夏季不同播期對苜蓿抗寒性及越冬的影響研究

劉 罡，張慶昕，張玉霞，朱愛民，陳衛東，田永雷

（1.內蒙古民族大學草業學院，內蒙古 通遼 028043；2.內蒙古農業大學草原與資源環境學院，內蒙古 呼和浩特 010010；3.內蒙古農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031）

苜蓿（Medicago sativaL.）在世界各國均有種植，種植面積因地而異［1］，因其具有良好的適應能力，寒冷地區和濕熱地區均有栽培，其秋眠級越低則越耐寒，反之則抗寒性較弱。自20世紀50年代起至今，國內外學者對苜蓿抗寒性的研究較多［2-5］，目的是探究苜蓿抗寒生理及生化機制，篩選苜蓿抗寒基因，培育高產抗寒的苜蓿品種。苜蓿越冬期根頸會經歷由多種脅迫共同引起的復雜過程，當脅迫達到一定程度，會使苜蓿發生凍害，嚴重會造成苜蓿死亡。相關研究表明，苜蓿根頸保護酶活性會直接影響苜蓿抗寒能力［6-9］，其中，苜蓿根頸中的部分抗氧化酶能減輕低溫脅迫造成的活性氧分子對細胞的損害［10］。寇建村等［11］、朱愛民等［12］的研究顯示，在低溫鍛煉期苜蓿根頸中抗氧化酶活性增強。王絳輝等［13］指出，高海拔寒冷地區苜蓿根系中的抗氧化酶活性較強。苜蓿根頸中抗氧化酶活性與苜蓿抗寒性密切相關，且苜蓿根頸中可溶性蛋白含量在不同水平低溫處理下的表現也有所差異。KRASNUK等［14］對紫花苜蓿抗寒性的研究表明，在苜蓿根內可溶性蛋白含量升高過程中的一個關鍵影響因素是低溫脅迫程度的增加。WLDNGM等［15］認為，在提高植物抗寒性的過程中，可溶性蛋白含量的增加發揮了較大作用。在一定低溫條件下，苜蓿會為抵御低溫脅迫而進行自我調控，但在不同低溫脅迫下，苜蓿發生的生理、生化反應及苜蓿的抗冷閾值等，還有待進一步研究。

選擇適合的播種時期對于苜蓿的健康生長及安全越冬具有重要意義［16］。被譽為“中國草都”的內蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗，該地區春季風沙大、溫度低，不利于苜蓿的春季播種；夏季高溫，過早播種田間雜草多，過晚播種苜蓿生長較弱，不利于安全越冬。因此，通過對不同播種時期的苜蓿做低溫處理，測定根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量，以翌年苜蓿越冬率為指標，探討不同播期對苜蓿的抗寒性以及越冬能力的影響，為當地苜蓿安全越冬提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

試驗于內蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗牧草生產基地（42°30′50′′N，115°27′34′′E）進行。該地區年均降水量約375 mm，無霜期140～150 d，年均風速3.0～4.4 m/s，年均氣溫5.5 ℃，≥10 ℃的積溫為3 000～3 200 ℃；試驗地土壤主要營養成分見表1。

表1 試驗地土壤營養成分及pHTab.1 Soil nutrient and pH in the test site

1.2 試驗材料

供試苜蓿品種為公農1號（Gongnong No.1，由吉林省農業科學院草地研究所提供）、騎士T（Knight T，購自北京佰青源畜牧業科技發展有限責任公司）、擎天柱（Optimus prime，購自北京正道生態科技有限公司）。

1.3 試驗方法

試驗于2017 年進行，設4 個播期，分別為7 月1 日、7 月15 日、8 月1 日、8 月15 日，播種方式為條播。每個小區面積為3 m×4 m，隨機區組排列，4次重復，小區之間有0.5 m過道，共48個小區，不進行秋季刈割，土壤凍融期（2017年11月10日）直接對苜蓿根系取樣。所采樣品4 ℃低溫保存，待低溫處理。

低溫處理試驗：參考朱愛民等［5］采用的試驗方法，分別依照5、-5、-10、-15、-20、-25 ℃目標溫度對苜蓿進行低溫脅迫處理。以4 ℃/h的速率對低溫程控箱溫度進行調節，達到目標溫度后穩定保持6 h。完成低溫處理后以4 ℃/h的速率對試驗材料進行升溫，達到室溫后取出，并立即進行抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的測定。

1.4 測定項目及方法

可溶性蛋白含量、過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性均采用鄒琦［17］生理實驗指導方法測定。越冬率以存活株數占植株總數的百分比表示。

1.5 數據分析

使用Microsoft Excel 2020進行數據處理和圖表制作。采用SPSS 17.0軟件進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 播期和低溫處理對苜蓿根頸抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量的影響

