特性者表現為體態高大、身體肥胖、胃火鈍、耐熱、嗜睡、行動緩慢、性情溫柔等，嗜好辛、酸、咸味和糙性飲食；赫依希拉混合型、赫依巴達干混合型及希拉巴達干混合型體質特性者可體現兩種體質的秉性特征；聚合型體質特性者可體現三根均衡的秉性特征［1，6］。

前期研究發現，蒙醫三種基本體質對健康人群血常規和血液流變個別指標影響較大，且不同體質人群中胃動素和胃泌素水平存在較大差異［7］，使赫依、希拉、巴達干三種基本體質人員在形態結構、性格特點及生理機能等方面都表現出顯著個體差異，成為辨別體質類型的重要指標。筆者通過對蒙醫三種體質人群的尿常規、身體質量指數（BMI）、腸道菌群結構差異等的分析，進一步為蒙醫體質科學判定及蒙醫臨床個體化用藥提供科學依據；探討腸道菌群與蒙醫體質的相關性，為蒙醫體質現代研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取內蒙古民族大學蒙醫藥學院2018—2021屆18～25歲蒙古族本科生志愿者進行體質判定。納入標準：神智正常、無病史、行為配合、自愿受試并在研究開始前均簽署知情同意書的受試者；排除標準：去掉混合體質者，年齡小于18歲或者是大于25歲的受試者，填寫問卷項目不完整、有疾病的受試者（如：有遺傳病、先天性疾病、傳染病、肥胖者等），未在知情同意書上簽字的受試者，女生處于經期者。本研究內容已通過《內蒙古民族大學附屬醫院醫學倫理委員會》倫理審查評議，倫理批件號為：NM-LL-2021-06-15-1。

1.2 體質判定

1.2.1 判定方法

根據《額氏蒙醫體質分類與判定評分表》，圍繞蒙醫學基礎理論［3］對于赫依、希拉、巴達干三種基本體質特征描述分別設問卷內容。給每一位自愿受試者發放問卷表，填寫問卷內容及姓名、性別、年齡、民族、健康狀況或病史、聯系方式等基本信息，對填寫表格的學生誠信度做判斷。學生完成問卷打分后，初步篩選出赫依、希拉、巴達干及聚合型體質志愿者。最后，由蒙醫臨床專家結合打分結果經“望”“問”“觸”三診方法最終確定受試者。

1.2.2 判定標準

依據《額氏蒙醫體質分類與判定評分表》對受試者進行體質判定。判定評分表中，赫依、希拉、巴達干偏盛體質者各有18個選項，總共有54個選項（表1）。54個選項中每人必選18個選項，每項記1分，3組分別計算總得分以及百分比。每2個體質者相差小于33.33%的看作為聚合型體質者，最高值和其余2型的相差均高于33.33%的視為單一體質者，余視為混合型體質者。

表1 額氏蒙醫體質特性判定表Tab.1 Evaluation table of E’s Mongolian medicine physical constitution characteristics

1.3 樣本的測定

1.3.1 尿樣采集

受試者采集樣本前1天不吃高脂類食品，不飲酒，不過度勞累，采集前空腹，不解小便，女生在經期不做尿常規。采用一次性專用塑料尿杯接中段尿液30～50 mL，迅速送往通遼市科爾沁區健安醫院體檢中心，使用自動尿液分析儀BT-200進行尿常規檢測分析。

1.3.2 糞便樣品采集

受試者在采樣前1個月禁止服用胃腸動力類藥品、各類抗生素和微生態調節劑等引起腸道內微生態環境改變的藥品或食品。受試者于門診采集新鮮自然排出的糞便約3 g，裝入10 mL 大便采集管中，置于-80 ℃儲存、備用。

1.3.3 實驗儀器

電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司），冷凍離心機（Multifuge X1R.Thermo Scientific），NovaSeq 6000測序儀（USA ILLumina），Qubit2.0 DNA 蛋白定量儀（賽默飛世爾科技有限公司），Agilent 5400 全自動毛細管電泳儀。

1.3.4 16S rRNA測序

采用試劑盒提取樣本中DNA后，在1∶100瓊脂糖凝膠上檢測DNA含量和純度。根據濃度，用無菌敷料水稀釋DNA。使用特異性條形碼引物（341F-806R 為F：CCTAYGGGRBGCASCAG，R：GGACTACNNGGGTATCTAAT）擴增16S V3+V4區。

PCR反應使用0.2 μL正向和反向引物以及約10 ng的模板DNA高保真PCR預混液（New England Biolabs）。循環過程包括在98 ℃初始變性1 min，然后再在98 ℃變性30 s，在50 ℃退火30 s以及在72 ℃延伸30 s的30個循環。將等容積的緩沖液（包含SYB綠色染料）和PCR產物以等比例混勻，并在2∶100瓊脂糖的凝膠材料上通過電泳以完成測定。然后，用德國Qiagen凝膠材料提取檢測試劑盒（德國Qiagen）純化混合物的PCR產品，再使用美國Illumina公司的TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫檢測試劑盒完成文庫的建設，對建好的文庫實行Qubit定量和文庫測試，合格后使用NovaSeq 6000上機測試。

