文冠果種子高表達(dá)XsKCS7 基因的克隆和酵母表達(dá)功能鑒定

梁重鈞，李麟坤，胡振華，張 薇，許慧慧，王利兵*

(1. 海南大學(xué) 林學(xué)院，海南 海口 570228；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；3. 開(kāi)魯縣林業(yè)和草原局，內(nèi)蒙古 通遼， 028400)

我國(guó)是世界油料主產(chǎn)國(guó)和最大進(jìn)口國(guó)，糧油安全與國(guó)家安全息息相關(guān)。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局（http://www.stats.gov.cn/）數(shù)據(jù)顯示，2022年我國(guó)油菜籽、芝麻、大豆、花生等油料總產(chǎn)量約3 653 萬(wàn)噸，而進(jìn)口食用油籽達(dá)到9 610 萬(wàn)噸，另外進(jìn)口食用油648 萬(wàn)噸。我國(guó)食用油對(duì)外依存度已達(dá)到70%，超過(guò)了國(guó)際安全警戒線[1]。因此，開(kāi)發(fā)和利用木本油料，提高我國(guó)食用油產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)滿足我國(guó)社會(huì)需求和降低食用油對(duì)外依存具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。我國(guó)油料樹(shù)種資源十分豐富，適用于食用的含油量40%以上的油料樹(shù)種約150 多種，但目前開(kāi)發(fā)利用程度較深的只有油茶（Camellia oleiferaAbel.）、核桃（Juglans regiaL.）、油橄欖（Olea europaeaL.）等10 余種。由此可見(jiàn)，有大量的木本油料資源有待發(fā)掘及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）又名黃角（Yellowhorn），為無(wú)患子科（Sapindaceae）文冠果屬木本油料，是《關(guān)于加快木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見(jiàn)》中明確提出的10 個(gè)木本油料樹(shù)種之一。文冠果種子油脂含量豐富，含油率達(dá)60%以上，其中不飽和脂肪酸含量高達(dá)92%，富含在植物中極為罕見(jiàn)的神經(jīng)酸（3%～7%）[2-4]。神經(jīng)酸（Nervonic acid，C24∶1Δ15，cis-tetracos-15-enoic acid），一種超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸，是大腦白質(zhì)神經(jīng)組織的主要組成部分，具有修復(fù)大腦受損神經(jīng)纖維的獨(dú)特生理功效[5-6]，1925 年在人類(lèi)和哺乳動(dòng)物大腦中首次發(fā)現(xiàn)，次年從鯊魚(yú)腦中提取，并確定了神經(jīng)酸的結(jié)構(gòu)，又名鯊魚(yú)酸[7-8]。人體難以合成神經(jīng)酸，遠(yuǎn)未達(dá)到人體健康推薦攝取量300 mg·(60 kg)-1[9]，必須從食物中攝取，鯊魚(yú)腦中富含神經(jīng)酸，所提取的神經(jīng)酸純度高達(dá)98%，市場(chǎng)價(jià)格約120 萬(wàn)元·kg-1，價(jià)格昂貴，國(guó)際社會(huì)也已禁止捕殺鯊魚(yú)；而神經(jīng)酸人工合成效率低，副產(chǎn)物多，同樣無(wú)法滿足人類(lèi)的需求。由此可知，油料種子神經(jīng)酸已成為獲取神經(jīng)酸的主要途徑[10]。目前，元寶楓和文冠果已生產(chǎn)出對(duì)應(yīng)的食用油，應(yīng)用于食品行業(yè)。文冠果具有抗逆性強(qiáng)、易存活、含油率高、童期短等特點(diǎn)，更易批量種植和規(guī)模化生產(chǎn)神經(jīng)酸。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)酸的生物合成通路已有報(bào)道[4,11-12]。脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)體中以乙酰輔酶A 為原料，合成終產(chǎn)物油酸（Oleic acid，C18∶1Δ9，cis-9-octadecenoic acid）；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白長(zhǎng)鏈酰基輔酶A 合成酶（LACS）將游離脂肪酸C18∶1 以C18∶1-CoA 的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；C18∶1-CoA 在脂肪酸延伸酶復(fù)合體的作用下經(jīng)過(guò)3 個(gè)重復(fù)延伸反應(yīng)依次生成輔酶A 形式的花生烯酸（cis-11-Eicosenoicacid，C20∶1Δ11）、芥酸（Erucic acid，C22∶1，cis-13-docosaenoic acid）和神經(jīng)酸（C24∶1）；最后以三酰甘油的形式儲(chǔ)存在植物種子和果實(shí)中。