品種、品種+播期、品種+播期+溫度處理對苜蓿根頸SOD活性、CAT活性、POD活性、可溶性蛋白含量影響均不顯著；播期對苜蓿根頸SOD活性和可溶性蛋白含量影響極顯著（P＜0.01）；SOD活性、CAT活性和POD活性對低溫的響應較敏感（表2）。可見播期和溫度處理與苜蓿的抗寒性密切相關。

表2 處理與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、可溶性蛋白之間的相關性分析Tab.2 Correlation analysis between treatment and superoxide dismutase，catalase，peroxidase，soluble protein

2.2 不同播期苜蓿越冬率比較

隨播種時期的推遲，供試3個苜蓿品種越冬率均逐漸降低。8月播種的苜蓿越冬率較7月1日播種均顯著降低（P＜0.05）。由于2017年至2018年冬季溫度較低，該地區苜蓿大面積受到凍害影響，7月1日播種的苜蓿越冬率均不足60.0%。見圖1。

圖1 苜蓿越冬率在不同播期下的變化Fig.1 Changes of overwintering rate of alfalfa in different sowing time

2.3 低溫脅迫對苜蓿根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響

2.3.1 低溫脅迫對苜蓿根頸中SOD活性的影響

隨處理溫度的降低，苜蓿根頸SOD活性呈先升高后降低再升高的變化趨勢，其中，苜蓿根頸SOD活性于-15 ℃脅迫下最低，為134.3 U/g；-5、-20 ℃脅迫下根頸SOD活性均顯著大于-15 ℃處理（P＜0.05）；-25 ℃脅迫下根頸SOD活性最高，為209.9 U/g，且顯著高于其他5個處理（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中SOD活性變化Fig.2 Changes of SOD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.3.2 低溫脅迫對苜蓿根頸中CAT活性的影響

隨處理溫度的降低，苜蓿根頸CAT活性呈逐漸降低趨勢，其中，5、-5 ℃條件下苜蓿根頸CAT活性較高，分別為46.7、42.4 U/（min·g），均顯著高于其他4個處理（P＜0.05）；-25 ℃條件下苜蓿根頸CAT活性最低，為6.9 U/（min·g），顯著低于其他處理（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中CAT活性變化Fig.3 Changes of CAT activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.3.3 低溫脅迫對苜蓿根頸中POD活性的影響

隨處理溫度的降低，苜蓿根頸中POD 活性呈現先降低后升高再降低的變化趨勢。5 ℃處理POD 活性為646.7 U/（min·g），顯著高于其他5個處理（P＜0.05）；在-5、-15 ℃處理下兩者間差異不顯著，分別為506.2、513.8 U/（min·g），顯著大于-20、-25 ℃處理（P＜0.05）；其他3個處理間苜蓿根頸POD活性差異不顯著。見圖4。

圖4 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中POD活性變化Fig.4 Changes of POD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.3.4 低溫脅迫對苜蓿根頸中可溶性蛋白含量的影響

隨處理溫度的降低，苜蓿根頸可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢，在-5、-20 ℃時，分別達到高峰，-20 ℃條件下顯著大于其他處理（P＜0.05）；在-10、-25 ℃條件下各自達到一次低峰，分別為16.3、17.0 mg/g，較-5 ℃處理顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中可溶性蛋白含量變化Fig.5 Changes of soluble protein content in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.4 不同播期處理對苜蓿根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響

2.4.1 不同播期處理對苜蓿根頸SOD活性的影響

苜蓿根頸SOD 活性對不同播期處理響應不同，其中，7 月播種的苜蓿根頸SOD 活性均偏高，分別為177.7、168.1 U/g，均顯著大于8 月播種的處理（P＜0.05）；8 月1 日和8 月15 日播期處理之間苜蓿根頸中SOD活性差異不顯著。見圖6。

圖6 苜蓿根頸SOD活性在不同播期下的變化Fig.6 Changes of alfalfa root collar SOD activity in different sowing time

2.4.2 不同播期處理對苜蓿根頸CAT活性的影響

苜蓿根頸CAT活性在7月15日播種處理中達到31.3 U/（min·g），在4個播期中最高，顯著高于8月1日播種處理（P＜0.05），與7月1日播種處理的29.86 U/（min·g）和8月15日播種處理的28.58 U/（min·g）差異不顯著；苜蓿根頸CAT活性在另外3個播種時期處理間均無顯著差異。見圖7。

圖7 苜蓿根頸CAT活性在不同播期下的變化Fig.7 Changes of alfalfa root collar CAT activity in different sowing time

2.4.3 不同播期處理對苜蓿根頸POD活性的影響

苜蓿根頸POD 活性在8 月15 日播期處理達到最高，為524.3 U/（min·g），顯著高于8 月1 日處理（P＜0.05），但與7 月1 日和7 月15 日播期處理間差異不顯著；7 月1 日、7 月15 日和8 月1 日播種的苜蓿根頸中POD 活性差異不顯著。見圖8。