對檢測后所得的原始數據（Raw Data）進行拼接、篩選，獲得修飾統計數據（Clean Data）。再進行OTUs（Operational taxonomic units）聚集和生物類型解析，依據OTUs聚集結果，對各個OTU的代表順序做生物標注，得出相應的種類統計信息和基于種類的豐度分布。同時，對OTUs 采用豐度、Alpha 多樣性統計、Venn圖等分析，以獲得樣本內生物富集度和均勻度統計信息。分別在各個類別水平（以門、屬為主）上，統計各樣本的信息種群組成。依據OTU及其聚類的分析結果和分類學相關信息，在各水平上開展對菌群構成的統計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）及群落組成分析等。

1.4 統計分析

使用GraphPad Prism 8.0.2進行數據統計分析。各分析指標數據以平均值±標準差（xˉ±s）表示。方差分析方法用于多組間比較，P＜0.05視為具有統計學意義。

2 結果

2.1 三種基本體質人群生理指標分析

本研究共調查了283人，平均年齡為21歲，發放問卷回收率為100%，其中，赫依體質者24人（8%），希拉體質者57人（20%），巴達干體質者13人（5%），聚合型體質者42人（15%），剩余147人（52%）為混合型體質者。從各體質人群中隨機抽取12人分配到各個不同體質組中，男女各半。

各受試者其尿液pH均在5.5～7.5正常范圍內，組間無顯著差異。尿蛋白（PRO）、尿糖（GLU）、膽紅素（BI）、維生素C及尿酮（KET）均為陰性。赫依組、希拉組、巴達干組、聚合型組等各組間比較無顯著性差異（表2）。

表2 各組BMI及尿常規指標比較Tab.2 Comparison of BMI and urine routine indexes in each group

根據各體質受試者身高（m）與體質量（kg），按BMI=體質量（kg）/身高2（m2）公式計算其BMI。表2結果顯示，巴達干組與希拉組和聚合型組比較，BMI值顯著增高（P＜0.05）；赫依組BMI值顯著高于希拉組（P＜0.05）。

2.2 腸道菌群物種進化樹分析

通過多序列比對獲得top100屬的代表順序，繪制進化樹，發現腸道內細菌的進化途徑分支主要集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、梭桿菌門（Fusobacteriota）等8種菌門，其中厚壁菌門（Firmicutes）物種相對豐度最高，其次是擬桿菌門（Bacteroidota）和變形菌門（Proteobacteria）（圖1）。

圖1 各體質組腸道菌群物種系統發育圖Fig.1 Gut microflora phylogenetic map of different physical constitution groups

2.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映個體菌群的生物多樣性。腸道菌群生物多樣性主要以ACE、Chao1、Observed-species、PD-whole-tree、Simpson和Shannon指數等來反映。如圖2所示，Observed-species、ACE和Chao1指數在赫依、希拉、巴達干三種單型體質組顯著高于聚合型組（P＜0.05）。PD-whole-tree指數中，赫依和希拉組顯著高于聚合型組（P＜0.05）。Shannon 和Simpson 指數在4組間比較無顯著差異。以上結果提示，赫依組、希拉組、巴達干組與聚合型組相比，腸道菌群群落豐度發生了顯著變化。

圖2 Alpha多樣性指數圖Fig.2 Index charts of Alpha diversity

2.4 OTU數及Beta多樣性分析

腸道菌群分析結果共獲得2 583 203 條原始reads，平均長度為414 bp。經質控過濾后，平均每個樣本得到80 045個有效數據。經聚類分析，共鑒定出2 536個OTU，獲得了40門、286科、465屬的微生物群落信息。維恩圖顯示，在2 536個OTU的總豐度中，4組重疊共有OTU 386個。赫依、希拉、巴達干3組與聚合型組之間單獨重疊OTU 數依次為178、133、18（圖3A）。該結果說明，三種基本體質組與聚合型組OTU相似度依次為赫依組＞希拉組＞巴達干組。

圖3 OTU（A）及Beta多樣性（B～D）分析圖Fig.3 Analysis charts of OTU（A）and Beta diversity（B-D）

Beta多樣性反映生物復雜性的差別程度，利用該指數得到的分析圖中距離越大表示樣本間的差異越大。PCoA分析技術用于研究樣品群體構成的相似之處或不同，每個點代表一個樣品，點和點之間的相距越大表示樣品間菌群構成差異性越大。4組PCoA分布出現明顯分離（圖3B），其中，聚合型組與其他3組相比分離度最大，說明其菌群構成與三種基本體質組差異較大。此外，隨著樣品測序量的增加，稀薄曲線達到平臺，趨于飽和，物種數量不再線性或快速增加，表明測序數據量合理（圖3C）。4組斜率的秩豐度呈現一致的趨勢，說明測序深度足以反映群落的微生物多樣性（圖3D）。