脂肪酸延伸酶復(fù)合體由4 個(gè)組分構(gòu)成，包括3-酮酯酰-CoA合酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）、3-酮酯酰-CoA還原酶（3-ketoacyl-CoA reductase，KCR）、3-羥酯酰-CoA 脫水酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrase，HCD） 和羥酯酰-CoA 還原酶（enoyl-CoA reductase，ECR）。其中KCS 為單體酶，具有底物特異性，是C18 以上超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)的限速酶；KCR、HCD 和ECR 為寡聚酶，是所有脂肪酸延長(zhǎng)反應(yīng)共有[13]。根據(jù)文冠果基因組KCS基因在染色體的位置分布[14]，本研究將KCS基因編號(hào)為XsKCS1～XsKCS20以便于描述。文冠果參考基因組和種子發(fā)育不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因在種子中的表達(dá)量較其他KCS基因最高，可能調(diào)控種子油超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，然而其具體的功能尚未解析[15]。本研究在此基礎(chǔ)上，克隆文冠果XsKCS7基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和生物酵母轉(zhuǎn)化功能鑒定。本研究初步鑒定了XsKCS7基因功能，為探索文冠果種子神經(jīng)酸的合成通路提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）特色抗旱栽培良種‘中石4 號(hào)’（國(guó)S-SV-XS-015-2020）五年以上穩(wěn)產(chǎn)實(shí)生苗生長(zhǎng)于遼寧省阜新市彰武縣（42°37′ N, 122°53′ E），種植區(qū)域年平均降水量為504 mm，年平均溫度為7 °C，最低溫度為-36 °C，最高溫度為38 °C（數(shù)據(jù)來(lái)源于全國(guó)天氣網(wǎng)），林間正常管理。用于本研究基因克隆所需的文冠果發(fā)育中期種子樣品采集于2022 年6 月，種子樣品經(jīng)純凈水沖洗后擦干，液氮速凍后保存于-80 °C 待用。用于酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)的生物酵母采用釀酒酵母菌株INVSc1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 文冠果KCS家族基因表達(dá)分析 下載Wang 等公開(kāi)的文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期種子（開(kāi)花后第40、54、68、81 d）轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)（SRA 編號(hào)：PRJNA493982），以本研究室文冠果基因組數(shù)據(jù)為參考基因組進(jìn)行聯(lián)合分析[16]，基因的表達(dá)水平根據(jù)FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 RNA 提取和cDNA 鏈合成 文冠果發(fā)育中期種子樣品RNA 的提取方法參照多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)，經(jīng)過(guò)降解酶RQ1 RNase-Free Dnase（Promega ，美國(guó)）降解殘留的基因組DNA 后，以1 μg RNA 為模板，利用GoScriptTM Reverse Transcription System（Promega，美國(guó)）試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.3 基因克隆和生物信息學(xué)分析 依據(jù)文冠果基因組XsKCS7基因參考序列，設(shè)計(jì)上游（5′-CTCTTCTTGTTTAGCTACCCTTT -3′）和下游（5′- ATCCTTTTTATTCCATTCTCTTT -3′）特異性引物；以采集的文冠果發(fā)育中期種子cDNA 為模板，利用kod 高保真擴(kuò)增酶（Toyobo，日本）擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)突變的XsKCS7連接至克隆載體pGEM?-T Easy 載體系統(tǒng)構(gòu)建（Promega，美國(guó)）并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α；再次測(cè)序驗(yàn)證序列后，將陽(yáng)性菌液保存于-80 °C。

多重序列比對(duì)通過(guò)軟件DNAMAN 7.0 中的clustal X 程序進(jìn)行；系統(tǒng)性進(jìn)化樹(shù)分析由軟件MEGA5.0 中的neighbor-joining 程序進(jìn)行。