圖8 苜蓿根頸POD活性在不同播期下的變化Fig.8 Changes of alfalfa root collar POD activity in different sowing time

2.4.4 不同播期處理對苜蓿根頸可溶性蛋白含量的影響

苜蓿根頸可溶性蛋白含量7月1日和7月15日播種處理分別為30.74 mg/g和28.64 mg/g，顯著高于8月份播種的2個處理（P＜0.05）；而7月1日與7月15日播種處理之間、8月1日與8月15日播種處理之間苜蓿根頸可溶性蛋白含量差異均不顯著。見圖9。

圖9 苜蓿根頸可溶性蛋白含量在不同播期下的變化Fig.9 Changes of alfalfa root collar soluble protein content in different sowing time

2.5 苜蓿根頸生理生化指標與越冬率的相關性分析

苜蓿越冬率受其根頸中SOD活性影響的同時，也受到可溶性蛋白含量的影響，數據表明越冬率與二者均顯著正相關（P＜0.05）；但苜蓿越冬率與苜蓿根頸中POD和CAT活性未表現出顯著相關性（表3）。

表3 苜蓿越冬率與根頸抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量的相關性分析Tab.3 Correlation analysis of alfalfa overwintering rate with antioxidant enzyme activity and soluble protein content in root collar

3 討論

3.1 苜蓿根頸抗氧化酶活性對播期和低溫脅迫的響應

田永雷等［18］研究表明，播種時期對紫花苜蓿根頸中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性影響明顯，播種較晚的苜蓿根頸中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性較低，與本研究結果相同。本研究結果表明，播期對苜蓿根頸SOD活性影響顯著，而對苜蓿根頸CAT和POD活性影響不明顯。根系中的保護酶活性直接影響紫花苜蓿抗寒能力的大小，對于苜蓿抗寒力的提高有特殊意義［12］。但也有不同結論，馬周文等［19］研究低溫脅迫對紫花苜蓿生理指標的影響結果表明，不同低溫處理下苜蓿體內SOD、CAT 活性的變化差異較小。而本研究結果顯示，苜蓿根頸CAT活性隨處理溫度的降低而降低，說明苜蓿根頸CAT活性對低溫響應明顯。羅新義等［20］、鄧雪柯等［21］研究表明，低溫脅迫下苜蓿根頸中SOD活性的提高有利于降低苜蓿自由基對細胞膜的損害以提高苜蓿的抗寒性，與本研究結果一致。前人研究結果表明［22-24］，POD活性對植物抗寒性具有積極作用。與馮昌軍等［24］研究結果部分相同，本研究相關性分析結果表明，苜蓿根頸POD活性與越冬率相關性不顯著，但POD 活性隨處理溫度的降低呈降低-升高-降低的變化趨勢，說明苜蓿根頸POD活性對低溫的響應是明顯的，當苜蓿受低溫脅迫強度較小時，苜蓿可以通過增強根頸POD活性來抵御，當脅迫溫度超過苜蓿耐寒極限時，苜蓿根頸POD活性迅速下降，并逐漸失去活性，造成苜蓿死亡。因此，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性對苜蓿的抗寒性具有正效作用，然而這種抗氧化酶保護機制是有限的，當低溫脅迫超過一定范圍時，苜蓿依然會受凍害而死亡。

3.2 苜蓿根頸可溶性蛋白含量對播期和低溫脅迫的響應

有研究表明，低溫脅迫下苜蓿根和根頸中可溶性蛋白含量增加［25-28］。杜永吉等［29］、KRASNUK等［14］研究表明，苜蓿根內可溶性蛋白含量會因低溫脅迫程度的增加而提高且達到差異顯著水平。崔國文［10］研究結果則與以上學者研究結果不同，在該研究中，苜蓿的抗寒能力強弱并不能與根頸中可溶性蛋白含量產生統計學聯系。本研究結果顯示，在-5～-25 ℃低溫處理間苜蓿根頸中可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢，表明苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量與苜蓿抗寒性相關，且在不同低溫處理下表現不同；本研究相關性分析結果亦支持此觀點，低溫脅迫下根頸中可溶性蛋白含量變化很大程度上影響著苜蓿越冬率，而苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量又與播期的推遲顯著負相關，即播種越晚則苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量越低；而可溶性蛋白含量與苜蓿越冬率的相關性極顯著。因此，筆者認為播種晚會造成苜蓿抵御低溫的能力減弱，同時，在苜蓿抵御低溫過程中，其根頸可溶性蛋白含量也具有重要作用。

4 結論

苜蓿根頸中抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量規律性變化對苜蓿的抗寒性具有正效作用。夏季早播（7月1日至7月15日）有利于苜蓿安全越冬，苜蓿可以通過提高根頸抗氧化酶活性來抵御低溫脅迫。