2.5 各組菌落結構分析

各組受試者10種門水平腸道菌落中，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度最高，約占75%；而在屬水平腸道菌落中，糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）4種菌屬占比最高，約占50%（圖4）。

圖4 門和屬水平群落分析圖Fig.4 Analysis charts of gut microflora at phylum and genus level

不同體質組間特征菌落存在顯著差異（圖5）。在門水平上，赫依組擬桿菌門（Bacteroidota）顯著高于聚合型組（P＜0.05），而變形菌門（Proteobacteria）在巴達干組顯著高于赫依組（P＜0.05）。在屬水平上，赫依組與巴達干組相比，巨單胞菌屬（Megamonas）和埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）在2 組間存在顯著差異（P＜0.05）；希拉組與巴達干組相比，普氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides）在2組間具有顯著差異（P＜0.05）；擬桿菌屬（Bacteroides）在希拉組中表達顯著高于聚合型組（P＜0.01）；糞桿菌屬（Faecalibacterium）在巴達干組表達顯著低于聚合型組（P＜0.05）。

圖5 各組間特征菌落差異Fig.5 Differences of characteristic microflora among groups

2.6 功能預測

在Level2水平上，赫依組、希拉組、巴達干組和聚合型組等4組中豐度排序靠前的特征功能信息包括藥物抵抗（Drug resistance）、脂肪代謝（Lipid metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、免疫系統（Immune system）等，說明不同體質人群在營養代謝、藥物耐受和免疫功能方面存在較大差異（圖6）。

圖6 各組間特征Tax4Fun功能預測Fig.6 Tax4Fun functional prediction among different groups

3 討論

體質是人體生理和心理與生俱來的特性［8］。蒙醫理論將人的體質分為七種，其中，赫依、希拉、巴達干為主的單一體質稱為三種基本體質。赫依體質人群嗜甘、酸、咸、辛食物之品，根據胃火不均特點，宜食易消化飲食；希拉體質人群嗜甘、苦、澀食物之品，根據胃火旺盛特點，應少服用具有土源、重效的飲食；巴達干體質人群嗜辛、酸、咸食物之品，根據腹堅特點，宜食溫熱性輕的易消化食物［9-10］。因此，筆者選擇蒙古族年輕人群（18～25歲）為受試者，結合《額氏蒙醫體質分類與判定評分表》和蒙醫三診方法判定受試者基本體質，對其腸道菌群結構差異進行了分析，為蒙醫基本體質判定和臨床個體化用藥提供科學依據。

腸道菌群被稱為調控人體的“第二基因組”，在人類預防和治療疾病中的作用逐漸被重視［11］。本研究中Alpha 多樣性和Beta多樣性分析結果表明，三種基本體質及聚合型體質人群之間菌群結構存在顯著差異，其中，赫依組擬桿菌門（Bacteroidota）顯著高于聚合型組，其與代謝性疾病呈負相關，它也是腸道菌群中的主要菌群，有促進腸道黏膜血管的形成、維持腸道生態平衡的作用［12］。從擬桿菌門的變化來看，各體質組相對豐度按高低排序依次為赫依組＞希拉組＞巴達干組＞聚合型組。可見各體質組因個體差異所導致擬桿菌門的豐度不同。Alpha多樣性指數結果顯示，巴達干組的豐度和多樣性降低，與以往文獻報道的長期高脂飲食能降低腸道菌群物種的豐富性以及多樣性相一致［13-14］。變形菌（Proteobacteria）外膜有脂多糖，使人體內脂肪沉積增加，致使人肥胖［15］。因此，巴達干體質人群體重和BMI值顯著高于其余組，可能與變形菌表達較高相關。同樣，巨單胞菌屬（Megamonas）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、普氏菌屬（Prevotella）與碳水、氨基酸以及脂肪代謝密切相關，并與體重和BMI呈正相關［16-18］。糞桿菌屬（Faecalibacterium）是有益菌，與免疫功能密切相關，對人體健康起到重要作用［19］。此外，功能預測結果提示，不同體質人群腸道菌群結構的差異化導致了對藥物的耐受和抵抗機制不同［20］，進一步表明對不同體質患者實施個體化用藥的重要性和科學性。

4 結論

筆者從蒙醫學角度對三種基本體質人群腸道菌群進行了分析，發現不同體質人群腸道菌群結構存在顯著差異，且與調節多種營養物質代謝、免疫功能和藥物耐受等重要生理功能密切相關。該發現為蒙醫體質科學判定和臨床個體化用藥提供科學依據。