1.2.4 生物酵母轉(zhuǎn)化與表達(dá) 限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ 酶切酵母表達(dá)載體pYES2.0，設(shè)計(jì)帶有同源臂的上游引物（5′-taagcttggtaccgagctcgATGGCT AATGAGAACAAAAA -3′）和下游引物序列（5′-gcggccgttactagtggatcTTAAATAACAATCGATGC AA -3′）擴(kuò)增XsKCS7，以同源重組法構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2.0-ProGAL1::XsKCS7，操作方法參照試劑盒SeamLess Assembly Cloning Kit（中美泰合，中國(guó)）；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1（Invitrogen, USA）菌株的轉(zhuǎn)化采用聚乙二醇/醋酸鋰（PEG/LiAc）誘導(dǎo)法[17]。

轉(zhuǎn)基因酵母在SD-U 液體培養(yǎng)基中震蕩至吸光值A(chǔ)600至0.4～0.5 后，加入總?cè)芤?/10 體積的20%半乳糖水溶液（m/v）激活酵母載體啟動(dòng)子GAL1表達(dá)XsKCS7，同時(shí)分別加入底物0.5 mmol·L-1花生烯酸C20∶1 芥酸C22∶1 以及不加底物（酵母提取物自身含有油酸C18∶1），20 °C培養(yǎng)4 d；培養(yǎng)物于3 500 g 離心10 min，收集酵母菌體，以真空冷凍干燥機(jī)在-40 °C 環(huán)境下干燥12 h 成粉末狀，-80 °C 保存用于脂肪酸含量和組分測(cè)定。

1.2.5 脂肪酸測(cè)定 酵母提取物脂肪酸提取采用硫酸甲醇酯化法[18]，提取的脂肪酸甲酯由乙酸乙酯溶解。吸取1.0 μL 乙酸乙酯用于GC 檢測(cè)，檢測(cè)儀器使用氣相色譜儀，柱子使用強(qiáng)極性氣相色譜柱DB-23。GC 檢測(cè)設(shè)置條件為：170 ℃，5 min；2 ℃·min-1到210 ℃；柱箱210 ℃；壓力163.8 kpa；總流量48.3 mL·min-1；柱流量4.2 mL·min-1；分流比10.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果KCS 家族基因表達(dá)分析

SapBase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.sapindaceae.com/）公開(kāi)了由本研究室測(cè)序獲得的文冠果基因組數(shù)據(jù)，共注釋KCS基因20 個(gè)[14,16]，根據(jù)這些基因在染色體的位置分布，編號(hào)為XsKCS1～XsKCS20（圖1）。基于參考基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析得到文冠果KCS基因家族在高油文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。結(jié)果如圖2 所示，XsKCS5、XsKCS6、XsKCS19及XsKCS20在文冠果種子各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量均為0，不參與基因表達(dá)熱圖繪制；XsKCS7基因在種子中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他KCS基因，表明XsKCS7基因可能調(diào)控文冠果種子油超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成功能。

圖1 KCS 基因在文冠果染色體中的位置Fig. 1 The position of KCS genes in the chromosome of Xanthoceras sorbifolium

圖2 XsKCS 基因在文冠果不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)量Fig. 2 Expression of XsKCS genes in seeds of Xanthoceras sorbifolium at different developmental stages

2.2 XsKCS7 基因的克隆

將采集的文冠果發(fā)育中期種子用液氮研磨后，使用RNA 提取試劑盒抽提種子RNA，經(jīng)電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RNA 具有清晰的28S 和18S 條帶（圖3A），同時(shí)Agilent 2100 Bioanalyzer 分析儀檢測(cè)RIN（RNA integrity number）值大于7.0，表明RNA完整性較好；分光光度計(jì)測(cè)量其OD260/OD280值在1.95～2.05 之間，表明RNA 純度高。

圖3 RNA 電泳圖（A）；XsKCS7 基因擴(kuò)增電泳圖（B）Fig. 3 Electrophoresis of RNA(A) and electrophoresis of the amplification of XsKCS7 gene(B)

以種子cDNA 為模板，依據(jù)文冠果基因組XsKCS7基因參考序列設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增，連接至克隆載體后使用通用引物T7/SP6 擴(kuò)增并測(cè)序，最終獲得包括XsKCS7基因CDS 區(qū)的1 512 bp 序列，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度包括克隆載體骨架共1 681 bp（圖3B）。

2.3 XsKCS7 蛋白序列分析

通過(guò)軟件DNAMAN5.0 將文冠果XsKCS7 蛋白、梣葉槭（Acer negundoL.）AnKCS（NCBI注冊(cè)號(hào)：KAI9194759.1；下同）、橡膠[Hevea brasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.]HbKCS11（XP_021653194.1）、石榴（Punica granatumL. ）PgKCS11 （XP_031382877.1 ）、木薯（Manihot esculentaCrantz ）MeKCS20（XP_021595702.1 ） 和白時(shí)鐘花（Turnera subulataSmith）TsKCS11（KAJ4840348.1）蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果如圖4 所示，文冠果XsKCS7 蛋白與其他植物KCS 基因具有相似的保守基序（紅框標(biāo)出）。

圖4 KCS 蛋白多重序列比對(duì)Fig. 4 Multiple sequence alignment of KCS protein

采用軟件MEGA5.0 neighbor-joining 程序?qū)sKCS7 蛋白與其他物種KCS 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)性分析，參與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的物種包括：蓖麻（Ricinus communisL. ）RcKCS6 （XP_0025 10886.3）、大豆[Glycine max(L.) Merr.]GmKCS5（XP_003555356.2）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napusL.）BnKCS6（LOC106410639）、花生（Arachis hypogaeaLinn.）AhKCS5（XP_02562 0215.1）、苦楝（Melia azedarachL.）MaKCS（KAJ4706144.1）、簸箕柳（Salix suchowensisW. C. Cheng in S. Y. Jin）SsKCS（KAG523 0593.1） 、 山 核 桃[Carya illinoinensis(Wangenh.) K. Koch]CiKCS5（XM_043119331.1）、蒜頭果（Malania oleiferaChun & S. K. Lee）MoKCS（MK210592.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtKCS10（NP_180193.1）、桃[Prunus persica(L.) Batsch]PpKCS5（XP_020411733.1）、梣葉槭AnKCS（KAI9162263.1）、漾濞槭（Acer yangbienseY. S. Chen & Q. E. Yang）AyKCS（TXG70798.1）、薔薇（Rosa chinensisJacq.）RsKCS6（XP_024164718.1 ）、 巴西橡膠樹(shù)HbKCS11（XM_021797502.1）、阿月渾子（Pistacia veraL.）PvKCS20（XM_031416789.1）。結(jié)果如圖5 所示，XsKCS7 蛋白與其他物種KCS 蛋白親緣性關(guān)系較近，其中與橡膠樹(shù)親緣關(guān)系最近，為67.62%。

圖5 KCS 蛋白系統(tǒng)性進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of KCS protein

2.4 轉(zhuǎn)基因酵母鑒定XsKCS7 基因功能

將重組質(zhì)粒pYES2.0-ProGAL1::XsKCS7（簡(jiǎn)寫(xiě)為pYES2.0-XsKCS7）和對(duì)照空載體pYES2.0轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVSc1。釀酒酵母本身不具有超長(zhǎng)鏈延長(zhǎng)酶活性，pYES2.0 對(duì)照組中未檢測(cè)到花生烯酸（C20∶1）、芥酸（C22∶1）以及神經(jīng)酸（C24∶1）。與pYES2.0 對(duì)照組相比，pYES2.0-XsKCS7 轉(zhuǎn)基因酵母提取物未檢測(cè)到其他脂肪酸（圖6A1、B1）；與pYES2.0 + C20∶1 對(duì)照組相比，pYES2.0-XsKCS7 轉(zhuǎn)基因酵母提取物中檢測(cè)到了芥酸和微量的神經(jīng)酸（圖6A2、B2）；與pYES2.0 + C22∶1 對(duì)照組相比，pYES2.0-XsKCS7轉(zhuǎn)基因酵母提取物中檢測(cè)到神經(jīng)酸（圖6A3、B3）。上述結(jié)果表明XsKCS7基因具有催化花生烯酸生成芥酸和催化芥酸生成神經(jīng)酸的功能，但不具備油酸生成花生烯酸的功能。

圖6 酵母細(xì)胞提取物脂肪酸甲酯GC-MS 峰圖Fig. 6 GC-MS analysis for FA components in yeast cells

3 討論

文冠果是一種罕見(jiàn)的種子中富含神經(jīng)酸的經(jīng)濟(jì)油料樹(shù)種，而神經(jīng)酸具有潛在的藥用保健效用[5]，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。3-酮酯酰-CoA 合酶基因（KCS）是調(diào)控超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的限速酶基因，已在蒜頭果[19]、銀扇草（Lunaria annuaL.）[20]、碎米薺（Cardamine graecaL.）[21]等物種中克隆并鑒定其具有調(diào)控神經(jīng)酸合成的功能，然而在文冠果中尚未解析。

本研究以文冠果基因組為參考基因組，重新分析文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因在種子的表達(dá)量明顯高于其他KCS基因。通過(guò)PCR 法擴(kuò)增得到XsKCS7基因序列，編碼503 個(gè)氨基酸；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，XsKCS7蛋白序列與其他物種KCS 蛋白序列均具有KCS 家族保守基序“GMGCSA”、“FGNTSSSS”以及“GSGFKCNSAVW”[22]；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明XsKCS7 與其他物種KCS 蛋白親緣性關(guān)系較近，與橡膠樹(shù)最近（圖5）。以上結(jié)果表明克隆的XsKCS7基因具有潛在的3-酮酯酰-CoA 合酶功能，然而其具體的功能還需進(jìn)一步研究。

真核釀酒酵母表達(dá)是適合研究具有單一催化功能蛋白的異源表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)已被許多研究用于鑒定KCS 酶的功能。例如，在釀酒酵母菌株INVSc1 中異源表達(dá)毛果楊（Populus trichocarpaL.）PtKCS1和PtKCS2，發(fā)現(xiàn)PtKCS1底物偏好為單不飽和脂肪酸，而PtKCS2偏好為多不飽和脂肪酸[23]；銀扇草和碎米薺KCS也通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)鑒定其具有以花生烯酸（C20∶1）為底物，生成神經(jīng)酸的功能[20-21]。本研究同樣使用釀酒酵母菌株INVSc1 表達(dá)系統(tǒng)，分別以油酸（C18∶1）、花生烯酸、芥酸（C22∶1）為底物異源表達(dá)文冠果XsKCS7基因，發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因具有調(diào)控花生烯酸生成芥酸和催化芥酸生成神經(jīng)酸的功能。以上結(jié)果表明不同物種KCS基因具有明顯的底物特異性調(diào)控功能，而至今為止已被功能鑒定的KCS基因較少，應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其功能的準(zhǔn)確性較差，由此可見(jiàn)，單一KCS基因的功能研究極為必要。本研究通過(guò)酵母異源表達(dá)系統(tǒng)鑒定XsKCS7基因具有調(diào)控芥酸和神經(jīng)酸的合成的功能，同時(shí)前期研究表明XsKCS7基因在文冠果種子發(fā)育期高表達(dá)，由此可見(jiàn)，XsKCS7基因是調(diào)控文冠果種子油超長(zhǎng)鏈脂肪酸芥酸和神經(jīng)酸合成的關(guān)鍵基因，為解析文冠果神經(jīng)酸合成通路提供了扎實(shí)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

依據(jù)KCS基因在文冠果基因組染色體中的位置分布將20 個(gè)KCS基因編號(hào)為XsKCS1～XsKCS20。以本研究室測(cè)序得到的文冠果基因組為參考基因組，重新分析文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRA 編號(hào)：PRJNA493982），發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因在種子中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他KCS基因。本研究克隆了文冠果XsKCS7基因，生物信息學(xué)分析其具有潛在的3-酮酯酰-CoA 合酶功能，在釀酒酵母異源表達(dá)XsKCS7基因鑒定其具有調(diào)控芥酸和神經(jīng)酸的合成功能。綜上所述，XsKCS7基因是調(diào)控文冠果種子芥酸和神經(jīng)酸合成的關(guān)鍵基因。